人脂肪干细胞的分离培养及鉴定

人脂肪间充质干细胞向表皮细胞表型转化的研究赵周婷;胡大海;陶克;刘佳琦;张战凤;白晓智【摘要】目的:探索人脂肪间充质干细胞(adipose derived mesenchymal stem cells,ADSCs)向表皮细胞表型转化的方法.方法:以手术中剩余的人皮下脂肪组织为材料来源,利用胶原酶消化法分离ADSCs,流式细胞仪检测细胞表面标记CD29、CD90、CD105的表达,成脂诱导后油红0染色鉴定.实验组利用第四军医大学西京医院烧伤与皮肤外科实验室已成功构建的pcDNA3.1 (+)/SP+EGF质粒经脂质体介导转染的HaCat细胞,与ADSCs在Transwell小室中共培养,对照组为ADSCs 加入10％ FBS培养基,14天后Realtime-PCR检测两组ADSCs中CK19、integrin-β的mRNA表达量.结果:实验组ADSCs中CK19、integrin-β的mRNA 表达量较对照组明显升高,且差别有统计学意义.结论:转染EGF的HaCat细胞可诱导ADSCs向表皮细胞表型分化,从而为其成为组织工程理想的种子细胞提供了进一步的支持.【期刊名称】《中国美容医学》【年(卷),期】2014(023)022【总页数】5页(P1899-1903)【关键词】脂肪间充质干细胞;HaCat细胞;表皮细胞;组织工程【作者】赵周婷;胡大海;陶克;刘佳琦;张战凤;白晓智【作者单位】解放军第211医院五官科黑龙江哈尔滨150080;第四军医大学西京医院烧伤与皮肤外科全军烧伤中心陕西西安710032;第四军医大学西京医院烧伤与皮肤外科全军烧伤中心陕西西安710032;第四军医大学西京医院烧伤与皮肤外科全军烧伤中心陕西西安710032;第四军医大学西京医院烧伤与皮肤外科全军烧伤中心陕西西安710032;第四军医大学西京医院烧伤与皮肤外科全军烧伤中心陕西西安710032【正文语种】中文【中图分类】R751;R64皮肤缺损是外科领域的常见问题，尽早封闭创面，减少机体消耗和内环境紊乱是治疗皮肤缺损的关键。

求救：打了干细胞填充后悔了，干细胞填充面部的危害注意事项求救：打了干细胞填充后悔了，干细胞填充面部的危害注意事项，很多小姐姐，随着年龄的增长，皮肤生存环境恶化，皱纹出现，面部老化现象越来越重。

原因之一就是脂肪萎缩，表皮层和真皮层逐渐变薄。

特别是眼睛周围的皮肤，表皮天生较薄，而当血液流经此处的大静脉时，便会出现蓝黑色的眼圈，形成眼袋，继而产生眼部皱纹。

面部老化现象更加严重。

这时，美女小姐姐们就会选择干细胞填充，那么干细胞填充面部的危害注意事项你们都了解吗？今天一起来看看吧！ZQH想要效果持久记得术后通过口服ACMETE-A细胞激活能量蛋白，即使是营养相对较为贫乏的部位也能够生长，它们紧紧的吸取养份促进植入的脂肪的生长，使它们不会流失。

由于植入的脂肪能长期存活，因此效果能得以保持。

干细胞就是维系着脂肪细胞生长的关键。

干细胞填充能促进植入脂肪细胞的生长、抗面部衰老。

干细胞填充的过程干细胞填充分为三：1、是干细胞+脂肪，2、干细胞+血清，3、干细胞+玻尿酸。

下面举例说明的是干细胞+脂肪。

1、抽脂脂肪干细胞采集主要是在局部麻醉状态下，从腹、背、腰、手臂、大腿和臀部抽取脂肪，主要部位为大腿外侧；2、分离培养通过全封闭脂肪干细胞浓缩分离系统，负压吸取脂肪技术、模糊离心油脂分离技术、单次大容量提纯分离技术、自毁式移植离心管设计等现今技术，分离出完整的脂肪干细胞，再进行培养，生产出生命力旺盛的脂肪幼细胞；3、移植到身体需要饱满、祛皱的部位；4、术后通过口服ACME-TEA细胞激活能量蛋白，使植入的组织与自体融为一体干细胞注射一次的费用多少?抗衰老干细胞注射一次的费用从1万到几十万不等，要根据具体的情况来定，是局部注射还是其他？是配合生长因子还是有其他的配方？比如在哪个机构打的干细胞，打多少剂量的干细胞。

另外，干细胞抗衰注射的方案是根据你的身体情况来定制的，所以具体费用还得根据实际情况确定的。

在进行干细胞抗衰注射之前，需要做专业咨询和三甲医院或有资质的体检中心出具近一个月内的体检报告。

抗衰神器：svf脂肪干细胞是什么？为何最近这么火？Svf脂肪干细胞是什么？为何最近这么火？我们都知道自体脂肪被誉为美容界中的“人体软黄金”，一直是绿色安全的代名词，但是很多人不了解svf脂肪干细胞，脂肪干细胞胶（SVF-gel），颗粒精细，通过诱导永久脂方再生，完成中面部填充支撑。

而且含有丰富的自体脂肪胶原和脂方来源干细胞，有助于恢复皮肤活力。

首先，为了提升脂方填充的存活率，应该严格遵照医嘱在手术前10-20天口服脂方填充手术专用营养ACME-TE-A细胞激活能量蛋白【存活太】，术后1~2个月持续使用，逐渐减量。

手术专用营养除了修复手术过程带来的细胞损伤外还可以为新移植的脂方细胞提供基础营养。

同时可以起到消炎去除红肿淤青，预防脂方坏死的作用。

Svf脂肪干细胞为了提高注射脂方的成活率，日本东京医科大学整形外科主任吉村浩太郎(Kotaro Yoshimura)于2008年提出了细胞辅助脂方移植技术(Cell-assisted lipotransfer)，即所谓的CAL技术。

该技术将自体脂方中分离出的SVF(Stromal vascular fraction，直译为“基质血管成分”)混合入要移植的脂方中，SVF中富含的干细胞成分能促进脂方细胞的存活，从而提高脂方移植的存活率。

这里要明确的是，SVF并不是脂方干细胞，SVF的全称是Stromal vascular fraction，直译为“基质血管成分”，是自体脂方中新鲜分离出来的多种细胞混合物，其中包括内皮细胞、淋巴细胞、中性粒细胞、前脂方细胞和脂方干细胞。

所以CAL技术是在脂方移植的同时提取脂方干细胞成分，回植入体内，未经过任何的体外培养和外界干预，所以是很安全的。

脂肪填充过程1、手术康复的护理是提高效果的重要环节为了提升脂方填充的存活率，应该严格遵照医嘱脂方填充在手术前10-20天口服脂方填充手术专用营养细胞激活能量蛋白【存活太】。

术后1~2个月持续使用，逐渐减量。

人间充质干细胞团体标准
一、术语和定义
1.人间充质干细胞（MSC）：一种成体干细胞，具有多向分化潜能，可分化
为脂肪、骨、软骨等细胞，并具有免疫调节功能。

2.细胞来源：MSC可从多种组织中获取，包括骨髓、脂肪、脐带血等。

3.细胞制备：通过适当的分离、培养和扩增技术，将原始组织中的MSC制备
成可用于治疗的细胞。

4.细胞表型鉴定：通过免疫表型分析技术，对MSC的表面标记进行检测，以
确定其身份和纯度。

5.细胞功能检测：对MSC的功能进行检测，包括增殖能力、分化能力、免疫
调节能力等。

6.细胞存储与运输：通过适当的存储和运输条件，保证MSC在存储和运输过
程中的活性和稳定性。

7.细胞应用指导：根据患者的具体情况和治疗需求，为医生提供MSC应用的
指导建议。

8.安全管理：制定安全管理措施，确保MSC制备和使用过程中的安全性。

9.质量管理：建立质量控制体系，确保MSC的质量和有效性。

10.标识、记录与档案管理：对MSC的制备、存储和使用过程进行记录和档案
管理，确保可追溯性。

11.培训与资质要求：对从事MSC相关工作的人员进行培训和资质认证，确保
其具备必要的专业知识和技能。

12.伦理与合规性考虑：在MSC的制备、使用和研究中遵循伦理原则和相关法
律法规的规定。

大鼠脂肪干细胞的分离培养1.试剂配制1.1双抗培养基的配制用100万单位链霉素溶解在10ml去离子水中，抽出0.8ml以及用80万单位的青霉素溶解在8ml的去离子水中，抽出0.5ml，分别加入DM EM培养基中，即配成100U/m1青霉素，100U/m1链霉素双抗培养基。

1.2成骨诱导剂的配制地塞米松259溶解于100ml去离子水中，抽出10ul;10gβ一甘油磷酸钠溶解于6ml去离子水中，抽出lml;25g抗坏血酸溶解于100ml去离子水中，抽出100ul，分别加入100ml的培养基中，既配成了含1nmol/L 地塞米松，50ug/m1抗坏血酸，10mmol/Lβ一甘油磷酸钠的成骨诱导剂。

1.3 DMEM培养基的配制取一瓶DM EM溶解于1000ml去离子水中，搅拌均匀后，用7%NAHC03调节其PH值为7.2-7.4。

用滤器过滤，分装在100ml的清洁无菌生理盐水瓶中置4℃冰箱中。

1.4含10%胎牛血清的DM EM完全培养基的配制取10ml胎牛血清溶解于90mLDM EM培养基中，即可配成含10%胎牛血清的DM EM培养基，装在100ml的生理盐水瓶中置4℃冰箱中。

1.5 0.25%胰蛋白酶的配制用精确的天平称250mg胰蛋白酶，并溶解于100ml培养基中，即浓度为0.25%。

用7%NaHC03调节其PH值为7.2-7.4。

用滤器过滤后，分装在100ml的清洁无菌生理盐水瓶中置4℃冰箱中。

1.6 Ⅰ型胶原多克隆抗体配制I型胶原多克隆抗体用去离子水配成1:100工作浓度，置4℃冰箱中备用。

1.7 二氮联苯胺(diminob ℃nzidin ℃DAB)显色剂的配制分别取lml试剂A，50ul试剂B，50ul试剂按A到C加入，即配成lmLDAB显色剂。

在配制成30min内用于免疫细胞化学染色。

1.8 地塞米松(DXM)液的配制地塞米松25g溶解于100ml去离子水中，抽出10ul。

既配成了含1nmol/L地塞米松，使用时根据需要配制成不同浓度。

脐带血间充质干细胞的分离培养和鉴定概述脐带血间充质干细胞（Wharton’s jelly mesenchymal stem cells, WJ-MSCs）是一类来源于脐带的干细胞。

WJ-MSCs具有较强的增殖能力、多向分化潜能、免疫调节功能等，是目前研究领域中备受关注的干细胞类型之一。

在该文档中，我们将介绍如何从脐带血样中分离出WJ-MSCs，并进行相关的细胞培养和鉴定。

分离过程脐带血样获取首先需要从人体获得脐带血样。

脐带血样一般可以在婴儿出生后通过脐带穿刺等方式获取。

获取脐带血样需要得到母亲的同意，并通过相关机构进行规范化处理。

分离WJ-MSCs脐带血样获取后，需要将其中的WJ-MSCs进行分离。

具体分离步骤如下： 1.将脐带血样转移至离心管中； 2. 加入相同体积的PBS，并轻轻混合； 3. 通过低速离心分离脐带血样中的血细胞等成分； 4. 取下沉后的WJ组织，加入胶原酶等酶类消化物进行消化，离心分离细胞； 5. 通过细胞培养等方式扩增细胞数量。

细胞培养在分离得到WJ-MSCs之后，需要进行相关的细胞培养。

具体培养步骤如下：1. 将分离得到的WJ-MSCs转移至新的培养皿中； 2. 加入含有10% FBS的DMEM低糖培养基； 3. 定期更换培养基，并记录生长状况。

鉴定方法确定分离的细胞为WJ-MSCs的方法很多，常用的方法如下： #### 形态学鉴定通过显微镜观察细胞形态、吸附能力等，判断细胞是否符合WJ-MSCs的特征。

免疫学鉴定通过使用针对WJ-MSCs标记的分子抗体（如CD73、CD90等）对细胞进行标记，并使用流式细胞仪等方法进行检测。

活力检测通过MTT法、细胞增殖实验等，检测WJ-MSCs是否具备较强的增殖能力。

多向分化鉴定通过对WJ-MSCs进行分化培养，如脂肪细胞培养、软骨细胞培养等，检测WJ-MSCs是否显示多向分化的潜能。

结论通过脐带血样的分离，可以获得WJ-MSCs，并通过相关的培养和鉴定方法，确定其为WJ-MSCs，并进一步应用于生物医学实验中，具有潜在的临床应用前景。

Choukroun's PRF对体外培养人脂肪干细胞增殖及成骨分化的影响作者：刘元媛柳大烈南华黄佳诚单磊来源：《中国美容医学》2013年第01期[摘要]目的：观察自体富血小板纤维蛋白Choukroun's PRF（Choukroun's platelet-rich fibrin）对体外培养人脂肪来源干细胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）增殖及成骨分化能力的影响。

方法：取吸脂术者自愿捐献的脂肪组织分离培养ADSCs，采用Choukroun法制备自体PRF备用，观察细胞生长情况。

取第3代ADSCs分别向骨细胞、脂肪细胞、神经球细胞定向诱导分化鉴定，并行细胞表面抗原CD29、CD45、CD90流式检测鉴定。

将第3代ADSCs 分别采用含PRF的普通培养基（PRF组Ⅰ）和不含PRF的普通培养基（对照组Ⅰ）进行培养，观察细胞生长情况，培养1天、3天、5天、7天后采用CCK-8试剂检测细胞增殖活性。

另外分别采用含PRF的成骨诱导培养基（PRF组Ⅱ）、不含PRF的成骨诱导培养基（对照组Ⅱ）及不含PRF的普通培养基（空白组）进行培养，第7天、14天、21天、28 天行碱性磷酸酶活性（ALP活性）检测；诱导细胞培养后第7天、14天天各组分别行von Kossa染色观察钙结节形成情况。

结果：第3代ADSCs倒置显微镜下观察大多呈梭形，向骨细胞、脂肪细胞、神经干细胞定向诱导鉴定均为阳性，流式检测鉴定CD29、CD90为阳性，CD45为阴性。

CCK-8法示PRF组Ⅰ的OD值均大于对照组Ⅰ，两组比较差异均有统计学意义（P[关键词]自体PRF；人脂肪来源干细胞（ADSCs）；增殖；成骨分化[中图分类号]Q813.1 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2013）01-0040-03The effect of Choukroun's PRF on the proliferation and osteogenetic differentiation of human adipose-derived stem cells in vitroLIU Yuan-yuan，LIU Da-lie，NAN Hua，HUANG Jia-cheng，SHAN Lei（Department of Plastic and Aesthetic，Zhujiang Hospita of Nanfang Medical University，Guangzhou 510282，Guangdong，China）Abstract： Objective To observe the effect of Choukroun's PRF （Choukroun's platelet-rich fibrin） on the proliferation and osteogenetic differentiation of human adipose-derived stem cells in vitro. Methods Human ADSCs （adipose-derived stem cells） were isolated from adipose tissue obtained from donor undergoing liposuction and were cultured，and autologous PRF was prepared by Choukroun method，and growth condition of ADSCs was observed.ADSCs at passage 3 were cultured in adipogenic，osteogenetic and neurospheres differentiation medium and underwent identification，flow cytometric analysis for cell surface antigen CD29，CD45 and CD90 wereperformed. ADSCs at passage 3 cultured by common culture medium containing PRF （PRFgroupⅠ）， and cultured by common culture medium without PRF （control groupⅠ）. Growth condition of the cells was observed by inverted microscope. CCK-8 method was used to observe cell proliferation activity 1，3，5，7 days after culture. Then ADSCs cultured by osteogenic induction culture medium containing PRF （PRF groupⅡ）， cultured by osteogenic induction culture medium without PRF （control groupⅡ） and cultured by common culture medium without PRF （blank group）.ALP activity detection was conducted 7，14，21 and 28 days after culture. Von Kossa staining was performed on the three groups 7 and 14 days after culture to detect the formation of calcium nodule. Results Most ADSCs at passage 3 were spindle-shaped under the inverted microscope. Adipogenic ， osteogenetic and neurospheres differentiation were positive， and flow cytometric analysis of CD29 and CD90 were positive，CD45 were negative. CCK-8 method revealed the Optical Density value of PRF groupⅠwere all greater than control groupⅠ，and there were significant diferences between two groups （PKey words：Autologous PRF； human adipose-derived stem cells； cell proliferation；osteogenetic differentiation国内外许多研究已经证明血小板浓缩物被激活后可释放出多种细胞生长因子，1984年，Assion从人血浆提取富血小板血浆（platelet-rich plasma，PRP），大量研究表明PRP内富含血小板，血小板脱颗粒后，可以释放大量生长因子，可促进软硬组织愈合再生，已应用于整形美容和创伤外科等领域[1-2]。

干细胞抗衰老技术规范化指南（最全版）干细胞是维持人体动态平衡的种子细胞，机体通过干细胞增殖和分化实现细胞更新。

随着年龄的增长，人体中各个组织器官的干细胞数量逐渐减少，干细胞的增殖分化能力下降，使受损的组织和器官得不到及时的修复和再生，直接导致人体衰老和疾病的发生。

本规范化指南所涵盖的干细胞抗衰老技术是指应用人自体来源（脂肪、皮肤、骨髓等）或异体来源（脐带、胎盘等）的干细胞，经体外处理后局部注射到人体特定部位或经静脉输注到人体，通过其增殖、多向分化、组织修复和免疫调节的特性，用于改善皮肤质地，维持皮肤年轻化（局部应用），或者改善精神状态、提高自体组织器官的修复能力、减缓衰老进程（全身应用），从而达到抗衰老目的。

一、医疗机构的基本要求[1]（一）医疗机构开展干细胞应用技术应当与其功能、任务相适应。

（二）具备卫生行政部门核准登记的三级综合医院或专科医院，以及专设的抗衰老医疗机构，应具备必要的辅助科室以进行检查和随访。

（三）设有管理规范、运作正常的由医学、法学、伦理学等方面专家组成的干细胞临床应用伦理委员会。

（四）具备完整的干细胞质量控制条件和管理体系，独立的干细胞质量保证部门。

具有完整的干细胞制剂制备和临床应用的质量管理及风险控制程序和相关文件（含质量管理手册、临床应用工作程序、标准操作规范和记录等）。

二、专业人员资质[2]（一）干细胞制剂相关的专业技术人员：①至少具备1名有细胞生物学研究基础的副研究员及以上专业技术职务的总体负责人。

②从事细胞制备工艺的操作人员应具有相关专业大学专科及以上学历，具有细胞生物学的基础理论知识和实践操作技能，有不少于50例实验性干细胞制剂制备经验。

③从事质量检验的工作人员应具有相关专业大学专科及以上学历，经过专业技术培训并考核合格。

（二）干细胞临床应用医师：①取得《医师执业证书》，并登记注册。

②具有副主任医师及以上专业技术职务任职资格的在职医师。

③熟悉干细胞的相关特性和生物制剂的输注要求，经过干细胞临床应用相关技术系统培训并考核合格。

充质干细胞的功能一、前言充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一类具有自我更新和多向分化潜能的成体干细胞，广泛存在于人体各种组织中，如骨髓、脂肪、肝、肺等。

近年来，随着对MSCs的研究不断深入，其在生物医学领域中的应用也越来越广泛。

本文将从MSCs的来源、分离与鉴定以及功能等方面进行详细介绍。

二、MSCs的来源1. 骨髓骨髓是目前最常用的MSCs来源之一。

通过穿刺取得后，通过密度梯度离心法或直接附着法等方法进行分离纯化。

2. 脂肪组织脂肪组织是另一个常见的MSCs来源。

通过脂肪吸取手术获取后，可使用胶原酶等消化酶进行分离。

3. 其他组织除了骨髓和脂肪组织外，MSCs还存在于其他许多组织中，如胎盘、牙髓、胃肠道等。

这些组织中的MSCs也可以通过相应方法进行提取和纯化。

三、MSCs的分离与鉴定1. 分离MSCs的分离主要采用密度梯度离心法或直接附着法。

其中，密度梯度离心法是指将骨髓等样本加入到含有不同浓度的离心液中，通过高速离心使细胞沉淀在不同位置，从而分离纯化MSCs。

直接附着法则是将样本直接加入培养皿中，利用MSCs对塑料表面亲和性强的特点进行选择性附着。

2. 鉴定为了确保分离出来的细胞为MSCs，需要进行一系列鉴定。

常用的方法包括：（1）免疫表型分析：通过流式细胞术等方法检测MSCs表面标记物的表达情况，如CD73、CD90和CD105等。

（2）多向分化实验：将MSCs培养在不同培养基中诱导其向成骨、成软骨或成脂肪方向分化，并通过特定染色法进行检测。

（3）基因表达谱分析：通过PCR等方法检测MSCs特定基因的表达情况，如Oct-4、Sox-2和Nanog等。

四、MSCs的功能1. 自我更新MSCs具有自我更新能力，能够在不断分化的过程中保持其干细胞特性。

这使得MSCs在体内修复和再生组织时具有重要作用。

2. 多向分化潜能MSCs具有多向分化潜能，可以向骨骼、软骨和脂肪等方向分化。

小鼠附睾脂肪干细胞的分离培养及鉴定张鉴清1，季佳霖2，崔新明2，张祺3，李艳茹21吉林大学第四医院，吉林省长春市130011；2吉林大学病理生物学教育部重点实验室，吉林大学基础医学院病理学系，吉林省长春市130021；3吉林大学，吉林省长春市130021 Isolation, culture and identification of adipose-derived stem cells from mouse epididymisZhang Jian-qing1, Ji Jia-lin2, Cui Xin-ming2, Zhang Qi3, Li Yan-ru21 the Fourth Hospital of Jilin University, Changchun 130011, Jilin Province, China;2 the Key Laboratory of Pathobiology of Ministry of Education, Department of Pathology, School of Basic Medical Sciences, Jilin University, Changchun 130021, Jilin Province, China;3 Jilin University, Changchun 130021, Jilin Province, China 摘要背景：脂肪干细胞作为一种新的成体干细胞，具有来源丰富、取材容易、增殖能力强等优点，受到人们越来越多地关注。

目的：体外分离培养小鼠附睾脂肪组织中的脂肪干细胞，并鉴定其生物学特性。

方法：无菌切取小鼠附睾处脂肪组织，采用胶原酶进行消化，利用1次消化多次收集与差速贴壁法分离纯化脂肪干细胞。

倒置显微镜及透射电子显微镜观察脂肪干细胞的形态。

绘制脂肪干细胞的生长曲线。

流式细胞术检测脂肪干细胞的免疫表型。

加入细胞诱导剂对脂肪干细胞进行成骨及成脂肪的诱导分化。