常规病毒学实验技术

病毒学实验技术 [病毒学,实验技术]病毒学实验技术病毒学实验技术目的要求通过实验掌握常用的病毒学实验技术和诊断方法。

操作步骤一、病毒诊断用病料的采集病毒分离用生物学材料的最理想的采集时期，是在机体尚未产生抗体之前的疾病急性期。

各种病料，例如血液、鼻咽拭子、粪、尿、脓汁、水泡液、皮肤病变、脊髓液和活体穿刺材料以及剖检时采取的组织，均可用于病毒分离。

每个具体疾病需要采取什么样的生物标本，可参考有关疾病的叙述，特别是其诊断部分。

有一些总的规则适用于病毒分离用的组织的正确选择。

呼吸道疾病在急性期，通常在鼻或咽分泌物排出病毒。

在痘病的水泡液中或痂皮内也可发现病毒。

许多全身性卡他性疾病具有病毒血症期，易于由血液中分离到病毒。

实际上急性发病期间，机体的所有分泌物中都含有病毒。

与中枢神经系统有关的疾病较特殊，但也可由血液或病死动物的脑内分离病毒。

采取组织标本时一个最为重要的注意事项，就是必须在动物死亡后立即进行--必要时可扑杀濒死动物，就更有利于病毒分离。

同时应采取该动物血液作血清学试验,在冰冻前必须先从全血中分离血清，因为溶血标本经常不再能做某些血清学试验。

各种病毒的生物物理学和生物化学特性明显不同。

许多病毒对热及酸敏感，故在采集材料时必须特别注意。

尤其是必须采取新鲜材料，并立即置-60℃至-70℃下冰冻。

此外，在用这些病料接种组织培养物或试验动物分离病毒时，时间尽量要短。

如无其他方法，可将组织标本低温冰冻后置-20℃保存，等待取来干冰后再贮藏和送往实验室。

将标本放入宽口保温瓶或以泡沫苯乙烯隔热的纸板盒内，再用冰充填，也可达到这一目的。

如果没有干冰，则可应用50%甘油;某些病毒在此种溶液中能比其他一些病毒存活更久。

将小块组织、粪或粘液装入小瓶内，再向瓶内注满50%甘油，并贮存于6℃。

组织标本应以无菌器械在无菌条件下采取。

如果想要了解组织中的病毒分布，则必须应用分开的器械采取每个组织。

经常应用紧盖的灭菌旋帽瓶子贮存可疑的组织和液体。

病毒学研究中的实验技术病毒学是研究病毒性疾病的科学。

病毒性疾病的病原体是病毒，而病毒无法自行进行代谢活动，必须寄生在宿主细胞内完成其生命活动，因此病毒性疾病是难以治愈的。

病毒学家通过从分子层面研究病毒的结构、生命周期和致病机制等方面，探究病毒感染机制和防治策略。

但是病毒性疾病的研究需要大量的实验技术支持，下面介绍一些病毒学研究中常用的实验技术。

一、细胞培养技术病毒感染的第一步是入侵宿主细胞，因此病毒学研究中不可避免地涉及到细胞培养技术。

细胞培养技术是把生物组织或细胞通过培养基、营养物质等条件模拟人体内环境来培育或生长。

常用的细胞培养技术包括原代细胞培养、细胞系培养和三维细胞培养。

原代细胞培养是将组织切碎后通过酶的作用将细胞分离培养，有原始细胞的特点；细胞系培养是通过连续传代保留的一种相同的细胞群体，细胞系一般在细胞数目增高到一定阶段会停滞不生长，从而要定期传代；三维细胞培养则是将细胞以3D结构的形式培养，可以模拟更接近真实环境的细胞生长。

二、病毒制备技术病毒制备技术是研究病毒性疾病的基础。

制备好的病毒才能在实验中进行感染、药物筛选等研究。

病毒制备技术不同于普通的细胞培养技术，主要包括以下步骤：选择适宜的病毒感染细胞、制备病毒原液、病毒上清的浓缩、纯化和滤过等。

在实际制备中，还需要时刻注意环境卫生和安全控制等因素，保证实验和研究的可行性和可靠性。

三、病毒感染实验技术病毒感染实验技术是研究病毒性疾病的核心。

病毒感染实验技术主要包括病毒感染模型建立、病毒感染实验的设计、病毒感染后的分析与诊断等。

在病毒感染实验中，常常使用到Green Fluorescent Protein (GFP)、Luciferase、β-galactosidase等荧光物质和化学指标来评估病毒感染情况和细胞的生长状态。

此外，病毒感染实验中还会运用到PCR、Western blot等分子和蛋白质分析技术来探究感染机制和影响。

四、病毒抗原与抗体的检测技术病毒的抗原与抗体检测是病毒学研究的重要环节。

病毒学中的基本概念与实验方法病毒学是研究病毒的学科，涉及病毒结构、生命周期、传播方式、病毒与宿主细胞的相互作用等方面。

病毒学对于预防和治疗病毒感染疾病具有重要的意义。

本文将着重介绍病毒学中的基本概念与实验方法。

一、病毒的基本概念病毒是一种非细胞生物，由核酸和蛋白质两部分组成。

病毒依赖于宿主细胞复制，并利用宿主细胞的资源为自己的生存繁殖提供能量和物质。

病毒可以感染所有的生命体，包括细菌、真菌、动物和植物等。

病毒通常以一定的方式传播，如空气传播、食物传播、血液传播等。

不同的病毒在宿主体内的扩散和繁殖方式不同，病毒的致病性也不同。

有些病毒可以引起轻微的疾病，而有些病毒可以导致严重甚至致命的疾病，如HIV、流感、乙肝等。

二、病毒的实验研究方法1、细胞培养技术病毒的寄生乃至其复制均发生在宿主细胞内，因此细胞培养技术是病毒研究的基础。

细胞培养技术是将组织细胞按一定的条件培养起来，便于观察和实验。

目前细胞培养技术已经非常成熟，研究者可以通过不同的培养方式获得无数的活细胞，便于进行病毒的研究。

2、病毒分离技术病毒分离技术是指通过某种方式将已感染宿主的病毒分离出来。

病毒分离技术可以帮助确定病毒的种类和性质，为研究病毒的特性提供了基础。

目前病毒分离技术包括细胞接种、动物试验、从环境中筛选等多种方法，其中细胞接种法是应用最为广泛的一种方法。

3、病毒标记技术病毒标记技术是指将一种化合物或标记物分别加入病毒或宿主细胞中，以便观察病毒的生命周期、传播方式及与宿主细胞的相互作用等。

目前常用的病毒标记技术有许多，如放射性同位素标记、荧光标记、荧光素酶标记等。

4、ELISA技术ELISA技术是一种检测技术，可以检测在宿主体内的病毒和病毒感染者的抗体水平。

ELISA技术的原理是将待检样品与特异性抗体或抗原结合，并利用特定的酶光医学物质将酶与蛋白质结合，以获得可见化的信号。

ELISA技术可以研究病毒在生命周期中不同时间点，感染细胞的后续反应，以及细胞道路中的途径和互作。

病毒技术实验报告引言近年来，随着信息技术的快速发展，病毒技术也逐渐成为网络安全领域的研究热点之一。

通过对病毒技术的深入研究，可以加强对现有病毒的分析和防范能力，提高网络安全的水平。

本实验旨在通过深入了解和实践病毒技术，以期对病毒的工作原理、传播途径和防御方法有更全面的认识。

实验目的1.了解病毒的工作原理和分类；2.学习病毒的传播方式和繁殖特性；3.掌握病毒的防御方法和安全措施。

实验步骤1. 病毒的工作原理病毒作为一种恶意软件，其主要功能是通过自我复制和传播感染目标计算机系统，给系统带来破坏和损失。

病毒的工作原理可以分为以下几个步骤：•感染阶段：病毒会通过感染病毒携带者（例如邮件附件、下载文件等）进入目标系统，并在系统中寻找可感染的目标文件；•激活阶段：病毒感染目标文件后，等待触发激活条件，例如特定的日期、时间等；•执行阶段：一旦激活条件满足，病毒会开始执行其恶意功能，例如删除文件、传播自身等。

2. 病毒的分类根据病毒的传播方式和破坏程度，病毒可以分为以下几类：•文件病毒：通过感染可执行文件或系统文件来传播，例如EXE、DLL 等；•宏病毒：通过感染办公软件中的宏来传播，例如Word、Excel等；•蠕虫病毒：通过网络传播，自我复制和传播，例如蠕虫病毒可以通过电子邮件、文件共享等途径感染目标系统；•特洛伊木马：外表看起来正常或有吸引力的程序，但在运行时会执行恶意功能；•广告病毒：通过在用户浏览器中显示广告来获取经济利益。

3. 病毒的传播途径和繁殖特性病毒的传播途径主要有以下几种：•邮件附件：病毒常通过电子邮件附件传播，用户在打开或下载附件时可能被感染；•下载文件：用户在下载可疑的文件时可能会下载并运行病毒；•移动存储设备：病毒可以通过USB闪存驱动器等移动存储设备传播；•网络共享：病毒可以通过共享文件夹在局域网内传播。

病毒的繁殖特性也不尽相同，有的病毒具有自我复制和传播的能力，有的病毒则需要依靠人工操作来传播。

实验一病毒对细胞的感染目的：病毒对细胞的感染具有高度的特异性，通过该实验掌握病毒感染细胞的实验操作，并进一步理解病毒对宿主细胞的选择性。

材料：杆状病毒Sf9细胞器材：25或50mL细胞培养瓶，28℃恒温培养箱，培养基，无菌移液管，电动移液器步骤：1、感染前12h传代接种Sf9细胞，28℃培养至汇聚度约70%；2、弃细胞培养液，并以1×PBS洗涤2-3次，吸干残夜；3、加入适量病毒悬液，并补充适量无血清培养基，28℃孵育2h，更换适量新鲜培养基；同时设立空白对照；4、28℃培养24-48h，对照观察细胞病变。

实验二病毒的扩增与收集目的：病毒属于严格细胞内寄生生物，故只能在其敏感宿主细胞内进行有效增殖。

通过该实验掌握病毒的扩增及收集、储存方法。

材料：杆状病毒Sf9细胞器材：25或50mL细胞培养瓶，28℃恒温培养箱，培养基，无菌移液管，电动移液器、低温高速离心机、离心管，滤器步骤：1、感染前12h传代接种Sf9细胞，28℃培养至汇聚度约70%；2、弃细胞培养液，并以1×PBS洗涤2-3次，吸干残夜；3、加入适量病毒悬液，并补充适量无血清培养基，28℃孵育2h，更换适量新鲜培养基；4、28℃培养24-36h，观察细胞裂解情况；5、吹吸细胞，并转移细胞裂解物至无菌冰预冷离心管；6、4℃，12000rpm,10min，取上清；7、滤器过滤上清，取滤液，分装于无菌冻存管，避光保存于4℃或-20℃或-80℃.实验三病毒的敏感性测定目的：不同类型的病毒对不同理化因子的敏感性存在着显著差异。

本实验拟检测杆状病毒对高温及有机溶剂的敏感性，以加深对病毒理化因子敏感性差异的理解。

材料：杆状病毒Sf9细胞乙醚氯仿器材：25或50mL细胞培养瓶，28℃恒温培养箱，培养基，无菌移液管，电动移液器，水浴锅步骤：1、氯仿预处理：于一定量病毒悬液中加入终浓度为5%的氯仿，混匀，4℃静置1h，2000rpm，10min，取上清备用；同样，取等量病毒不加氯仿于4℃同样处理备用（空白对照）；2、乙醚预处理：于一定量病毒悬液中加入终浓度为20%的乙醚，混匀，4℃静置1h，2000rpm，10min，取下层备用；同样，取等量病毒不加乙醚于4℃同样处理备用（空白对照）；3、高温预处理：取一定量病毒悬液于55℃处理30min后备用；同样，取等量病毒于4℃处理30min备用（空白对照）；4、分别取适量经氯仿、乙醚、高温处理及未处理的病毒悬液感染Sf9细胞；5、28℃培养24-48h，对照观察细胞感染效率。

常规病毒学实验技术常规病毒学实验技术（⼀）病毒的培养实验动物：家兔、⼩⽩⿏、⼤⽩⿏、豚⿏、仓⿏主要⽤于：①分离病毒，并借助感染范围试验鉴定病毒②培养病毒，制造抗原和疫苗③测定各毒株之间的抗原关系，（⽤实验动物作中和试验和交叉保护实验）④制备免疫⾎清和单克隆抗体⑤作病毒感染的实验研究，包括病毒毒⼒测定、建⽴病毒病动物模型等注意：选择对⽬的病毒敏感的实验动物品种品系，以及适宜的接种途径和剂量。

鸡胚（⼀）条件要求SPF鸡、孵化温度38-39℃，湿度40-70%，通风。

新鲜受精卵：产下后不超过10天并保存10℃左右。

（⼆）优点组织分化程度低，可选择不同的⽇龄和接种途径，病毒易于增殖，感染病毒的组织和液体中含有⼤量病毒，容易采集和处理，⽽且来源充⾜，设备和操作简便易⾏。

（三）接种途径1．绒⽑尿囊膜接种（10-12⽇龄鸡胚）主要⽤于痘病毒和疱疹病毒的分离和增殖。

1）⽅法⼀（造⼈⼯⽓室）①在胚胎附近近⽓室处，选择⾎管较少的部位，⽤电烙器在卵壳上烙⼀个直径约3-4mm的烤焦圈。

②⽤碘酊和酒精消毒后，⼩⼼⽤⼑尖撬起卵壳，造成卵窗。

③在⽓室端中央钻⼀个⼩孔。

④⽤针尖挑破卵窗中⼼的壳膜，切勿损伤其下的绒⽑尿囊膜。

⑤滴加滴⽣理盐⽔于刺破处，⽤橡⽪乳头紧贴于⽓室中央⼩孔上吸⽓，造成⽓室内负压，使卵窗部位的绒⽑尿囊膜下陷⽽形成⼈⼯⽓室，此时可见滴于壳膜上的⽣理盐⽔迅速渗⼊。

⑥⽤1ml注射器滴⼊2-3滴接种物于绒⽑尿囊膜上。

⑦⽤透明胶纸封住卵窗，或⽤玻璃纸盖于卵窗中，周围涂上熔化的⽯蜡密封，⽓室中央的⼩孔⽤⽯蜡密封。

⑧鸡胚横卧于卵箱中，不许翻动，保持卵窗向上。

2）⽅法⼆①在⽓室端的卵壳上开约1.5×1.5cm的⼝。

②⽤灭菌眼科镊⼦撕去⼀⼩⽚内壳膜。

③滴⼊接种物。

④⽤透明胶纸封闭开⼝。

2．尿囊腔接种（10-11⽇龄）⽤于正粘病毒和副粘病毒（NDV）1）画出⽓室和胚位2）在⽓室接近胚位处涂沫碘酊和酒精消毒3）⽤钢锥穿⼀⼩孔4）将注射器针头沿此⼩孔插⼊0.5-1cm，注⼊接种物5）⽤⽯蜡封⼝，置孵卵箱中孵育，每天翻卵1-2次3．卵黄囊接种（6-8⽇龄）主要⽤⾍媒病毒以及鹦鹉热⾐原体和⽴克次⽒体等的分离和增殖。

病毒学研究中的重要技术方法病毒学是对病毒进行研究和控制的学科，其研究范围涉及病毒的结构、生物学特性、病理学、免疫学、疫苗与治疗的研究、流行病学调查等多个方面。

为了更好地进行病毒学研究，科学家们不断创新并发展出了许多重要的技术方法。

本文将介绍其中几个重要技术方法。

1. 病毒培养技术病毒培养技术是研究病毒生物学特性、病理学和制备疫苗等研究领域必不可少的技术。

其主要通过在宿主细胞中进行体外培养来进行。

常用的宿主细胞有鸡胚、哺乳动物细胞以及昆虫细胞等。

其中，哺乳动物细胞培养技术在研究人类病毒方面具有极大的应用价值。

通过病毒培养技术，病毒生长繁殖的规律以及影响其繁殖的各种因素都可以研究和控制。

一些病毒在宿主细胞中生长繁殖的特性也可以通过病毒培养技术进行研究。

因此，病毒培养技术是病毒学研究的重要基础技术。

2. 病毒检测技术病毒检测技术是对病毒进行检测和诊断的重要技术。

目前常用的病毒检测技术主要包括免疫学方法、分子生物学方法及电子显微镜技术等。

在病毒学研究中，不论是对研究病毒引起的疾病的发病机理还是对病毒流行病学进行研究，都需要采用病毒检测技术。

3. 病毒分离技术病毒分离技术是病毒学研究中非常重要的技术。

它主要通过对病人样品、动物组织或者其它环境样品进行分离和纯化，从中分离出病毒。

此外，病毒分离技术还可以用于评估疫苗的效力以及研究病毒变异的规律性。

通常的病毒分离技术主要包括细胞传代法、小鼠传代法、囊泡传代法、鸡卵传代法以及临床样品直接分离法等。

在现代病毒学中，主要采用的是细胞传代法。

4. 基因芯片技术近年来，基因芯片技术在病毒学研究中的应用越来越广泛。

这项技术主要基于生物芯片技术、分子生物学技术和计算机技术等。

它将许多基因片段集合在一起制成芯片，通过对样品核酸的杂交实验可以检测到基因相应片段与芯片上的匹配。

基因芯片技术在病毒感染后机体免疫应答、病毒基因特征、宿主基因不同表达情况等方面提供了全面的信息。

因此，基因芯片技术在病毒学研究中扮演着越来越重要的角色。

第五章病毒学检验基本技术第一节病毒的形态结构和化学组成病毒（Virus）是超显微的、无细胞结构的、只含一种核酸(或DNA或RNA)、只能在活细胞内存活的寄生物。

病毒在活细胞外以病毒粒子的形式存在，不能进行代谢和繁殖，不具有生命特征，但一旦进入宿主细胞就具有生命特征。

一病毒的形态大小（一）病毒的形态病毒一般呈球形或杆形，也有呈卵圆形、砖形、丝状和蝌蚪状。

动物病毒多呈球形、卵圆形或砖形，如腺病毒为球状，痘病毒为砖形；植物病毒多呈杆形或丝状，少数为球状，如烟草花叶病毒为丝状，苜蓿花叶病毒为杆状，花椰菜花叶病毒为球状。

细菌病毒即噬菌体多为蝌蚪状，也有为球状和丝状，如大肠杆菌偶数T噬菌体系列为蝌蚪状，大肠杆菌噬菌体fd为丝状（图5-1）。

图5-1 病毒的形态（二）病毒的大小病毒非常微小，以纳米（nm）表示。

较大的痘病毒直径约为300nm，较小的口蹄疫病毒颗粒直径为10～22nm。

二病毒的结构和化学组成及其功能病毒粒子(virion)是指一个结构和功能完整的病毒颗粒。

病毒粒子主要由核酸和蛋白质组成。

核酸位于病毒粒子的中心，构成了病毒的核心或基因组 (genome)，蛋白质包围在核心周围，构成了病毒粒子的衣壳(capsid) 。

核酸和壳体合称为核衣壳(nucleocapsid) ( 见图5-2)。

最简单的病毒就是裸露的核衣壳。

病毒形状往往是由于组成外壳蛋白的亚单位种类不同而致。

此外，在某些病毒的核衣壳外，还有一层囊膜(envelope)结构。

1 核酸核酸是组成各种病毒的核心。

一种病毒只含有一种类型的核酸,即DNA或RNA。

核酸可以是单股的，也可能是双股的；可以是线状的，也可以是环状的。

大多数病毒粒子中只含有一个核酸分子。

少数RNA病毒含两个或两个以上的核酸分子，而且各个分子担负着不同的遗传功能，它们一起构成病毒的基因组，所以这些 RNA 病毒为双组分基因组、三组分基因组或多组分基因组。

病毒核酸(即病毒基因组)储存着病毒的遗传信息，控制着其遗传变异、增殖和对宿主的感染性等。

第三部分 病毒学实验方法病毒是微生物中体积最小的一种，绝大部分在普通光学显微镜下不能看到，需用电子显微镜才可查见。

由于病毒具有严格的寄生性，必须在易感的活组织(细胞)中才能增殖，故通常将其接种于动物(小鼠、家兔及猴等)、鸡胚胎或组织(细胞)中使之增殖，但并非所有标本均需依次接种于动物、鸡胚胎或组织培养中进行病毒的分离鉴定，而是根据具体情况而定。

有些病毒在寄生的细胞内增殖后可导致细胞病变，或可在受感染的细胞内形成形态学上特异的斑块，称为包涵体，此可用普通光学显微镜检视。

病毒性疾病常用的血清学检查法为血凝抑制试验、补体结合试验及中和试验。

近年来，随着科学技术的进展，在原有血清学检查技术的基础上，又建立了具有特异性强且敏感性又较高的新的血清学检测法，如荧光抗体检测技术，酶联免疫检测技术—EILSA及固相放射免疫技术等，在实际工作中，可随检查目的的不同而选不同的方法。

实验十五 病毒感染后的形态学观察一、电子显微镜技术病毒体积微小，不仅肉眼看不见，即使是分辨率最好的光学显微镜也只能看到个别的大病毒。

20世纪30年代初电子显微镜的发明，扩大了人们的视野。

在电子显微镜下，不仅能观察到各种病毒的外观，且可看清其结构。

为了观察病毒与细胞的关系。

一般将接种病毒的组织（细胞）培养固定，包埋后进行超薄切片，染色后进行观察；为观察病毒形态与结构，可用磷钨酸负染法。

(一)磷钨酸负染法磷钨酸负染法是利用重金属盐类溶液处理生物标本，使它在电镜下呈现出良好的反差。

经此种染色处理的生物标本。

在电镜下与正染色相反，观察到的不是亮环境下的黑色物象而是暗背景(重金属染液)下的亮象(物体)。

【材料】(一)病毒悬液。

(二)染液：磷钨酸盐(钠、钾)(三)铜网【方法】(一)用吸管吸取少量病毒悬液，直接滴在铜网上，一般每份标本3-4个铜网。

待3-5 min 后吸去悬液或用小片滤纸吸干。

然后用另一吸管吸染液滴于铜网上，待2-3 min吸去多余染液，待自然干燥后即可进行电镜观察。

第5章病毒检验基本技术第五章病毒检验基本技术一、标本的采集、处理与运送根据临床诊断及病期采集不同的标本，用于病毒学分离和鉴定的标本应在病程初期或急性期采集，要进行预处理才能用于接种和其他方法的检测。

病毒的抵抗力通常较弱，在室温下很快灭活，标本采集后应立即送到病毒实验室，暂时不能检查或分离培养时，应将标本放入冻存液并加入甘油或二甲亚砜（DMSO）并防止反复冻融使病毒灭活，存放在-70℃低温冰箱内保存。

二、病毒的培养条件实验动物、鸡胚以及体外培养的器官和细胞都可以作为人工增殖病毒的基本工具。

而大量病毒的培养，又是病毒学实验研究以及制备疫苗和特异性诊断试剂的先决条件。

1、组织培养病毒在细胞内的增殖及其对细胞的作用，可以根据细胞病变、细胞培养物内出现血凝素或其他病毒抗原、红细胞吸附现象以及通过对“指示病毒”的干扰等方法加以识别。

组织培养用的玻璃器皿要求比较严格，要用硫酸和重铬酸钾溶液浸泡后再清洗应用。

常用于组织培养的人工综合营养液的主要成分有氨基酸、糖类、无机盐、维生素和辅助生长因子等，常用的人工综合营养液为MEM何RPM I 1640.用人工综合营养液配制细胞生长液时需要加入适量血清和谷氨酰胺溶液，还需要加入规定量的抗生素溶液防止细菌污染，加入碳酸氢钠溶液修正pH，根据情况还可加入HEPES溶液可使生长液具有较强的pH缓冲能力。

能使组织和成片细胞分散成单个细胞的化学制剂为胰蛋白酶和EDTA，EDTA使用液又可称之为Versen 溶液，其分散细胞的作用原理是EDTA可以结合钙、镁离子，使组织细胞分散。

动物血清中具有细胞生长所必需的各种营养因子，它能促进细胞的贴壁和生长，具有很强的酸碱缓冲能力。

细胞培养液在细胞培养过程中可分为细胞生长液和细胞维持液两种。

生长液是使细胞发育增殖的液体，因此要求营养条件丰厚；维持液用于延缓细胞代谢，从而延长细胞的存活时间，以利于实验的进行。

这两种液体成分的主要区别是血清含量不同。

病毒学实验技术_病毒学,实验技术,2病毒学实验技术 2 (2)接种和孵育用一支连接7或8号针头的1ml注射器，小心地将针头经内壳膜的裂缝插入，滴加0.1~0.2ml接种物于绒毛尿囊膜上。

严格的操作应在检蛋灯上进行，以保证接种物确实滴在绒毛尿囊膜上，而不是穿透了绒毛尿囊膜。

接种后，将鸡蛋稍行摇动，使接种物均匀扩散于绒毛尿囊膜表面。

蛋壳的开口用一小块橡皮膏封闭。

继续孵育，使蛋壳窗向上。

另一个接种方法可以不开蛋壳窗，方法如下:在已消毒的蛋壳上选好部位钻孔，达内壳膜。

用一6号针头，使针头尖的斜面向下，在钻孔的周围小心地稍稍下压针头，将内壳膜与蛋壳分开。

随后将蛋放在检蛋灯上，并在已经钻好的气室孔上吸气。

当时即可清楚地见到绒毛尿囊膜的塌落。

(3)膜组织的收获将蛋平放，蛋壳窗向上。

用碘酊棉球消毒蛋壳窗周围，撕去橡皮膏。

用灭菌镊子除去周围蛋壳，暴露出绒毛尿囊膜。

用镊子将膜夹住，并用剪刀剪下后迅速移置于一个灭菌平皿内。

因为9或10日龄的鸡胚的绒毛尿囊膜牢固地粘连于内壳膜上，所以一个通用的方法是在鸡胚7、8日龄时就使绒毛尿囊膜塌落，随后继续孵育，直至准备接种时为止。

接种操作需在检蛋灯上进行，以保证此时绒毛尿囊膜不上升，而且接种物确实是放在绒毛尿囊膜上而不是在尿囊腔内。

随后用石蜡-凡士林混合物或橡皮膏封闭蛋壳孔。

此后按第一法所述方法进行孵育和收获。

4.羊膜(Amniotie)接种此法主要用于由咽喉洗嗽液中分离流感病毒。

由于鸡胚在发育过程中吞咽羊水，并将其中所含的病毒携带至呼吸道和肠道组织，病毒主要在这些组织内增殖。

脑脊髓炎病毒也可通过羊水腔途径进行分离。

(1)日龄和准备用7~15日龄的鸡胚，检蛋，确定胚胎位置，随后根据胚胎位置在鸡蛋的侧面、气室上方蛋壳的相应位置上选点并标记。

按常法处理后，象卵黄囊接种那样钻孔。

(2)接种和孵育接种时应用lm1注射器，连接一个长约1.8cm的7号针头。

将蛋平放于检蛋灯上，插入针头，并缓慢地向胚胎方向刺入。

病毒学研究的方法和技术病毒学是研究病毒的学科，主要关注病毒的生物学特性、分类、传播和致病机制。

病毒学的研究方法和技术种类繁多，本文将按照其研究方向和用途进行介绍。

一、病毒分类和鉴定方法病毒分类是研究病毒的基础，也是为寻找针对特定病毒的治疗手段提供重要依据。

常用的病毒分类方法包括形态学分类、生物物理化学分类、分子生物学分类等。

其中最具代表性的是分子生物学分类方法。

该方法通过对病毒遗传物质的DNA或RNA序列进行分析，建立起了病毒系统发育树，依依分类病毒，如爱滋病病毒(HIV)、流感病毒等。

利用PCR扩增技术可以快速鉴定出病毒特异性DNA/RNA序列，为病毒的快速检测和鉴定提供了重要的技术支持。

二、病毒核酸和蛋白质的分离与分析方法分离和分析病毒核酸和蛋白质是研究病毒基因组和蛋白质组成为了进一步探究病毒的生物学特性和致病机制。

常用的方法包括电泳分离、质谱分析、荧光定量PCR等。

其中，电泳分离技术被广泛应用。

根据不同的电泳方式，电泳分离技术可以分为凝胶电泳、毛细管电泳和微流管电泳等。

凝胶电泳主要用于分离病毒核酸和蛋白质；毛细管电泳主要用于分析病毒核酸序列；微流管电泳则可在微量样品中分离和分析病毒核酸和蛋白质。

质谱分析技术主要用于检测病毒蛋白质的质量、结构、组成，提供理论支持和新的治疗靶标；荧光定量PCR则是目前病毒检测中最常用的一种快速检测技术，尤其适用于新型冠状病毒检测。

三、病毒培养和检测方法病毒培养技术是研究病毒生长和复制规律的基础。

通过极端条件下的体外培养，可以从体外获得大量相同的病毒实验体，实现对病毒生物学特性的深入分析以及寻找针对特定病毒的治疗手段的研发。

病毒的检测技术主要分为传统检测和分子检测两大类。

传统检测方法包括免疫荧光技术（IFA）、酶联免疫吸附试验（ELISA）等，主要基于病毒特异性蛋白质或其他病毒成分的检测；分子检测技术则主要利用PCR方法，检测病毒特异性DNA或RNA序列，如RT-PCR、LAMP等。

各实验具体步骤：病毒学实验1.抗体检测：有血凝素（HA）的病毒能凝集人或动物红细胞，称为血凝现象，血凝现象能被相应抗体抑制称为血凝抑制试验，原理是相应抗体与病毒结合后，阻止病毒表面HA与红细胞结合，常用于正粘病毒、副粘病毒及黄病毒等的辅助诊断、流行病调查，也可用于鉴定病毒型与亚型。

疫血凝（HA）及血凝抑制(H1)试验目的意义：1.掌握血凝试验（HA）与血凝抑制试验（HAI）的基本方法；2.了解HA与HI在新城疫病毒及其它病毒诊断和鉴定中的应用。

基本原理：许多病毒表面具血凝素，具有凝集某些动物或人红细胞的特性，称为血凝现象，可用于鉴定病毒。

血凝现象可以被特异性抗体所抑制，称为血凝抑制现象，利用这种特性可进行血清学试验，称为血凝抑制试验。

器材及试剂:待检病毒:鸡新城疫病毒鸡胚尿囊液；待检血清：抗鸡新城疫病病毒阳性血清；生理盐水、1%鸡红细胞、96孔V形微量血凝板、加样器等。

实验步骤：(一)血凝试验（HA）取96孔板，按以下步骤操作：1、第一排1-12孔各加生理盐水25ul，第二排1-12孔加生理盐水25ul为红细胞对照；2、吸25ul病毒液于第一排第1孔，混匀后取25ul至第2孔，依次稀释至第12孔，弃去25ul，3第一排1-12孔及第二排1-12孔各加1%鸡红细胞25ul。

4、室温静置10-30分，观察结果5、结果判定：红细胞对照组红细胞完全沉降，以试验排中能使等量红细胞发生完全凝集的病毒最高稀释倍数，作为病毒的血凝价，即HI效价(二)血凝抑制试验（HI）取一96孔板，按以下步骤操作：1、4个单位抗原的制备：按HA试验测出的病毒血凝价除以4即为4个单位血凝素的稀释度。

（根据学农实验配置4单位抗原，以完全血凝的病毒最高稀释倍数除以4即为含4单位抗原的稀释倍数。

2、待检血清的稀释：第一、二、三排1-12孔各加生理盐水25ul，于第一排第1孔中加入25ul待检血清，反复吹吸3-5次混匀后，取25ul至第2孔混匀，吸取25ul至第3孔，依次稀释至第12孔，弃去25ul，经倍比稀释3、第一、二排1-12孔各加4个单位血凝素25ul，微量震荡器震荡2min混匀；4、室温静置20min；5、第一、二、三排1-12孔各加1%鸡红细胞25ul，微量震荡器震荡2min混匀混匀。

第五章病毒检验基本技术一、标本的采集、处理与运送一、标本采集：采集时间为病程初期或急性期；二、标本的处理：应进行预处理三、标本的运送：1、病毒抵抗力弱，室温会很快灭活，应立即送实验室2、不能立即检测，放入冻存液并加甘油或二甲亚砜（DMSO），并防止反复冻融二、病毒的培养条件培养工具：实验动物、鸡胚、体外培养的器官和细胞一、组织培养病毒在细胞内的增殖及对细胞的作用，可以根据细胞病变、细胞培养物内出现血凝素或其他病毒抗原、红细胞吸附现象及对细胞的作用及通过对“指示病毒”的感染等法加以判断。

1、培养的玻璃器皿的要求：用硫酸和重铬酸钾溶液浸泡清洗后使用2、组织培养的营养液：成分：氨基酸、糖类、无机盐、维生素、辅助因子等常用的人工综合营养液：MEM、RPMI1640。

如用人工综合营养液配制细胞生长液要加如下物质：①、血清（适量）、谷氨酰胺溶液：动物血清含有细胞生长的各种营养因子，促进细胞贴壁和生长，具有很强的酸碱缓冲能力②、规定量的抗生素：防止细菌污染③、NaHCO3修正PH④、HEPES溶液（根据情况加入）:可使生长液具有较强的PH缓冲能力⑤、胰蛋白酶和EDTA溶液：使组织和成片细胞分散成单个细胞。

EDTA溶液又称为Versen溶液3、细胞培养液可分为细胞生长液（发育生长，营养丰厚）和细胞维持液（延缓代谢）生长液和维持液的区别：血清含量不同4、PH：7.2-7.65、全过程的技术关键：防止污染二、细胞株的保存含10%二甲亚砜的血清可作为悬浮细胞的液体在液氮中保存细胞三、使用的细胞类型：原代细胞、二倍体细胞、传代细胞注：原代细胞核传代细胞的区别是是否能在体外无限传代四、细胞的纯化：细胞克隆技术三、病毒的常规实验室诊断一、病毒的分离与鉴定1、病毒增殖的判定2、细胞病变（CPE）:CPE的表现为细胞破坏、肿大、融合成合胞体、无明显变化等。

CPE常具有病毒种的特性，因此常作为病毒鉴定标准之一。

3、病毒蚀斑技术（空斑）：病毒在已长成的单层细胞上形成的局限性病灶。