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•论 著•水动力辅助吸取成人脂肪来源干细胞的体外分离、培养和鉴定研究陈 阳1, 宋良萍2，察鹏飞1，彭 铮1，何 宇1（1.福州市皮肤病防治院整形美容外科 福建 福州 350025；2.福建国际旅行卫生保健中心 福建 福州 350001）[摘要]目的：探索成人脂肪来源干细胞的体外分离、培养和鉴定的可行方法，为其广泛应用研究提供实验依据。
方法：采用Body-jet水动力辅助吸脂系统自成人下腹部皮下脂肪丰厚区抽吸获取颗粒脂肪100ml，酶消化法分离、培养干细胞，倒置显微镜下观察细胞形态并绘制细胞生长曲线，计算细胞群体倍增时间。
以第2代细胞进行免疫组织化学染色，鉴定其表面分子CD44表达。
取3代细胞用含10%胎牛血清、1%青链霉素原液、1µmol/L地塞米松、l0µmol/L胰岛素、0.5mmol/L IBMX的高糖DMEM培养基中成脂诱导培养1周，观察细胞形态变化。
2周后再进行成脂、成骨、成软骨、成肌诱导分化培养与鉴定。
结果：成人脂肪组织中含有大量间充质干细胞，呈成纤维细胞样贴壁生长，细胞群体倍增时间约为60h；免疫组织化学染色鉴定CD44阳性；油红O染色、碱性磷酸酶染色、Ⅱ型胶原染色、肌浆球蛋白染色均呈阳性。
结论：初步建立了一种自成人脂肪组织中分离、培养和鉴定脂肪来源干细胞的便捷方法，为其能够作为组织工程理想的种子细胞和广泛应用于临床提供了实验依据。
[关键词]水动力辅助吸脂；脂肪来源干细胞；分离；培养；鉴定[中图分类号]R318.12 [文献标志码]A [文章编号]1008-6455（2018）01-0077-04Study on Isolation, Cultivation and Identification of the Adipose-derived Stem Cellsfrom Liposuction with Body-jet SystemCHEN Yang 1,SONG Liang-ping 2,CHA Peng-fei 1,PENG Zheng 1,HE Yu 1(1.Department of Plastic and Aesthetic Surgery,Fuzhou Dermatosis Prevention and Treatment Hospital,Fuzhou350025,Fujian,China;2.Fujian International Travel Health care Center,Fuzhou 350001,Fujian,China)Abstract: Objective To explore a feasible method which can be used to isolate, culture and identify the adipose-derived stem cells from human adipose tissue in vitro in order to provide experimental basis for its extensive application. Methods 100ml fat was obtained from subcutaneous fat rich region of lower abdomen with Body-jet system. The stem cells were isolated and cultured by enzyme digestion. They were observed under inverted microscope each day and the cell growth curve and double time were taken. The second generation cells were stained immunohistochemically and identified by the surface molecule CD44. The third generation cells were cultured inductively into adipose by DMEM medium supplemented with 10% fetal bovine serum, 1% ABAM, 1µmol/L dexamethasone, 10µmol/L insulin and 0.5mmol/L IBMX for one week and the cell morphologic change was observed. 2 weeks later, they were induced to differentiate into adipose, bone, cartilage and muscle and were identified as stem cells then. Results There was a large amount of mesenchymal stem cells in human adipose tissue. They grew attaching to the culture flask as fibroblasts. Their double time was about 60 hours. Immunohistochemical staining showed that most of the cultured cells were CD44 positive and presenting positive reaction by staining with oil red O, alkaline phosphatase, type Ⅱ collagen and sarcoplasmic globulin. Conclusion A simple and convenient method to isolate, culture and identify the adipose-derived stem cells (ADSCs) from human liposuction was successfully established, providing the experimental basis on the extensive application for ADSCs as ideal seed cells in tissue engineering and clinic.Key words: Body-jet liposuction system; adipose-derived stem cells; isolation; culture; identification基金项目：福建省自然科学基金资助项目(项目名称：脂肪来源间充质干细胞治疗慢性皮肤溃疡应用研究，编号：2104J01390，计划文号：闽科技 [2014]20号)；福州市科技计划项目（项目名称：脂肪来源干细胞构建皮肤复合组织的实验研究，编号：2013-S-128-1，计划文号：榕科 [2013]121号）；福州市卫生计生科技计划项目 (项目名称：PRP联合脂肪来源干细胞治疗慢性皮肤溃疡研究，计划类别：创新团队培育项 目，计划文号：医学类31017）通信作者：陈阳，福州市皮肤病防治院整形美容外科主任，主任医师，教授,博士、博士后、博士生导师；主要研究方向：脂肪来源干细胞构建工程 化脂肪组织研究等；E-mail:cyfuzhou2008@间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是机体中一小部分具有扩增和多向分化能力的非造血基质细胞，属于成体干细胞的一种，可以通过诱导向特定的细胞系进行分化，并最终达到构建特定组织的目的，由于其体外高增殖率及多向分化潜能，已成为组织工程研究中种子细胞的重要来源[1-2]。
鼠脂肪干细胞的分离、培养和鉴定朱灿红;张旦红;陈正荣;王美娟;张亚【期刊名称】《交通医学》【年(卷),期】2016(030)001【摘要】Objective:To investigate the method of isolation, culture and identification of ADSCs, so as to provide a reliable source of cells for tissue engineering, cell therapy and gene therapy. Methods: ADSCs were isolated and purified from adipose tissues of mice by repeated adherence, and their shapes were observed. Growth curve was studied by using MTT method. Cells surface markers were identified through flow cytometry; ADSCs were induced by different inducing me-dia to test their differentiation potentials. Results: On the second day ADSCs were a small population of polygonal, trian-gle-shaped cells and most population of spindle shaped cells, On the fifth day, cells grew in colonies and were of fibrob-last-like morphology. On the tenth day, cells were homogenously of spindle-shaped appearance and were circinately ar-ranged. The shape of the passaged cells was similar with that of the primary cells;The growth curve of ADSCs appeared a s a typical ‘S-shaped curve’. 96.6% of the cells were positive for CD90 and 85.3% for CD44.Only 0.5% of the cells were positive for CD45 and CD11b. Oil droplets of induced ADSCs became red by Oil Red-O staining test;It appeared as black particles within the cells by modified Gomori staining and a black mineralized nodule within thecells by Von kossa stain-ing; Cartilage nodule like structures were blue by Alcian blue staining. Conclusions: ADSCs were isolated from adipose tissue by using repeated adherence method in mice, they were accorded with all the characteristics of stem cells, which provided a rich source of stem cells for the clinical application of stem cells.%目的：研究脂肪干细胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）的分离、培养和鉴定的方法，为组织工程、细胞疗法、基因疗法提供可靠的细胞来源。
脂肪干细胞是一种多能干细胞，存在于脂肪组织中，具有较强的自我更新和分化能力，因此在再生医学领域具有广阔的应用前景。
脂肪干细胞的培养方法是进行研究和应用的基础，其中组织块培养法是一种常用的培养方法，其流程和步骤需要严谨操作和控制，以获得高质量的脂肪干细胞。
一、脂肪组织的获得脂肪干细胞的来源是脂肪组织，脂肪组织的获得需要经过以下步骤：1. 临床患者手术采集：通过手术方式从患者身体的特定位置（如腹部、臀部等）采集脂肪组织。
2. 动物实验材料采集：通过特定的实验动物模型，在实验室条件下从动物体内获取脂肪组织。
脂肪组织的来源直接关系到后续脂肪干细胞的培养和应用性能，因此需要严格控制采集过程和条件，确保获得的脂肪组织质量和干细胞丰度。
二、脂肪组织处理和组织块制备1. 脂肪组织的去除杂质：将采集的脂肪组织在无菌条件下进行处理，去除多余的结缔组织、血管和表皮层，以获得纯净的脂肪组织。
2. 组织块的制备：将经过处理的脂肪组织切割成适当大小的块状（约1mm³），以便后续细胞的释放和培养。
三、脂肪干细胞的释放和培养1. 组织块的酶解：将制备好的组织块放入消化酶（如胰蛋白酶）的消化液中，在37℃的恒温培养箱内进行酶解，使脂肪干细胞从组织块中释放出来。
2. 细胞的培养和传代：将释放出的脂肪干细胞进行原代培养和传代培养，培养基的配方和培养条件需要进行严格控制和优化，以保证脂肪干细胞的生长和分化。
通过以上步骤和方法，我们可以获得高质量的脂肪干细胞，为其后续在再生医学、组织工程和临床治疗中的应用打下坚实基础。
在实际应用中，还需要结合特定的研究和临床需求，对脂肪干细胞进行进一步的分化和功能评价，以实现其在不同领域的应用和开发。
脂肪干细胞的培养方法对于再生医学和组织工程具有重要意义，通过持续的研究和优化，必将为人类健康事业带来更多的机遇和挑战。
希望本文对脂肪干细胞组织块培养方法的介绍，能够为相关研究和应用人员提供一定的参考和指导，共同推动脂肪干细胞领域的进步与发展。
人脂肪干细胞的生物学特性及分化研究人脂肪干细胞（adipose-derived stem cells, ADSCs）是一类存在于脂肪组织中的成体干细胞，具有多能性分化潜能，可以向多种细胞类型分化，包括成骨细胞、软骨细胞、肌肉细胞、脂肪细胞等，因此被广泛应用于再生医学和临床治疗。
本文将从人脂肪干细胞的来源、生物学特性、分化研究及应用前景等方面进行阐述。
一、来源人脂肪干细胞来源于脂肪组织，脂肪组织是成体中最富含干细胞的组织之一。
脂肪组织来源方便，易获取，可以通过抽脂手术等方式获得大量的脂肪组织，在此基础上分离出人脂肪干细胞。
人脂肪干细胞的来源广泛，不同部位的脂肪组织中的干细胞数量和分化潜能有所不同，一般来说，腹部和臀部等部位的脂肪组织中的干细胞数量较多，具有较强的再生潜能。
二、生物学特性人脂肪干细胞具有多能性分化潜能和自我更新能力。
人脂肪干细胞具有多能性分化潜能，可以向成骨细胞、软骨细胞、肌肉细胞、脂肪细胞等多种细胞类型分化，这使得人脂肪干细胞在再生医学领域备受关注。
人脂肪干细胞具有自我更新能力，可以不断分裂并产生新的干细胞，保持其数量和功能不变。
人脂肪干细胞还具有多种分泌因子和细胞外基质，可以修复和再生受损组织，具有抗炎、抗纤维化和抗氧化等多种生物学功能，对组织修复和再生具有重要作用。
三、分化研究近年来，人脂肪干细胞的分化研究取得了重要进展。
研究表明，通过适当的培养条件和生物学因素的调控，可以诱导人脂肪干细胞向特定的细胞类型分化。
通过添加特定的生长因子和细胞外基质，可以诱导人脂肪干细胞向成骨细胞分化，并形成成骨组织。
还可以诱导人脂肪干细胞向软骨细胞、肌肉细胞等多种细胞类型分化，从而为组织修复和再生提供了新的途径。
一些研究表明，通过基因编辑和基因调控技术，可以调控人脂肪干细胞的分化潜能和分化方向，使其更加适合特定的组织修复和再生需求。
这为人脂肪干细胞的临床应用提供了新的思路和手段。
四、应用前景人脂肪干细胞还可以作为药物筛选和药物研发的重要工具，通过模拟疾病模型、评价药物毒性和药效，加速新药的研发过程。
人体脂肪干细胞培养及成骨诱导分化人体脂肪干细胞培养及成骨诱导分化引言干细胞是一类具有自我更新和多能性的细胞，可以不断分化生成各种不同类型的细胞。
人体脂肪组织中存在一种特殊类型的干细胞，即人体脂肪干细胞（human adipose-derived stem cells，hADSCs）。
与其他干细胞相比，hADSCs具有较高的抽取和培养效率，而且可以从自身脂肪组织中获得，不需要侵入性手术。
因此，hADSCs成为研究人体再生医学和组织工程领域的热门课题之一。
本文将介绍人体脂肪干细胞的培养方法以及成骨诱导分化的研究进展。
人体脂肪干细胞培养1. 来源和提取人体脂肪组织富含脂肪干细胞，因此从脂肪组织中提取hADSCs是最常用的方式之一。
提取过程通常通过脂肪抽吸或手术操作完成。
在脂肪抽吸中，通过低压吸引脂肪组织，并用特殊工具将其收集。
手术操作则需要进行小切口，直接收集脂肪组织。
提取得到的脂肪组织需要经过一系列处理，如洗涤、消化、离心等，以获得单个细胞悬浮液。
2. 培养条件提取得到的hADSCs需要在适宜的培养条件下进行扩增。
通常，使用营养丰富的培养基，如DMEM/F12，加入适量的胎牛血清和抗生素，以提供必需的生长因子和营养物质。
细胞培养的环境需要保持在37℃，5% CO2的恒温恒湿条件下。
培养过程中，需要定期更换培养基以保持细胞的生长和代谢活性。
3. 鉴定和鉴定为了确认提取得到的细胞为hADSCs，需要进行鉴定和鉴定。
常用的方法包括油红O染色、免疫细胞化学染色和流式细胞术分析。
油红O染色可用于检测细胞中脂滴的积累情况，免疫细胞化学染色可检测特定表面标记物的表达水平，流式细胞术则可对细胞表型进行全面的分析。
人体脂肪干细胞成骨诱导分化人体脂肪干细胞具有向多个细胞系分化的潜力，其中包括成骨细胞。
为了将hADSCs诱导分化为成骨细胞，需要在体外提供特定的诱导因子。
1. 前处理在进行成骨诱导前，需要对hADSCs进行适当的前处理。
脂肪干细胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）是近年来从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的干细胞。
Zuk等[1]从吸脂术抽取的脂肪组织悬液中最先分离培养出多向分化潜能的干细胞。
研究发现，ADSCs能够在体外稳定增殖且衰亡率低，同时它具有取材容易、少量组织即可获取大量干细胞、适宜大规模培养、对机体损伤小等优点，而且其来源广泛，体内储备量大，适宜自体移植，逐渐成为近年来新的研究热点之一。
人ADSCs主要来源于吸脂术得到的脂肪组织，随着整形美容业的迅猛发展，重睑手术所得的眶隔脂肪组织也随之增多，给ADSCs的取材提供了新的路径。
本研究主要探讨人上睑眶隔脂肪来源的脂肪提取ADSCs的可行性。
1材料与方法1.1脂肪组织来源本研究所用脂肪组织来自于潍坊医学院整形外科医院重睑手术者，均为女性，年龄18~30岁。
1.2主要试剂磷酸盐缓冲液（PBS）、胎牛血清（FBS）、DMEM培养基（Gibco公司，美国），Ⅰ型胶原酶、胰蛋白酶（Hyclone公司）等。
1.3ADSCs的分离培养及传代将取出的脂肪组织放于无菌盘中，用PBS冲洗3遍，然后用无菌眼科剪刀剔除血管、筋膜等组织，再用PBS冲洗3遍。
把修剪好的脂肪组织放入盛有高糖DMEM（无血清）的无菌培养皿中，用眼科剪刀将脂肪剪成糊状，置于离心管中。
室温下离心（1200r/min）10min。
离心后可见离心管中液体分层：上层为白色泡沫，中层为清液，下层为黄色脂肪。
吸取上、中层丢弃。
加入3~5倍体积的0.1％Ⅰ型胶原酶和胰酶混合液（1∶1），将沉积于离心管底部的脂肪组织振荡打散，拧紧离心管后，用封口膜包裹，放入37℃恒温摇床中振荡（190r/min）消化30min。
将离心管自摇床中取出，肉眼观察可见无明显脂肪颗粒、白色泡沫贴壁，将液体用200目筛网过滤，滤液离心（1200r/ min）10min。
弃上清液，用PBS冲洗3遍，加入含有10％FBS的高糖DMEM培养基，轻轻吹打成细胞悬液，用细胞计数板计数，调整细胞密度1.0×105mL-1接种于培养瓶中，在5%CO2、37℃标准环境下培养。
48h后首次换液，去除未贴壁细胞，此后每3天换液1次，待细胞融合80％~90％时进行下一次传代。
在传代过程中采用差速贴壁法纯化ADSCs，即加入胰蛋白酶和乙二胺四乙酸（EDTA）消化液，经吹打、离心后，以细胞密度1.0×105mL-1接种在培养瓶内，置于孵箱内培养，4h后弃掉培养皿内DMEM培养基，细胞换液1次，继续在37℃、5%CO2条件下培养。
1.4ADSCs的鉴定1.4.1细胞形态观察（HE染色）取第3代细胞，以细胞密度5.0×104mL-1接种于12孔细胞培养板上，用细胞爬片法使细胞生长到盖玻片上，培养一段时间，待细胞长满盖玻片，取出，用PBS冲洗3次，将长有细胞的盖玻片放入95%乙醇中固定15min；PBS冲洗2次，每次1min；浸入到苏木紫中染色5~10min；用自来水冲洗干净，浸入到稀盐酸乙醇溶液中进行分色，数秒钟即可；再用自来水浸洗，然后侵入到淡氨水中，使细胞核蓝化3~5min；自来水冲洗，浸入伊红染液中染色3~5min；自来水冲洗，然后经70%、80%、90%乙醇脱水各1次，95%乙醇2次和100%乙醇3次逐级脱水，各1min；二甲苯透明3次，每次1min。
然后用中性树胶封人上睑眶隔脂肪来源的脂肪干细胞的分离培养及鉴定范开防，王国栋，刘兴龙，杨彪炳（潍坊医学院整形外科研究所，山东潍坊261041）【摘要】目的探讨人上睑眶隔来源的脂肪提取脂肪干细胞（ADSCs）的可行性，并进行分离、培养及鉴定。
方法取健康成年人上睑眶隔脂肪组织，用胰酶进行消化后收集细胞接种于培养瓶内，采用差速贴壁法纯化细胞。
用HE染色、免疫荧光进行细胞鉴定，并进行成脂、成软骨诱导。
结果HE染色显示细胞形态为长梭形，呈漩涡状生长。
免疫荧光鉴定结果显示细胞表面抗原CD44、CD29阳性表达，CD106、CD34阴性表达，说明分离培养的细胞是脂肪干细胞。
成脂、成骨诱导实验证明所得细胞有多向分化的能力。
结论可以从人上睑眶隔脂肪组织提取出ADSCs，并有多向分化能力，为今后ADSCs的取材提供了新的路径。
【关键词】干细胞；脂细胞；脂肪组织；眼睑；细胞，培养的；分离；鉴定文章编号：1009-5519（2012）19-2881-02中图法分类号：R457.7文献标识码：AIsolation culture and identification of adipose-derived stem cells separated from upper eyelid orbit septum fat of human beings Fan Kaifang，Wang Guodong，Liu Xinglong，Yang Biaobing（Plastic Surgery Research Institute,Weifang Medical College，Weifang，Shandong261041，China）【Abstract】Objective To investigate the feasibility of extracting adipose-derived stem cells（ADSCs）from the human upper eyelid orbital fat tissue and to perform the isolation，culture and identification.Methods The upper eyelid orbital fat tis-sues of healthy adults were collected.After digestion by trypsin，the collected cells were seeded in culture flask and purified by differential adherence method.These cells were identified by HE staining and immunofluorescence，and performed the adipose and cartilage induction.Results These cells were long fusiform shape and swirling growth by HE staining.The immunofluores-cence showed that these cells were positive for CD44and CD29and negative for CD106and CD34.Adipogenic and cartilage in-duction experiments indicated that these cells were capable of multilineage differentiation.Conclusion It is feasible that ex-tracting ADSCs from the human upper eyelid or bital fat tissue and ADSCs have the multipotent differentiation ability，which provides a new approach to obtain ADSCs in the future.【Key words】Stem cells；Adipocytes；Adipose tissue；Eyelids；Cells，cultured；Isolation；Identification基金项目：山东省高等学校科技计划资助项目（J09LF20）。
通讯作者：杨彪炳（E-mail：Ybiaobing@）。
片，在电子显微镜下观察并拍照。
1.4.2MTT 生长曲线测定取第3代细胞，待细胞长至80%~90%融合后，用胰蛋白酶消化制成细胞悬液，调整细胞密度2.5×104mL -1接种到96孔培养板中。
每组设5个复孔，1个空白对照孔，共接种8块培养板。
每天取1块培养板在酶联免疫检测仪OD 490nm 处测量各孔的吸光值。
以时间为横坐标、吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。
1.4.3免疫荧光染色采用常规免疫荧光法进行ADSCs 表面标志鉴定，取第3代细胞进行爬片，以细胞密度2.0×104mL -1接种于24孔板中，每孔加入500μL DMEM 培养基，置于37.0℃、5%CO 2培养箱内培养，待细胞60%~70%融合后进行细胞鉴定。
取4孔细胞，弃去DMEM 培养基后用PBS 冲洗3遍，用滤纸吸干细胞表面液体。
然后加入4%多聚甲醛500μL 固定10min ，再用PBS 冲洗3遍。
加入山羊血清封闭液室温孵育30min ，弃封闭液，滤纸吸干细胞表面液体。
分别向4孔内滴入一抗CD29、CD44、CD34及CD106兔抗人多克隆抗体300μL （1∶100），4℃孵育过夜（14~16h ）。
第2天弃一抗，PBS 冲洗3遍，每孔加入山羊抗兔异硫氰酸荧光素（FITC ）标记的二抗300μL （1∶200），室温避光孵育2h ，弃二抗，PBS 冲洗3遍，每次15min ，甘油封片，在荧光显微镜下观察并拍照。
1.4.4成脂、成骨诱导实验（1）向脂肪细胞诱导分化：取第3代细胞接种于12孔培养板中，第2天弃DMEM 培养基，换含有胰岛素10mg/L 、吲哚美辛0.2mmol/L 、伊菠丁基甲基黄嘌呤（IBMX ）0.5mmol/L 、地塞米松1μmol/L 的DMEM 诱导液诱导培养1周左右，用油红O 染色鉴定。
（2）向成骨细胞诱导分化：取第3代细胞接种于12孔培养板中，第2天弃DMEM 培养基，换含有维生素C50μmol/L 、β磷酸甘油钠10mmol/L 、地塞米松10μmol/L 的DMEM 诱导液诱导培养，每3天换1次液，3周后行茜素红染色。
2结果2.1ADSCs 形态学观察倒置显微镜下观察经消化后搜集到的原代细胞起初为透亮的小圆形，4h 后开始贴壁，贴壁后的细胞逐渐伸展开，体积也随之增大，多为短梭形或小多角形，24h 后存活细胞基本贴壁。
4d 左右可见细胞开始分裂增殖，随着时间的延长细胞逐渐伸展成长梭形外观。
7d 左右细胞铺满瓶底，呈鱼群样或螺旋状生长（图1）。
经传代后，细胞形态均匀，以长梭形为主。
核居中，多数为1个核仁，也有少数双核，核呈圆形或椭圆形。
随着传代次数的增加及用差速贴壁法进行细胞纯化，混杂生长的细胞逐渐减少，传至第3代细胞时能得到较纯的ADSCs 。
