脂肪干细胞-是一种从脂肪组织中分离提取出的能够贴壁生长

胎盘间充质干细胞的分离，原代与继代培养及鉴定刘亭2016.7。

21目录前言 (2)1分离制备PMSC组织的选取 (4)2脐带，胎盘MSC的分离与纯化 (6)2.1胎盘组织的获取，存储与清洗 (6)2-2 脐带，胎盘MSC的分离及纯化方法 (7)3 原代培养和继代培养 (11)3—1培养基 (11)3-2培养密度 (12)3-3培养条件 (13)3—4换液 (13)3—5 传代培养 (13)3—6细胞形态与生长速度 (14)3—7 MSC的冻存与复苏： (14)4细胞表面抗原检测 (14)5生长曲线 (15)6细胞周期 (15)7分化潜能 (15)参考文献 (15)附件1不同实验室从脐带血,脐带和胎盘等各组织中分离MSC的方法.. 16脐带血 (16)脐带 (17)羊膜 (19)绒毛膜 (19)蜕膜层 (20)胎盘 (21)整体灌注法 (22)附件2 背景知识 (22)附件3 PMSC实验所需试剂 (23)前言干细胞（Stem cell，SC）是一种能够自我更新且未分化并可分化成两个或两个以上其它品系的细胞。

在一定的条件下，干细胞能够分化成为多种成熟细胞类型。

按照来源和分化潜能不同，干细胞可分为胚胎干细胞（Embryonic stem cell，ESC）和成体干细胞(Adult stem cell，ASC）两类。

胚胎干细胞来源于早期的胚泡和胚胎内层的细胞群，并且具有向3个胚层细胞分化的能力.但是胚胎干细胞应用时产生的免疫排斥、体内实验中引发肿瘤生成以及所涉及的伦理问题等影响并制约了临床应用。

成体干细胞形成于原肠胚形成后的胎儿和成体组织,早期研究认为，成体干细胞主要分化为其来源组织的细胞类型。

然而，近几年来的很多研究表明，成体干细胞具有能够分化成为除来源以外的其他胚层组织的能力。

间充质干细胞(Mesenchymal stem cell， MSC）又称为基质干细胞，是属于成体干细胞的一种，最早从骨髓中分离而来。

骨髓间充质干细胞研究与应用概况于雷;高俊玲【摘要】骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal cells,BMSCs)是当下热点研究对象之一。

1867年德国病理学家Cohnheim教授[1]在研究创口愈合过程中发现骨髓中存在一种非造血系统的多潜能细胞,但研究因为条件原因未能深入。

后来有研究者[2]在20世纪60年代开展一系列开创性研究,发现从骨髓中分离得到长梭状、成纤维细胞样的细胞群,在塑料培养皿中呈集落样贴壁生长;1987年,又发现这种骨髓单核细胞可在一定的条件下分化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞和成肌细胞。

培养增殖二十代后仍保有其多向分化的潜能。

于是把这种多能细胞称为间充质干细胞(mesenchyma stem cell,MSC)。

【期刊名称】《华北理工大学学报：医学版》【年(卷),期】2018(020)002【总页数】5页(P164-168)【关键词】骨髓间充质干细胞;肺纤维化;缺血性脑卒中【作者】于雷;高俊玲【作者单位】[1]华北理工大学基础医学院,河北唐山063000;[1]华北理工大学基础医学院,河北唐山063000;【正文语种】中文【中图分类】R329.2骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal cells，BMSCs)是当下热点研究对象之一。

1867年德国病理学家Cohnheim教授[1]在研究创口愈合过程中发现骨髓中存在一种非造血系统的多潜能细胞，但研究因为条件原因未能深入。

后来有研究者[2]在20世纪60年代开展一系列开创性研究，发现从骨髓中分离得到长梭状、成纤维细胞样的细胞群，在塑料培养皿中呈集落样贴壁生长；1987年，又发现这种骨髓单核细胞可在一定的条件下分化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞和成肌细胞。

培养增殖二十代后仍保有其多向分化的潜能。

于是把这种多能细胞称为间充质干细胞(mesenchyma stem cell，MSC)。

间充质干细胞制备流程摘要：本文详尽阐述了间充质干细胞（MSCs）的制备流程，涵盖了从供者选择、血清学检测、活检、分离、生物样品处理、体外扩增、细胞鉴定、包装直至放行等一系列关键步骤。

间充质干细胞凭借其独特的生物学特性，在再生医学和细胞治疗领域展现了巨大的应用潜力。

文章伊始，便对间充质干细胞的基本特性及其临床应用前景进行了深入探讨，随后，对制备流程中的每个环节进行了细致的描述，包括了严格的技术要求和质量控制标准。

通过对这些流程的深入分析和详尽说明，本文意在为科研人员和临床医生提供一份科学、翔实的间充质干细胞制备指南，以期促进相关领域的研究进展和临床应用。

关键词：间充质干细胞；制备流程；再生医学；细胞治疗Abstract: This article comprehensively describes the preparation process of mesenchymal stem cells (MSCs), covering a series of key steps from donor selection, serological testing, biopsy, isolation, biosample processing, in vitro expansion, cell identification, packaging to release. Mesenchymal stem cells, with their unique biological characteristics, have shown great potential for application in the fields of regenerative medicine and cell therapy. At the beginning of the article, an in-depth discussion is conducted on the basic characteristics of mesenchymal stem cells and their clinical application prospects. Subsequently, each step in the preparation process is described in detail, including strict technical requirements and quality control standards. Through in-depth analysis and detailed explanation of these processes, this article aims to provide researchers and clinicians with a scientific and detailed guide for the preparation of mesenchymal stem cells, in the hope of promoting research progress and clinical applications in related fields.Keywords: Mesenchymal stem cells; Preparation process; Regenerative medicine; Cell therapy一、引言1.1 间充质干细胞的定义与特性间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells, MSCs）是一类具有独特生物学特性的多能干细胞，起源于胚胎发育的中胚层。

233CARCINO GENESIS ，TERATO GENESIS &MUTA GENESIS脐带来源的华通氏胶间充质干细胞的分离、特性及应用前景丁赛，张红霞，朱海英*(海军军医大学基础医学院细胞生物学教研室，上海200433)收稿日期：2021-11-21；修订日期：2022-05-13基金项目：国家自然科学基金(32171387)作者信息：丁赛，E-mail ：。

*通信作者，朱海英，E-mail ：【摘要】间充质干细胞(MSCs)的来源非常广泛。

虽然各种组织来源的MSCs 生物学特性不尽相同，但在标准培养条件下该类细胞均可以贴壁生长；细胞群体中有95%以上的细胞表达典型的间充质标记分子，如CD73、CD90和CD105，但缺乏造血标记分子CD14、CD19、CD34、CD45和CD79a 的表达；特别是均具有分化为成脂细胞、成骨细胞和成软骨细胞的能力。

这些性质是国际细胞治疗协会给出的定义该类细胞的最低标准。

脐带间充质干细胞是指来源于新生儿脐带组织中的多能干细胞。

目前来看，从脐带不同解剖学部位(区室)获得的MSCs 的生物学性质也存在差异，其中从脐带华通氏胶中分离获得的华通氏胶间充质干细胞，在增殖能力、分化潜能、免疫调节能力等方面均明显优于其他区室来源的间充质干细胞，是用于组织器官损伤修复及免疫调节的一种理想的“种子”细胞，被认为具有更好的临床应用前景。

本文围绕近年来华通氏胶间充质干细胞的分离建系、增殖特性、分化潜能以及临床应用方面的研究进展进行了综述，其中重点介绍了化学诱导分化方案的建立和优化，认为与通过遗传改变诱导重编程方法相比，化学诱导分化方法具有更好的临床应用潜力。

【关键词】脐带；华通氏胶；间充质干细胞；分化潜能；分离；增殖特性中图分类号：R329.2+8文献标志码：A文章编号：1004-616X(2022)03-0233-04doi ：10.3969/j.issn.1004-616x.2022.03.011间充质干细胞最早在骨髓中被发现和鉴定，随后在人体胚胎及成体的多种组织中被陆续鉴定出来，这些组织主要包括成体骨髓、脂肪、滑膜、骨骼、肌肉、肺、肝、胰腺等组织以及羊水、脐带和脐带血等。

脂肪干细胞三维生长骨组织工程复合体的构建王建武，党建军，李强，李文高，郑宇陕西省中医医院骨伤一科，陕西省西安市710003Three-dimensional growth of adipose-derived stem cells in bone tissue engineering complexWang Jian-wu, Dang Jian-jun, Li Qiang, Li Wen-gao, Zheng YuDepartment of Orthopedics, Sh aanxi Province Hospital of Traditional Chinese Medicine, Xi’an 710003, Shaanxi Province, China摘要背景：组织工程支架是模仿细胞赖以生长代谢的细胞外基质而构建的支架和环境，其选择、制备以及种子细胞的选择是骨组织工程领域中的一项十分重要的课题。

目的：利用几丁质凝胶/异种骨构建脂肪干细胞三维生长环境，并对其相容性进行研究。

方法：从出生8 d新西兰大白兔腹股沟获取脂肪组织，提取脂肪干细胞。

脂肪干细胞经过体外成骨诱导分化后，种植于几丁质凝胶/异种骨，构建新型骨组织工程复合体，并将其设为细胞/几丁质凝胶/异种骨组；将脂肪干细胞直接种植于异种骨，构成脂肪干细胞/异种骨复合体作为细胞/异种骨组，单独异种骨为空白组。

体外诱导2周后进行电镜扫描，观察细胞与支架的复合情况。

结果与结论：镜扫描观察显示几丁质凝胶充分渗透于支架的空隙内，形成一个细胞的三维生长环境，使原本只能在材料上贴壁生长的脂肪干细胞能够在三维的环境中生长，为细胞外基质的再生提供足够的空间。

几丁质凝胶/异种骨悬浮诱导后的脂肪干细胞，承载了更多的细胞，减少了细胞在载体中的流失，是一种较好的骨组织工程载体。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程全文链接：关键词：组织构建；骨组织工程；干细胞；脂肪干细胞；骨组织工程复合体；几丁质凝胶；异种骨；三维环境；生物相容性；细胞相容性；Abstract：BACKGROUND: Tissue engineering scaffolds are designed to imitate extracellular matrix, which is essential for cellular growth and metabolism. The scaffold preparation and the selection of seed cells are the hot topics in bone tissue engineering field.OBJECTIVE: To construct three-dimensional growth environment of adipose-derived stem cells with the chitosan/xenogeneic bone, and investigate its compatibility. METHODS: Adipose tissue was obtained from New Zealand white rabbits at 8 days old, and adipose-derived stem cells were extracted. After induction of osteogenic differentiation in vitro, the cells were cultured on chitosan/xenogenic bone, to construct bone tissue engineering complex, serving as the experimental group. The adipose-derived stem cells were directly cultured in xenogenic bone, to construct cells/xenogeneic bone complex, serving as a control group. The simple bone xenograft served as a blank group. Two weeks after in vitro induced differentiation, the complex or xenograft in three groups were observed under scanning electron microscope to observe the cells and scaffold compound the situation.RESULTS AND CONCLUSION: The chitosan fully penetrated into the scaffolds, and formed a。

・３８２・．，ｏｌｌｍｄｚｏｆＣｌｉｎｉｃａｌａｎｄＥｘｐｅｒｉｒｎｅｎｔａｔＭｅｄｉｃｉｎｅＶｄ．９，Ｎｏ．５Ｍａｒ．２０１０骨髓干细胞治疗心脏病的研究与进展龚怡综述雷长城’审校（南华大学附属第二医院湖南衡阳４２１０００）【关键词】骨髓干细胞心血管疾病移植各种心脏病发展到晚期大多导致心力衰竭，心力衰竭严重影响着心脏病患者的预后及生活质量。

而常规治疗手段效果有限，骨髓干细胞的临床研究越来越多。

现就骨髓干细胞的分类、作用机制、途径、存在的问题及前景等作简要介绍。

１研究背景及现状冠状动脉粥样硬化性心脏病、风湿性心脏病、扩张型心肌病等各种原因所致的心肌损伤发展到晚期大多伴有心腔扩大和舒缩能力下降，虽然成熟的心肌细胞不是终末分化细胞，但由于其增殖、分裂能力有限，新生成的心肌细胞远远无法修复坏死的心肌，具有完整舒缩功能的心肌细胞数量相对或绝对减少，受损心肌细胞由纤维组织瘢痕修复，未受损的心肌细胞代偿肥大，造成心肌功能收缩功能下降，最终导致心力衰竭。

目前常规的治疗手段只能缓解心衰症状，不能修复死亡或濒死的心肌。

心肌细胞在出生后已失去增殖能力或增殖能力极低，因此增加具有完整舒缩功能的心肌细胞数目，是改善心功能的关键。

细胞移植是一个切实可行的增加成体心肌细胞的方法，骨髓干细胞在体外有良好增殖能力，能在心肌内环境下分化为损伤组织所需要的心肌细胞，且无移植后的免疫排斥反应，因此在心肌损伤的治疗中备受关注。

Ｓｏｏｎｐａａ等¨１首先尝试了心肌细胞移植，初步证实了心肌细胞移植的可行性。

他们将小鼠胚胎心肌细胞移植到正常小鼠心脏中，发现移植的心肌细胞能够存活并与受体心肌细胞产生闰盘连接。

随后，各种干细胞用于心脏病治疗。

干细胞移植成为心力衰竭治疗的一种新尝试。

德国和香港两个研究小组曾利用心肌梗死患者自身骨髓干细胞修复其受损伤的心脏取得成功。

另据报道，美国、德国、中国研究人员利用骨髓干细胞、或自体骨髓干细胞治疗心脏病或心肌梗死患者均取得重要进展。

小鼠脂肪间充质干细胞的分离培养及生物学特性分析刘寿生;雷俊霞;黎阳;项鹏;周敦华【摘要】[Objective] To establish an effective way for isolation and expansion of mouse adipose-derived stromal cells (ADSC), and to observe the biological characteristics of mouse ADSC. [Methods] ADSC were obtained from adipose of BALB/C mouse, isolated and purified in vitro to determine cell morphology, immunophenotype, differentiation potentiality, clone formation ability, growth kinetics and immunoloregulation characteristics in the lymphocyte proliferation inhibition test; T lymphocytes (1 ?105) were cultured in the presence of ConA (ConA was 20 μg/mL), and ADSC of different number interacted with activated T lymphocytes respectively. Experiment was divided into 8 groups by the different number of ADSC: A group as positive control (ConA+T lymphocytes), B group (ADSC 1× 103+ConA+T lymphocytes), C group (ADSC× 1 04+ConA+T lymphocytes), D group (ADSC 2 × 104+ConA+T lymphocytes), E group as negative control (T lymphocytes), F group (ADSC1 ×103), G group (ADSC1 × 104), H group (ADSC 2 × 104), F, G, H were reference groups. The ability of T lymphocyte proliferation was measured by cck-8 method. [Results] ADSC showed plastic-adherent, fibroblastic-like morphologic characteristics, cell proliferation was inadequate and cell morphology changed to flat, enlarged shapes with the passage increasing. ADSC at passage 3 highly expressed CD29 and CD44, moderately expressed Sca-1, weakly expressed CD34, CD45, and CDllb.Three passaged ADSC could be induced to differentiate into osteoblasts and adipocytes, and had strong ability to shape colony forming unit-fibroblasts (CFU-Fs). Doubling time of three,five, and eight passaged ADSC was (22 ?3)h, (24 ?3)h, and (30 ?3)h, respectively. The proliferation rate after passage 5 slowed down gradually. ADSC could suppress T lymphocyte proliferation, the inhibition ratios of B, C, and D group were 20. 78%, 47. 94%, and 60.70%, respectively, which was similar to bone marrow mesenchymal stem cells (BMSC). [Conclusion] ADSC can be isolated and expanded effectively by using adherent culture, they possess general characteristics of mesenchymal stem cells, in addition, they are easier to be purified and their proliferation rate is faster compared with BMSC,so ADSC may be a good multipotential cell candidate for the future cell replacement therapy.%[目的]建立一种有效的分离、培养小鼠脂肪间充质干细胞(ADSC)的方法,从而为小鼠间充质干细胞(MSC)的来源提供更广阔的选择,以利于MSC在小鼠模型中的研究.[方法]体外分离、纯化BALB/C小鼠ADSC,进行细胞形态、表面标志、成脂及成骨分化潜能鉴定、克隆形成能力、生长动力学等方面的研究,并通过淋巴细胞增殖抑制试验研究其免疫调节特性:用终浓度为20μg/mL的ConA作用于T淋巴细胞(1×105个),以不同数量的ADSC分别与活化T淋巴细胞作用,根据ADSC数量不同实验分为A组(ConA+T细胞)、B组(ADSC 1×103/孔+ConA+T细胞)、C组(ADSC 1×104/孔+ConA+T细胞)、D组(ADSC 2×104/孔+ConA+T细胞),同时E组(单纯T细胞)作为阴性对照组,F组(ADSC 1×103孔)、G组(ADSC 1×104/孔 )、H组(ADSC 2×104/孔)作为参照组.用CCK-8法检测作用前后T细胞功能.[结果]ADSC镜下形态呈贴壁、梭型,且随着代数的增加,细胞逐渐增大；第3代ADSC高表达CD29和CD44,中表达Sca-1,低表达或不表达CD34、CD45、CD1 1b;第3代ADSC可诱导分化为成骨细胞和脂肪细胞;第3代ADSC有很强的集落形成能力；第3代ADSC倍增时间为(22±3)h,第5代ADSC 倍增时间为(24±3)h,第8代ADSC倍增时间为(30±3)h,第5代后的ADSC增殖速度随着代数的增加逐渐减慢;ADSC可以抑制T淋巴细胞的增殖,B、C、D组的抑制率分别为20.78％、47.94％、60.70％,抑制能力和骨髓间充质于细胞(BMSC)相似.[结论]通过贴壁培养可以从小鼠脂肪中分离培养出高纯度ADSC,该方法效率高,培养出的ADSC具有BMSC的一般特性,且与BMSC相比更易纯化,具有更快的增殖速度,有望作为小鼠MSC的有效来源.【期刊名称】《中山大学学报（医学科学版）》【年(卷),期】2012(033)003【总页数】6页(P299-304)【关键词】间充质干细胞;小鼠;骨髓;脂肪组织;免疫调节【作者】刘寿生;雷俊霞;黎阳;项鹏;周敦华【作者单位】中山大学附属第二医院儿科,广东广州510120;中山大学中山医学院,广东广州510080;中山大学附属第二医院儿科,广东广州510120;中山大学中山医学院,广东广州510080;中山大学附属第二医院儿科,广东广州510120【正文语种】中文【中图分类】R725.5;R329.4间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC）最初是在骨髓中分离出来的，但后来在脂肪组织、肌肉组织、牙根、胎盘、羊水及脐带血中均分离出MSC［1］。

脂肪干细胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）是近年来从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的干细胞。

Zuk等[1]从吸脂术抽取的脂肪组织悬液中最先分离培养出多向分化潜能的干细胞。

研究发现，ADSCs能够在体外稳定增殖且衰亡率低，同时它具有取材容易、少量组织即可获取大量干细胞、适宜大规模培养、对机体损伤小等优点，而且其来源广泛，体内储备量大，适宜自体移植，逐渐成为近年来新的研究热点之一。

人ADSCs主要来源于吸脂术得到的脂肪组织，随着整形美容业的迅猛发展，重睑手术所得的眶隔脂肪组织也随之增多，给ADSCs的取材提供了新的路径。

本研究主要探讨人上睑眶隔脂肪来源的脂肪提取ADSCs的可行性。

1材料与方法1.1脂肪组织来源本研究所用脂肪组织来自于潍坊医学院整形外科医院重睑手术者，均为女性，年龄18~30岁。

1.2主要试剂磷酸盐缓冲液（PBS）、胎牛血清（FBS）、DMEM培养基（Gibco公司，美国），Ⅰ型胶原酶、胰蛋白酶（Hyclone公司）等。

1.3ADSCs的分离培养及传代将取出的脂肪组织放于无菌盘中，用PBS冲洗3遍，然后用无菌眼科剪刀剔除血管、筋膜等组织，再用PBS冲洗3遍。

把修剪好的脂肪组织放入盛有高糖DMEM（无血清）的无菌培养皿中，用眼科剪刀将脂肪剪成糊状，置于离心管中。

室温下离心（1200r/min）10min。

离心后可见离心管中液体分层：上层为白色泡沫，中层为清液，下层为黄色脂肪。

吸取上、中层丢弃。

加入3~5倍体积的0.1％Ⅰ型胶原酶和胰酶混合液（1∶1），将沉积于离心管底部的脂肪组织振荡打散，拧紧离心管后，用封口膜包裹，放入37℃恒温摇床中振荡（190r/min）消化30min。

将离心管自摇床中取出，肉眼观察可见无明显脂肪颗粒、白色泡沫贴壁，将液体用200目筛网过滤，滤液离心（1200r/ min）10min。

弃上清液，用PBS冲洗3遍，加入含有10％FBS的高糖DMEM培养基，轻轻吹打成细胞悬液，用细胞计数板计数，调整细胞密度1.0×105mL-1接种于培养瓶中，在5%CO2、37℃标准环境下培养。