骨髓间充质干细胞治疗大鼠骨关节炎的实验研究

骨髓间充质干细胞对大鼠佐剂性关节炎防治的实验研究许键炜;申长清;赵芳芳;舒莉萍;何志旭【摘要】目的：探讨骨髓间充质干细胞（MSCs）对大鼠佐剂性关节炎（AA）的治疗、干预作用。

方法收集培养扩增SD大鼠骨髓MSCs。

SD大鼠注射弗氏完全佐剂造模之后行MSCs治疗及干预。

造模后定期测量大鼠体质量、踝关节周长和后足爪体积。

治疗后第21天，行四肢关节X线片及病理检查。

结果模型大鼠经M SCs治疗后关节肿胀减轻，X线片示骨质破坏明显修复。

病理HE染色见关节滑膜病变减轻。

干预组经MSCs治疗，原发性炎症和继发病变均不明显，关节X线片和病理检查均未见明显异常，与模型组大鼠相比，体质量、足爪体积以及踝关节周长差异有统计学意义（P＜0．05）。

结论 MSCs治疗可有效减轻并逆转弗氏完全佐剂诱导的大鼠AA的进展。

%Objective To explore the mechanisms of action about how marrow mesenchymal stem cells (MSCs) treat and inter-vene the adjuvant arthritis (AA) of rats .Methods MSCs of SD rats which had been cultured and cloned would be collected .Fre-und′s complete adjuvant was administered in rats .The rats from the model group were given MSCs treatment and intervention .Dur-ing the treatmentperiod ,those rats′ weights ,ankle circumferences and hind paw volumes were measured .On the 21st day of the treatment ,limb-joints X-ray examination and pathological examination were taken .Results After using MSCs to treat adjuvant ar-thritis of rats ,the joint swelling of the MSCs group were relieved ,and the limb-joints X-ray showed the destructive bones had ap-parent restoration .Pathological microscopic examination of HE staining ankle joint showed joint synovial lesions significantly reduced .In the MSCs intervention group ,rats′primary inflammation and secondary lesions were not obvious ,meanwhile ,joint X-ray and pathological examination showed no obvious abnormalities .Compared with the model group ,the differences of rats′weight ,paw volume and ankle circ-umference had statistically significant (P<0 .05) .Conclusion MSCs could relieve and reverse the progression of AA .【期刊名称】《重庆医学》【年(卷),期】2013(000)029【总页数】4页(P3472-3475)【关键词】骨髓间充质干细胞;关节炎 ,实验性;治疗;预防【作者】许键炜;申长清;赵芳芳;舒莉萍;何志旭【作者单位】贵阳医学院药理学教研室 550004;济宁医学院附属医院儿科，山东济宁272029;蚌埠医学院微生物学教研室，安徽蚌埠233030;贵阳医学院组织工程与干细胞实验中心 550004;贵阳医学院组织工程与干细胞实验中心 550004【正文语种】中文类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一类以关节滑膜炎及对称性、破坏性的关节病变为主要特征的慢性全身性自身免疫性疾病［1］。

2021年 06月第18卷第3期生物骨科材料与临床研究O rthobaedic B iomechanics M aterials A nd C linical S tudy.87.doi: 10.3969念issn. 1672-5972.2021.03.017文章编号：swgk2019-12-00260间充质干细胞治疗骨关节炎的临床研究进展**基金项目：国家重点研发计划（2017YFC1103904）作者单位:1昆明医科大学研究生院，云南昆明,650500； 2联勤保障部队第九 二O 医院骨科，云南昆明,650032唐文宝I 谭洪波2周田华2*徐永清$［摘要］骨关节炎（OA ）是一种进展性疾病，表现为软骨缺损、滑膜炎症、软骨下骨硬化及骨赘形成，关节表面软骨再生能力弱，无法实现自我修复。

骨关节炎患者的主要临床表现为疼痛和关节活动受限，肢体功能和生活质量受影响。

理想的治疗方案应缓解疼痛、促进软骨修复，以延缓或阻止病程进展。

间充质干细胞（MSCs ）在 治疗骨关节炎方面具备以上优势且无严重并发症。

故现对几种间充质干细胞治疗骨关节炎临床研究进展进行综述。

［关键词］间充质干细胞；骨关节炎；关节软骨；临床研究［中图分类号］R684.3 ［文献标识码］AProgress of clinical research on mesenchymal stem cells in the treatment of osteoarthritis: A reviewTang Wenbao', Tan Hongbo 2, Zhou Tianhua 2, Xu Yongqing 2. 1 Postgraduate D epartment, Kunming M edical University, Kunming Yuiman, 650500; 2 Department of Orthopedic Surgery, 920th Hospital of Joint Logistics Support Force, Kunming Yunnan, 650032, China[Abstract] Osteoarthritis is a progressive disease, which is characterized by cartilage defect, synovial inflammation,subchondral bone sclerosis and osteophyte formation. Articular cartilage, owning to its limited regeneration ability,cannot achieve self-repair. The cardinal symptoms of osteoarthritis are pain, limited joint movement, limb function and quality of l ife. The ideal treatment should relieve pain and promote cartilage repair to delay or prevent the progress of t hedisease. Mesenchymal stem cells have the above advantages in the treatment of osteoarthritis without serious complications.This paper reviews the clinical research progress of several mesenchymal stem cells in the treatment of osteoarthritis.[Key words] Mesenchymal stem cells; Osteoarthritis; Articular cartilage; Clinical trials骨关节炎（osteoarthritis, OA ）临床表现为疼痛、活动 度受限、活动时捻发音、关节不稳及肿胀等叫预计到2032 年，45岁以上人群中30%患有OA 叭OA 可影响患者的肢体功能及生活质量，在发达国家，用于OA 的治疗费用可达 国内生产总值的2.5% ［3］o人工关节假体置换术是治疗晚期OA 的金标准，但假体 使用寿命有限且术后会产生诸多并发症［41o 故应注重OA 的 早中期治疗，理想的治疗方案是改善患者的临床症状并促进软骨再生。

骨髓间充质干细胞在重度烧伤大鼠心肌损伤中的保护作用牟欢;刘洋;李俊杰;刘剑;周新立;强廷会;杜兴国;马平【摘要】目的探讨骨髓间充质干细胞(BMSCs)对严重烫伤大鼠心肌的保护作用及作用机制.方法①取10只健康雄性SD大鼠,采用全骨髓贴壁法体外分离大鼠BMSCs,流式细胞仪检测细胞表面分子标志物.②24只健康雄性SD大鼠,随机分为:对照组、模型组、治疗组.模型组及治疗组大鼠背部暴露于95℃热水浴18s造成30％TBSAⅢ度烫伤,对照组暴露于37℃水浴18s.水浴后即刻模型组及治疗组大鼠分别腹腔注射生理盐水10 mL(50 mL/kg),水浴后3h模型组经尾静脉注射100 μL 生理盐水,治疗组经尾静脉注射100 μL(2.5× 107/mL) BM-SCs.处理后48 h收集3组大鼠心脏组织标本及腹主动脉血,ELISA法检测血清肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)含量,实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-PCR)法检测心脏组织中炎性细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-10及凋亡相关分子caspase-3、Bcl-2、Bax的mRNA表达水平.结果流式细胞术检测提示,所培养的BMSCs表达CD44、CD90、CD105的阳性率分别为96.8％、99.72％、95.93％,而CD34、CD45阳性率分别为1.42％、2.17％;模型组大鼠血清CK、LDH含量显著高于对照组(P＜0.05).治疗组CK、LDH含量显著低于模型组(P＜0.05).模型组大鼠心脏组织中caspase-3、Bax 的mRNA表达量显著高于对照组(P＜0.05).治疗组大鼠心脏组织中caspase-3、Bax的mRNA表达量显著低于模型组(P＜0.05).模型组大鼠心脏组织中Bcl-2的mRNA表达量为显著低于对照组(P＜0.05);治疗组大鼠心脏组织中Bcl-2的mRNA表达量显著高于对照组(P＜0.05).模型组大鼠心脏组织中TNF-α、IL-1β的mRNA表达量显著高于对照组(P＜0.05).治疗组大鼠心脏组织中IL-1β、TNF-α的mRNA表达量显著低于模型组(P＜ 0.05).模型组大鼠心脏组织中IL-10的mRNA 表达量显著低于对照组(P＜0.05);治疗组大鼠心脏组织中IL-10的mRNA表达量显著高于模型组(P＜0.05).结论 BMSCs可显著降低烧伤后大鼠CK、LDH水平,减轻心肌组织损伤,减少心肌细胞凋亡,降低炎性因子IL-1β和TNF-α表达、促进抑炎因子IL-10的表达,对严重烧伤大鼠心肌具有保护作用.%Objective To explorethe effects and related mechanism of bone marrow stromal stem cells (BMSCs) on protecting rats myocardial injury induced by severeburns.Methods (①)Ten healthy male SD (Sprague-Dawley)rats were usedto separate BMSCs through whole bone marrow adherent.The biological markers were assayed with flowcytometry.②)Twenty-four healthy male SD rats were randomly divided into control group,model group and treatment group.Except for control group,abdominal skin of rats were exposed to 95℃ water for 18 seconds which led to the third degree,30％ TBSA burns while the rats in control group were exposed to 37℃ water for 18 seconds.Ratsin burn model group and treatment group were given 10 mL(50 mL/kg) saline intraperitoneally immediately after burns.Three hours later,Saline (100 μL)or BMSCs (100 μL,2.5×107/mL) were given through caudalvein.Forty-eight later,rats were sacrificed and the myocardium and blood from aorta abdominalis were collected.The expression levelsof ereatine kinase (CK),lactic dehydrogenase (LDH) were detected by ELISA.The mRNA level of caspase-3,Bcl-2,Bax,TNF-α,IL-1βand IL-10 were detected by RT-PCR.Results The positive rates of CD44,CD90,CD105 were 96.8％,99.72％and 95.93％ separately in BMSCs.However,the positive rates of CD34 and CD45 were 1.42％ and 2.17％ separately.The expression level of CK and LDH in rats in model group were significantly higher than that in control group (P ＜ 0.05).The expression level of CK and LDH in treatment groupwere higher than those in control group (P ＜ 0.05).The mRNA level of caspase-3 and Bax in the myocardium in treatment group were significantly decreased compared with control group (P ＜ 0.05).The mRNA level of Bcl-2 in myocardium of treatment group was higher than that in control group (P ＜ 0.05).The mRNA levels of TNF-α and IL-1β in model group were higher than that in control group (P ＜ 0.05).However,in treatment group,these two were lower than in the model group (P ＜0.05).The mRNA level of IL-10 was significantly lower than that in control group (P ＜ 0.05).While in treatment group,the mRNA level of IL-10 was significantly higher than that in model group (P ＜ 0.05).Conclusion BMSCs could protect against myocardial injury induced by severe burns.The expression of CK and LDH decreased,indicating that the injury of myocardial decreased.During which,the inflammatory factors,IL-1β and TNF-α decreased and anti-inflammatory factor IL-10 increased.【期刊名称】《中国医药导报》【年(卷),期】2017(014)012【总页数】5页(P12-16)【关键词】烧伤;心肌损伤;细胞凋亡;骨髓间充质干细胞【作者】牟欢;刘洋;李俊杰;刘剑;周新立;强廷会;杜兴国;马平【作者单位】陕西省汉中市中心医院骨关节外科一病区,陕西汉中723000;第四军医大学附属西京医院全军烧伤中心,陕西西安710032;第四军医大学附属西京医院急诊科,陕西西安710032;第四军医大学附属西京医院神经外科,陕西西安710032;陕西省汉中市中心医院骨关节外科一病区,陕西汉中723000;陕西省汉中市中心医院骨关节外科一病区,陕西汉中723000;陕西省汉中市中心医院骨关节外科一病区,陕西汉中723000;陕西省榆林市中医医院烧伤整形外科,陕西榆林719000【正文语种】中文【中图分类】R644严重烧伤患者早期即存在缺血缺氧性心肌损害，导致心功能减退[1-2] ，炎性反应、细胞凋亡等因素与严重烧伤早期心肌细胞损害密切相关。

·综述·间充质干细胞治疗骨关节炎的研究进展与展望贺曦吕红斌【摘要】骨关节炎是最常见的关节疾病之一，其病理呈现出关节软骨退变、软骨下骨重塑、关节间隙变窄及边缘骨赘增生的过程。

本文综述了近年来用于骨关节炎治疗的间充质干细胞（mesenchymalstem cells,MSCs）的来源及特性、动物实验及临床试验方面的进展，介绍了MSCs治疗骨关节炎及关节软骨缺损的优势，总结了目前MSCs治疗骨关节炎的现状及局限性，提示MSCs治疗骨关节炎是一项应用前景广阔的技术。

【关键词】骨关节炎；间充质干细胞；研究进展骨关节炎（osteoarthritis,OA）是最常见的关节疾病之一，其病程主要表现为关节软骨退变、软骨下骨重塑、关节间隙变窄以及边缘骨赘增生，并最终发展为关节功能障碍的过程［1］。

目前，OA是老年人中最常见的活动障碍原因之一，随着老年人口增多，OA的发病人数逐年上升。

然而，目前临床上关于OA的治疗却远远未取得令人满意的效果，对OA的干预主要是应用非甾体类抗炎药、激素等控制关节内炎症，减少疼痛，应用透明质酸［2⁃4］，进行康复性训练等。

这些保守治疗方式并不能修复关节软骨。

关节软骨作为一种无血管组织，其自身修复潜能低下［5］，关节镜下微骨折手术只适用于小到中型的软骨缺损，且其术后关节炎的控制并不理想，所修复的软骨也会在数年内退变［6］。

骨软骨移植虽然也能减轻疼痛，但远期效果并不理想［7，8］。

尽管自体骨软骨细胞移植或基质诱导骨软骨细胞移植可能获得较好的远期效果，但因其在培养过程中会加速细胞衰老和去分化，所以对于老年膝关节OA病人并不是常规建议的治疗方式［8，9］。

因此，鉴于供区损害、软骨细胞的去分化以及侵袭性操作等问题，对新的OA治疗方案的需求迫在眉睫。

干细胞治疗成为再生医学领域的热门。

从人体很多组织，包括骨髓、脂肪组织、脐带血、滑膜等都能分离出相当数量的间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）［10］，这成为软骨组织工程学中最有希望的祖细胞来源，是治疗OA的热点。

膝关节腔内注射Sox9转染骨髓间充质干细胞修复膝关节骨关节炎卓群豪;张伟娜;李舰;王红卫;郑峰;应彬彬【摘要】BACKGROUND:Bone marrow mesenchymal stem cel s are considered to have good proliferation and&nbsp;differentiation potentials. Sox9 is a transcription factor that is essential for chondrogenesis and has been termed as a“master regulator”of the chondrocyte phenotype. OBJECTIVE:To study the therapeutic effects of Sox9-transfected bone marrow mesenchymal stem cel s on knee osteoarthritis. METHODS:The bone marrow mesenchymal stem cel s were transfected with Lenti-Sox9-EGFP in vitro. The model of murine knee osteoarthritis was established by cutting off the anterior cruciate ligament. Thirty model mice were randomly divided into three groups, as normal saline group, bone mesenchymal stem cel group and Sox9-transfected bone mesenchymal stem cel group. 0.1 mL of normal saline, 0.1 mL of normal saline containing non-transfected bone marrow mesenchymal cel s (non-transfected group), or 0.1 mL of normal saline containing Sox9-transfected bone marrow mesenchymal cel s (Sox9-transfected group) was injected into the knee joint cavity of mice in the corresponding group, respectively. After 4, 8, 12 weeks, the repair of articular cartilage lesions was evaluated by toluidine blue and immunohistochemical staining. RESULTS AND CONCLUSION:The lesions of articular cartilage were more serious in the normal saline group, compared with the other two groups, and the difference became moreobvious over time. Damaged articular cartilage was improved in the non-transfected group, but the improvement was less than that in the Sox9-transfected group. Immunohistochemistry staining revealed that in theSox9-transfected group, the positive type II col agen expression was stronger than that in the other two groups, but this positive expression was decreased over time in al the three groups. These results suggest that Sox9-transfected bone marrow mesenchymal stem cel s promote the repair of damaged cartilage in mice with knee osteoarthritis.%背景：相关研究认为，骨髓间充质干细胞具有良好的增殖及分化能力，Sox9转录因子在软骨形成及维持软骨细胞表型方面起关键作用。

大鼠骨髓间充质干细胞的培养与鉴定干细胞研究一直是生物医学领域的前沿热点，其中骨髓间充质干细胞（BMSCs）因其具有多向分化潜能和低免疫原性而备受。

在众多研究中，大鼠BMSCs的体外培养和鉴定方法为其在科研和临床领域的应用提供了基础。

本文将就大鼠BMSCs的培养、鉴定方法进行详细介绍，并结合实验数据进行阐述。

BMSCs是一种成体干细胞，具有自我更新和多向分化潜能，可以分化为多种细胞类型，如成骨细胞、脂肪细胞、肌肉细胞等。

因其来源广泛，免疫原性低，大鼠BMSCs已成为再生医学、免疫调节等领域的重要研究对象。

近年来，随着生物技术的不断发展，BMSCs的培养和鉴定方法也得到了不断优化和改进。

BMSCs的培养需要无菌环境，常用的培养基为DMEM、F12等，添加适量的生长因子和抗生素以维持细胞的生长和存活。

细胞的鉴定主要包括形态学观察、表面标志物检测和多向分化潜能的证实。

其中，表面标志物如CDCD90等可用来区分BMSCs和其他细胞，多向分化潜能的证实包括成骨、成脂和成肌等方向的诱导分化。

本实验采用大鼠BMSCs的常规体外培养方法。

具体步骤如下：采集大鼠骨髓：在无菌环境下，用注射器抽取大鼠股骨和胫骨骨髓，加入肝素抗凝。

细胞分离：将采集的骨髓用密度梯度离心法分离出单个核细胞。

细胞培养：将单个核细胞接种于培养瓶中，用含10%血清、1%抗生素和1%谷氨酰胺的培养基培养。

细胞鉴定：经过约7-10天的培养，细胞达到80%-90%融合时，进行细胞鉴定。

通过形态学观察、表面标志物检测和多向分化潜能的证实，对BMSCs进行鉴定。

通过观察细胞的形态和生长情况，发现培养的BMSCs呈典型的长梭形，且细胞间连接紧密（图1）。

经表面标志物检测，BMSCs表达CD29和CD90等间充质干细胞表面标志物（图2）。

在多向分化潜能的证实中，我们发现BMSCs经成骨、成脂和成肌诱导后，可分别形成矿化结节、脂肪滴和肌纤维（图3）。

这些结果说明所培养的细胞为BMSCs。

间充质干细胞来源外泌体治疗骨关节炎的研究进展刘文彬摘要：骨性关节炎（OA ）是一种最常见的关节退行性疾病，其病理变化主要是细胞炎症介导的软骨细胞凋亡和软骨细胞外基质（ECM ）降解。

由于间充质干细胞（MSC ）在特定条件培养基诱导下可以分化为软骨细胞，基于此，MSC 细胞疗法给OA 的治疗带来了新的希望。

然而，MSC 细胞疗法在技术上存在局限性，包括MSC 扩增时去分化，注射后再生效率降低，以及大规模细胞生产时质量控制不一致。

为了克服这些缺点，学者探讨了基于MSC 外泌体介导的软骨组织再生。

由于MSC 的外泌体为细胞间的通讯载体，能在细胞间传递脂质、核酸以及蛋白质等生物活性分子，因此可以作为治疗OA 的替代疗法。

近期的一系列体内研究表明，给予MSC 来源外泌体可有效减少软骨细胞中炎症细胞因子的产生，增加软骨ECM 成分的表达，最终增强软骨组织再生。

因此，本综述通过检索文献对MSC 来源外泌体治疗OA 的研究进展进行综述，为OA 的治疗提供新的思路。

关键词： 间充质干细胞；外泌体；骨性关节炎中图分类号：R684.3 文献标识码：A 文章编号：1007-6948（2021）03-0545-04doi ：10.3969/j.issn.1007-6948.2021.03.036软骨组织是一种具有弹性的结缔组织，由透明质酸、胶原纤维、蛋白多糖和软骨细胞组成。

软骨组织无血管及神经结构。

这些结构特征往往限制了软骨中氧气和营养物质的充足供应，从而限制了受损软骨组织的有效再生[1-2]。

因此软骨组织在创伤、持续负重后易发生骨性关节炎（osteoarthritis, OA ）[3-4]。

目前，OA 的发病机制尚不明确。

因此，针对OA 的治疗尚无有效的治疗手段。

目前，OA 的治疗方法主要包括：关节镜清理术、截骨畸形矫正术、单髁表面置换术和全膝关节表面置换术。

这些手段往往存在外源植入物感染、植入物或组织替代物寿命短、需要二次手术、新形成组织与天然软骨界面不一致等 缺点[5]。

大鼠的骨髓间充质干细胞提取第一步，SD大鼠麻醉处死，75%乙醇皮肤消毒，无菌条件下迅速剪开两侧后肢皮肤及肌肉，取股骨及胫骨，浸泡在PBS中。

心得体会：①鼠龄4周，重量在160-200g之间的雄性SD大鼠。

老鼠太老了，骨髓都分化的太厉害，没有年幼老鼠的骨髓这么有活力。

雌的也行，但是雌的比较厉害，咬人。

Wistar 大鼠行不行，也行，但是就品种而言，SD的生存力更强大。

②我个人认为引颈处死不人道。

麻醉药品为氯胺酮、安定、阿托品各一支混到一起，腹腔麻醉，保证30秒老鼠躺倒，安乐死。

如果你水平够高，可以直接用注射器抽取心脏内的血液，可以减少手术中老鼠出血较多而影响术野不清的问题。

③老鼠的两支前肢取下来也行，但老鼠太小，前肢更小，如果你的确需要大量的细胞取下来也无妨。

浸泡的15ml的一次性离心管中（也可以用培养皿），管中提前加好含有青链霉素的PBS 10ml就行了，青链霉素的浓度为500U／ml，这样是区别于生长液中青链霉素浓度，组织抑菌是200-500U／ml，生长液抑菌是20-100U／ml。

就当初步的消毒吧！④整个手术过程要快，一般控制在20分钟之内，时间长了，骨髓会凝，不利于后期的冲洗。

老鼠浑身都是宝，可以叫上研究脂肪的，嗅鞘的，心肌的其他人员一起来，把剩下不要的老鼠尸体给别人，做实验要巧花钱。

一般老鼠一条腿的一根股骨就够种在一个60mm的皿里了，具体根据个人经验而言。

第二步，⑴将装有骨头的离心管置于紫外线下消毒30分钟后移至超净台，倒掉PBS后，再用含青链霉素的PBS清洗骨头三遍。

⑵去掉骨头两侧的骨骺端，暴露出骨髓腔，用5ml的一次性注射器吸取5.2ml的细胞生长液，用针头插到骨头的一端冲洗，然后换另一端接着冲。

将骨髓冲出的细胞生长液至60mm 培养皿中（皿最好倾斜45度），冲洗数次直至将绝大部分骨髓冲出。

⑶换1ml注射器的针头，反复在培养皿中吹吸细胞悬液2-3次后再全部吸到无菌容器中，大约此时的细胞悬液为5ml。