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间充质干细胞培养方法1、间充质干细胞MSＣ基本形态2、干细胞应用与干细胞调控。
3、间充质干细胞MSC生长过程４、间充质干细胞MSC培养得合适气体环境5、细胞培养板得选择7、如何维持培养液p Ｈ６、如何选用细胞培养基ﻫ8、血清与干细胞得培养ﻫ9、胎牛血清（F B S )就是否需要灭活ﻫ1０、细胞得细菌、真菌污染及排除ﻫ１1、细胞培养污染得预防１2、使用胰蛋白酶时加入 E DTA得目得就是什么13、胶原酶得种类与选型ﻫ1４、胶原酶V S胰酶ﻫ1５、干细胞得种类与表面标记１6、间质干细胞培养原理概述ﻫ17、间质干细胞成脂与成骨诱导分化ﻫ1８、干细胞老化得表现20、冷冻保护剂作用与选择ﻫ21、细胞冻存指导19、细胞传代消化过程指导ﻫ与处理ﻫ22、干细胞冷冻与复苏23、移植细胞得基因修饰ﻫ1。
间充质干细胞MSＣ基本形态ﻫ体外培养细胞根据它们在培养器皿就是否能贴附于支持物上生长特征，可分为贴附型生长细胞，常表现为成纤维型细胞与上皮细胞。
悬浮型细胞在培养中悬浮生长.ﻫ间充质干细胞MSC基本形态：形态与成纤维细胞类似,细胞在支持物表面呈梭形或不规则三角形生长,细胞中央有卵圆形核，胞质向外伸出2－3厘米个长短不同得突起。
可瞧到细胞成螺旋状生长。
ﻫ2．干细胞应用与干细胞调控干细胞得调控就是指给出适当得因子条件，对干细胞得增殖与分化进行调控,使之向指定得方向发ﻫ２、１内源性调控展.ﻫ干细胞自身有许多调控因子可对外界信号起反应从而调节其增殖与分化，包括调节细胞不对称分裂得蛋白，控制基因表达得核因子等。
另外,干细胞在终末分化之前所进行得分裂次数也受到细胞内调控因子得制约。
（1)胞内蛋白对干细胞分裂得调控ﻫ干细胞分裂可能产生新得干细胞或分化得功能细胞。
这种分化得不对称就是由于细胞本身成分得不均等分配与周围环境得作用造成得.细胞得结构蛋白，特别就是细胞骨架成分对细胞得发育非常重要。
如在果蝇卵巢中,调控干细胞不对称分裂得就是一种称为收缩体得细胞器，包含有许多调节蛋白，如膜收缩蛋白与细胞周期素A。
小鼠骨髓间充质干细胞分离培养方法的建立
于美娟;张雅妮;冯善伟;熊符;张成
【期刊名称】《解剖学研究》
【年(卷),期】2009(31)6
【摘要】目的建立培养小鼠骨髓间充质干细胞(none mesenchymal stem cells,BMSCs)的分离培养方法。
方法采用全骨髓体外分离并采用差速贴壁法纯化扩增C57BL/6小鼠BMSCs,形态学观察细胞生长情况,流式细胞仪检测其表面抗原情况并观察其多项分化潜能。
结果使用该方法纯化扩增的BMSCs形态均一,生长良好,表达CD29、CD44和Sca-1,不表达CD11b、CD45和CD34,并具有成骨成脂潜能。
结论通过全骨髓贴壁法可以成功的分离培养出小鼠BMSCs。
【总页数】4页(P424-427)
【关键词】骨髓间充质干细胞;小鼠;细胞培养;鉴定
【作者】于美娟;张雅妮;冯善伟;熊符;张成
【作者单位】广州医学院第二附属医院广州医学院神经科学研究所;中山大学附属第一医院神经科
【正文语种】中文
【中图分类】R378.2;R329.2
【相关文献】
1.小鼠骨髓间充质干细胞的体外分离培养和鉴定方法学探讨 [J], 银广悦;陈素萍;丁俊丽;张继领;刘继勇;张龙;张明
2.小鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养新方法 [J], 徐丽娟;张云巍;王淑芳;阎丽
3.C57/BL6小鼠骨髓间充质干细胞分离培养方法的改良和鉴定 [J], 夏宇;盛瑾;朱铠;过常发;王春生
4.建立ICR小鼠骨髓间充质干细胞的体外分离培养及鉴定方法 [J], 杨玉彦;王录美;孙铭学;裴志鹏;冯雍炜;赵杰;肖凯
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2003年8月，为给大家提供一个网上交流干细胞研究经验的平台，我们干细胞版设立了骨髓间充质干细胞培养讨论区，经过近三个月的讨论学习，我们既学习丰富了自己的知识体系，也对间充质干细胞尤其是分离培养方面有了更为翔实的认识，为了大家阅读的方便，我们决定把本版中的相关内容，同时参考部分书目和文献，做一总结。
一、骨髓间充质干细胞的分离目前常用的分离MSC的方法有全骨髓法和密度梯度离心法，全骨髓法即根据干细胞贴壁特性，定期换液除去不贴壁细胞，从而达到纯化MSC的目的。
密度梯度离心法即根据骨髓中细胞成分比重的不同，提取单核细胞进行贴壁培养。
随着对MSC表面抗原认识的深入，有人利用免疫方法如流式细胞仪法、免疫磁珠法等对其进行分离纯化，但经过流式或磁珠分选后的细胞出现了增殖缓慢等一些问题，加之耗费较大和技术的难度，在某种程度上限制了这些方法的广泛应用。
1. 直接培养法（全骨髓培养法）1987年，Friedenstein等发现在塑料培养皿中培养的贴壁的骨髓单个核细胞在一定条件下可分化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞和成肌细胞，而且这些细胞扩增2 0-30代后仍能保持其多向分化潜能，这类细胞即为骨髓间充质干细胞（BMSC），其工作对今后MSC的研究具有重要意义，不仅证实了骨髓MSC的存在，而且创建了一种体外分离和培养MSC的简便可行的方法，得到了广泛的应用。
culture-spirit采用直接贴壁法，24-36小时首次换液，换液时用PBS洗两次，7 -10天传第一代，以后2-3天传代。
培养基采用Hyclone的DMEM/F-12（1:1），血清是天津TBD的FBS（顶级），得到了较好的培养结果。
布兰卡根据自己培养大鼠MSC的经验，详细介绍了实验步骤：（1）接种后60-80分钟，换液去除悬浮细胞（2）原代培养24h,48h各换液一次（3）观察细胞情况，在原代培养7天左右时，如观察到成片的典型形态的细胞，在瓶底用Marker笔标记，0.25%胰酶消化，镜下观察控制，约5-10分钟（室温太低时应放置到孵箱中），加入全培养基终止消化，瓶体朝上，吸管轻轻吹打4-8分钟，尤其是标记部位。
ａｎｄｉｎｖａｓｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓ［Ｊ］．ＭｏｌＣａｎｃ ｅｒＴｈｅｒ，２００８，７（５）：１１８５ １１９４．［６］ ＮｏｇｕｃｈｉＳ，ＳｈｉｂｕｔａｎｉＳ，ＦｕｋｕｓｈｉｍａＫ，ｅｔａｌ．Ｂｏｓｕｔｉｎｉｂ，ａｎＳＲＣｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ｉｎｄｕｃｅｓｃａｓｐａｓｅ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｃｅｌｌｄｅａｔｈａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎｏｆｌｙｓｏｓｏｍａｌｍｅｍｂｒａｎｅｓｉｎｍｅｌａｎｏｍａｃｅｌｌｓ．［Ｊ］．ＶｅｔＣｏｍｐＯｎｃｏｌ，２０１８，１６（１）：６９ ７６．［７］ ＭａｅｓＨ，ＲｕｂｉｏＮ，ＧａｒｇＡＤｅｔａｌ．Ａｕｔｏｐｈａｇｙ：ｓｈａｐｉｎｇｔｈｅｔｕｍｏｒｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｎｄｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｒｅｓｐｏｎｓｅ［Ｊ］．ＴｒｅｎｄｓＭｏｌＭｅｄ，２０１３，１９（７）：４２８ ４４６．［８］ ＮａｇａｙａｍａＹ，ＺｈａｏＯ．Ａｕｔｏｐｈａｇｙａｎｄｔｈｙｒｏｉｄｃａｎｃｅｒ［Ｊ］．ＪＣａｎｃｅｒＭｅｔａｓｔＴｒｅａｔ，２０２１，７（１）：８１ ９６．［９］ ＢｉｅｅｒｋｅｈａｚｈｉＳ，ＣｈｅｎＺ，ＺｈａｏＹ，ｅｔａｌ．ＮｏｖｅｌＳｒｃ／Ａｂｌｔｙｒｏｓｉｎｅｋｉｎａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｂｏｓｕｔｉｎｉｂｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏ ｍａｇｒｏｗｔｈｖｉａｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇＳｒｃ／Ａｂｌｓｉｇｎａｌｉｎｇ［Ｊ］．Ｏｎｃｏｔａｒ ｇｅｔ，２０１７，８（１）：１４６９ １４８０．［１０］ＴａｎＤＳ，ＨａａｌａｎｄＢ，ＧａｎＪ，ｅｔａｌ．Ｂｏｓｕｔｉｎｉｂｉｎｈｉｂｉｔｓｍｉｇｒａｔｉｏｎａｎｄｉｎｖａｓｉｏｎｖｉａａｃｋ１ｉｎｋｒａｓｍｕｔａｎｔｎｏｎ ｓｍａｌｌｃｅｌｌｌｕｎｇｃａｎｃｅｒ［Ｊ］．ＭｏｌＣａｎｃｅｒ，１３，１（２０１４ ０１ ２４），２０１４，１３（１）：１３．［１１］ＫｉｍＷＧ，ＧｕｉｇｏｎＣＪ，ＦｏｚｚａｔｔｉＬ，ｅｔａｌ．ＳＫＩ ６０６，ａｎＳｒｃｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ｒｅｄｕｃｅｓｔｕｍｏｒｇｒｏｗｔｈ，ｉｎｖａｓｉｏｎ，ａｎｄｄｉｓｔａｎｔｍｅｔａｓｔａｓｉｓｉｎａｍｏｕｓｅｍｏｄｅｌｏｆｔｈｙｒｏｉｄｃａｎｃｅｒ［Ｊ］．ＣｌｉｎＣａｎｃｅｒＲｅｓ，２０１２，１８（５）：１２８１ １２９０．［１２］ＫａｚａｋｏｖａＤ，ＳｈｉｍａｍｕｒａＭ，ＫｕｒａｓｈｉｇｅＴ，ｅｔａｌ．Ｒｅ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｒｏｌｅｏｆａｕｔｏｐｈａｇｙｉｎｔｈｙｒｏｉｄｃａｎｃｅｒｔｒｅａｔ ｍｅｎｔ［Ｊ］．ＥｎｄｏｃｒＪ，２０２２，６９（７）：８４７ ８６２．［１３］ＫａｔｈｅｄｅｒＮＳ，ＫｈｅｚｒｉＲ，Ｏ＇ＦａｒｒｅｌｌＦ，ｅｔａｌ．Ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌａｕｔｏｐｈａｇｙｐｒｏｍｏｔｅｓｔｕｍｏｕｒｇｒｏｗｔｈ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，２０１７，５４１（７６３７）：４１７ ４２０．［１４］ＣｈｅｎＦ，ＣｈｅｎＬ，ＱｉｎＱ，ｅｔａｌ．Ｓａｌｔ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅｋｉｎａｓｅ２：Ａｎｏｎｃｏｇｅｎｉｃｓｉｇｎａｌｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒａｎｄｐｏｔｅｎｔｉａｌｔａｒｇｅｔｆｏｒｃａｎｃｅｒｔｈｅｒａｐｙ［Ｊ］．ＦｒｏｎｔＯｎｃｏｌ，２０１９，９（２０１６）：１８ ２４．［１５］ＣａｏＷ，ＬｉＪ，ＹａｎｇＫ，ｅｔａｌ．Ａｎｏｖｅｒｖｉｅｗｏｆａｕｔｏｐｈａｇｙ：Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ，ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎａｎｄｒｅｓｅａｒｃｈｐｒｏｇｒｅｓｓ［Ｊ］．ＢｕｌｌＣａｎｃｅｒ，２０２１，１０８（３）：３０４ ３２２．［１６］许 乐，张 霞，吴 超，等．ＳＩＫ２对心肌缺血／再灌注损伤大鼠能量代谢的影响及其机制［Ｊ］．中国应用生理学杂志，２０２２，３８（４）：３０４ ３０７．［１７］单尚然，蒋 方，徐淑梅．β片层阻断肽Ｈ１０２对ＡＤ小鼠识别记忆能力和脑内ＡＭＰＫ ｍＴＯＲ自噬相关通路的影响［Ｊ］．中国应用生理学杂志，２０１９，３５（１）：１ ４．［１８］ＭａＬ，ＭａｎａｅｎｋｏＡ，ＯｕＹＢ，ｅｔａｌ．Ｂｏｓｕｔｉｎｉｂａｔｔｅｎｕａｔｅｓｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎｖｉａｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇｓａｌｔ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅｋｉｎａｓｅｓｉｎｅｘ ｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｍｏｄｅｌｏｆｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒａｌｈｅｍｏｒｒｈａｇｅｏｎｍｉｃｅ［Ｊ］．Ｓｔｒｏｋｅ，２０１７，４８（１１）：３１０８ ３１１６．原代大鼠骨髓间充质干细胞的改良培养及鉴定马华根１，刘海琴２，唐元瑜３△（１．北京中医药大学中医学院，北京１０２４８８；２．福建中医药大学中西医结合学院，３．福建中医药大学中医学院，福州３５０１２２）【摘要】 目的：改良原代大鼠骨髓间充质干细胞（ＢＭＳＣｓ）的分离培养方法。
小鼠间充质干细胞一、细胞复苏和接种1. 37℃预热小鼠间充质干细胞培养液和基础培养液。
2. 从液氮中取出细胞产品管，快速将其置入37℃水浴中解冻，直到管中只剩下最后一片结晶（注意：不要让水没过产品管）。
3. 在生物安全柜中，用75%的酒精擦拭产品管外壁。
4. 将产品管中的细胞移至15ml无菌离心管中，慢慢逐滴加入预温的37℃基础培养液4－5 ml混匀，边滴加边摇匀。
5. 用1ml基础培养液冲洗产品管，并将其转移到15 ml离心管中，边滴加边摇匀。
6. 轻轻混匀细胞后，取10 μl细胞悬液和10 μl台盼蓝混匀，从中取10 μl计数。
7. 细胞悬液在1 000 rpm，室温条件下，离心5分钟，去除上清。
8. 加完全培养液4－5 ml，调整细胞量，轻轻混匀细胞，备用。
9. 按10 000-15 000个细胞/cm2接种细胞。
10. 每个T25培养瓶中加完全培养液3-5 ml，后置于37℃、5%CO2培养箱内培养。
二、细胞换液和培养注意：复苏或传代后的细胞，请于24小时后，第一次更换培养液。
1. 复苏后的细胞经37℃、5%CO2培养箱内培养24小时，此时细胞已完全贴壁，更换培养液后，请继续在37℃，5％CO2培养箱内培养。
2. 之后，每2-3天更换培养液1次，至细胞长到培养瓶表面的80% 可进行传代或冻存。
3. 换液前，请将培养液从4℃中取出，使其恢复到室温。
三、消化细胞1．消化液的配制：pH7.0-7.2 ，分别配制0.5%胰酶液和0.04%EDTA-Na2液，用前按1：1混合。
将PBS或D-Hank's液, 消化液，含10% FBS的基础培养液恢复到室温。
2．具体操作如下：（1）吸去培养液，加入3 ml PBS或D-Hank's液，使PBS或D-Hank's液均匀的分布在培养瓶细胞表面。
1分钟之后，吸去PBS或D-Hank's液。
（2）每个T25培养瓶加入消化液2 ml，使消化液均匀的分布在培养瓶细胞面。
骨髓间充质干细胞培养方法大鼠骨髓间充质干细胞培养方法仪器和材料磁力搅拌器电子天平水浴振荡器pH计真空泵离心机血球计数板1 x 100ml量筒1 x 1L 容量瓶1 x 500ml玻璃烧杯2 x 500ml 带盖无菌玻璃瓶1 x 100ml 带盖无菌玻璃瓶1 x 0.22um 无菌滤膜2 x 100mm 无菌培养皿4 x T25 无菌培养瓶4 x 15ml 无菌离心管2 x 转子2 x 5ml 无菌移液管1ml 无菌枪头封口膜脱脂棉3 x 手术剪2 x 直头镊子1 x 骨钳2 x 手术刀（刀柄+刀片）1 x 100ml 塑料烧杯（盛废液）2 x 100ml 玻璃烧杯低糖DMEM培养基粉末胎牛血清PBS双抗75%酒精SOLUTION PREPARATION溶液制备所有的水溶液均用二蒸水配制。
∙先将试剂在烧杯中用少量二蒸水溶解，然后补加至最终体积。
∙用容量瓶配制溶液。
原代培养：密度梯度离心法1)取鼠龄3-4w，体重70-120g的SD大鼠3-4只（雌雄不限）；2)将SD大鼠颈椎脱臼处死，浸入盛有约300-500ml 75%酒精的1000ml烧杯中浸泡5min；3)用镊子取出后用脱脂棉擦掉多余酒精，置于培养皿内，用手术剪剪开大腿内侧皮肤和肌肉，分离出股骨和胫骨，沿肌肉白线处清除其周围的肌肉，在培养皿中用5-10ml 75%酒精浸泡5min后移入超净工作台中；4)用镊子夹住大鼠股骨和胫骨放置于无菌的培养皿上方，依次用3-5ml PBS和无血清培养基冲洗2~3次后，移入另一无菌培养皿中。
用镊子和骨钳固定股骨，分别用10mL 注射器在骨两端钻孔；5)用5ml（或1ml）注射器吸取培养基从骨一端孔处插入，从上至下缓慢冲洗骨髓腔，用下方的无菌培养皿收集骨髓悬液，重复此过程2~3次；6)在15ml离心管中加入5mL Ficoll分离液，再将骨髓悬液沿管壁缓缓加入其上，注意一定要轻缓，不能让骨髓悬液与分离液相混合，调整骨髓悬液与分离液的体积比为2：1；7)将离心管以2000rpm离心20min，离心后管内物质分为三层，用吸管小心吸取中间的白膜层置于一个新的离心管内；8)在此离心管中加5ml培养基，吹打成单细胞悬液，1000rpm离心5min，离心后用吸管吸去上清液并去掉，加入完全培养基，并轻轻吹散细胞10~20次，制成细胞悬液；9)以5×106cell/ml的细胞密度接种于T25培养瓶中（培养瓶中培养基终体积为5ml）, 置于CO2培养箱中培养，48h后用吸管吸出全部培养液并去掉，添加新鲜培养液，以后每隔三天全量换液一次。
一、四种方法简介及优缺点：骨髓间充质干细胞主要有4种体外分离方法：贴壁筛选法，密度梯度离心法，流式细胞仪分离法和免疫磁珠分离法。
贴壁筛选法是利用细胞贴壁时间及贴壁牢固性的不同逐步将非贴壁细胞和其它杂质细胞去除的一种简单易行的培养MSCS的方法。
贴壁分离培养法分离的MSCS能在体外培养条件下生长良好、可连续传代，体外培养扩增能力较强，其缺点是细胞纯度较低。
此方法简便，冲出骨髓直接培养，然后利用骨髓MSCS 贴壁生长特性，更换培养液逐步去处漂浮生长的造血系细胞即可获得较纯化的MSCS；而且骨髓中的造血干细胞能分泌生长因子和促贴壁物质，可促进MSCS 贴壁生长，因此全骨髓贴壁法更为可取。
密度梯度离心法梯度离心法的核心主要是基于密度梯度离心技术。
梯度离心法是根据骨髓中细胞成分的比重不同，使用淋巴细胞分离液提取单个核细胞，再进行贴壁培养，从而达到分离、纯化MSCS的目的。
Pittenger等的研究发现通过密度梯度离心分离培养的间充质干细胞在第一代时纯度可以达到95%。
常用的分离方法免疫磁珠法，是利用免疫学的技术分离MSCS，分离细胞的纯度高。
Phinney 用一种免疫耗损技术精确地将造血细胞系和内皮细胞系从基质细胞中分离出来，提供了一种能高效的分离纯化间充质干细胞的方法，但目前仍未筛选到真正特异性的细胞表面标记;而且，这两种分离方法的操作对细胞活性都有较大影响，造成MSCS损伤，出现增殖缓慢等问题，这些技术问题很大程度上限制了这两种方法的应用。
因此，如何能简便高效地获得均质性的间充质干细胞和细胞群仍需要继续探索。
分离细疫磁珠分离和流式细胞仪筛选的方法，不仅对细胞活性影响较大，而且操作复杂，价格昂贵。
然而，这些纯化间充质干细胞的方法比较复杂，一般仅限于在各自的实验室应用。
二、具体实验流程1. 免疫磁珠法分离纯化骨髓间充质干细胞：1 实验动物Sd大鼠2 试剂和仪器BSA、荧光标记小鼠抗体x、PE磁珠试剂盒、抗生物素磁珠、MiniMACS分离器及MS分离柱。
细胞的原代培养点击次数：540 作者：佚名发表于：2009-03-06 16:26转载请注明来自丁香园一、原代细胞培养原理原代细胞培养是将机体内的某组织取出，分散成单细胞，在人工条件下培养使其生存并不断生长、繁殖的方法。
借助这种方法可以观察细胞的分裂繁殖、细胞的接触抑制以及细胞的衰老、死亡等生命现象。
• 幼稚状态的组织和细胞，如：动物的胚胎、幼仔的脏器等更容易进行原代培养• 掌握无菌操作技术• 了解小鼠解剖操作技术• 了解原代细胞培养的一般方法与步骤•了解培养细胞的消化分散• 了解倒置显微镜的使用二、实验材料• 实验动物：孕鼠或新生小鼠• 液体：细胞生长液（内含20%小牛血清）0.25%胰蛋白酶平衡盐溶液70%乙醇•器材：灭菌镊子、剪刀若干把灭菌培养皿、细胞培养瓶、小瓶、烧杯若干个吸管若干支酒精灯原代细胞培养方法三、胰酶消化法（1）胰酶消化法操作步骤——取材a. 用颈椎脱位法使孕鼠迅速死亡。
b. 把整个孕鼠浸入盛有75%乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。
c. 用无菌的镊子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用无菌镊子将皮肤扯向后腿。
d. 用另一无菌的剪刀和镊子切开腹部，取出含有胚胎的子宫，置于无菌的培养皿上。
e. 剔除胚胎周围的包膜（若胚胎较大，应剪去头、爪），将胚胎放于无菌的含有平衡盐溶液的培养皿中。
f. 漂洗胚胎，去掉平衡盐溶液。
继续用平衡盐溶液漂洗胚胎直至清洗液清亮为止。
（2）胰酶消化法操作步骤——切割a. 将部分胚胎转移至一个无菌小瓶中，用平衡盐溶液漂洗。
b. 然后用眼科手术剪刀小心地绞碎胚胎，直到成1mm3左右的小块，再用平衡盐溶液清洗，洗到组织块发白为止。
c. 静置，使组织块自然沉淀到管底，弃去上清。
（3）胰酶消化法操作步骤——消化、接种培养a. 视组织块量加入5-6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20-40分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。
b. 加入3-5ml细胞生长液以终止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制剂）。
贴壁法体外培养纯化鼠骨髓间充质干细胞【摘要】目的研究贴壁法体外分离、纯化及增殖鼠骨髓间充质干细胞（MSCs)，并进行鉴定。
方法取出生5 d的Wistar乳鼠的股骨及胫骨，冲取骨髓，采用贴壁法分离筛选分离鼠的MSCs，通过传代进行纯化，增殖，测定其生长曲线，检测生长周期，流式细胞仪分析表面抗原。
结果贴壁培养法能够有效地分离鼠的MSCs，MSCs形态为均一的梭形，生长曲线呈S型，细胞周期显示第三代细胞约有80.89％处于G0/G1期，第三代以后细胞表面抗原CD90阳性，CD34、CD45阴性。
结论建立了一种较好的体外培养、纯化及扩增鼠MSCs的方法，适用于MSCs的进一步研究。
骨髓间充质干细胞（MSCs)来源于中胚层，具有多向分化潜能，在不同诱导条件下，可以向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞分化，而且具有来源广泛、易于培养和移植、体外基因转染率高等特点，显示了在细胞和基因治疗中良好的应用前景，已引起了广泛的关注〔1〕。
本实验研究鼠的MSCs体外分离纯化、培养和鉴定，为进一步探讨MSCs的应用提供基础。
1 材料与方法1.1 材料清洁级出生5 d的Wistar乳鼠（8.0～10.0 g），购自吉林大学实验动物中心。
主要试剂：DMEM培养基（美国GibcoBRL公司），胎牛血清（美国Hyclone公司），兔抗鼠CD90、CD34、CD45荧光直标抗体（美国BD公司），RNA酶、碘化丙啶(Sigma公司)，0.25%胰蛋白酶、噻唑蓝(MTT)及二甲基亚砜(DMSO)(华美生物工程公司)、青霉素、链霉素(华北制药厂)。
1.2 方法1.2.1 MSCs的体外分离与培养选用出生5 d Wistar乳鼠，颈椎脱臼法处死，75%酒精浸泡片刻，无菌条件下分离股骨、胫骨，剪除骨两端，用5.0 ml L��DMEM培养基，冲出骨髓于培养皿内，经吹打制成细胞悬液，1 500 r/min离心5 min，弃上清。
用10 mlL��DMEM重悬细胞，将悬液经1.0 ml注射器和200目滤网过滤成单细胞，用含20%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/ml链霉素的L��DMEM培养液重悬。
实验一细胞培养用品的清洗、消毒与灭菌体外人工培养的细胞缺乏抗感染能力，所以能否防止污染是决定培养成败的关键。
即便使用设备完善的实验室，若实验者粗心大意，技术操作不规范，也会导致细胞污染。
无菌技术原理是阻止无菌的、未被污染的物体与任何有菌的、被污染的物体相接触。
任何直接或间接地与培养细胞相接触的物体必须经过严格的清洗和消毒程序。
1.实验目的掌握细胞培养中所使用的器械的清洗与消毒方法。
2.实验原理清洗时采用化学药剂清除物体表面污垢的方法，它是借助清洁剂对物体表面污染物或覆盖层进行化学转化、溶解、剥离以达到脱脂、除锈和去污的效果。
消毒是指杀死病原微生物（但不一定能杀死细胞芽孢）的方法。
通常用化学方法来达到消毒的作用。
灭菌可除去或杀灭物体中全部微生物。
应根据微生物的种类、污染状况、被污染物体的性质与状态，选择单独或组合灭菌方法。
能否达到灭菌的目的，通常要采用无菌实验法进行判定。
对灭菌操作时采用的温度、压力等能否适合灭菌的条件，必须得到十分的确认。
在灭菌条件选定后，还要进行灭菌效果的确认，以保证使用的各种灭菌条件适合于要杀灭的目标菌。
灭菌的程度受灭菌的时间与灭菌剂强度的制约。
灭菌常用的方法有化学试剂灭菌法、射线灭菌法、干热灭菌法、湿热灭菌法和过滤除菌法等。
可根据不同的需求，采用不同的方法，如培养基灭菌一般采用湿热灭菌法，空气灭菌则采用过滤除菌法。
3．实验准备仪器设备：超净工作台、超声清洗器、高压灭菌锅、干燥箱、过滤器、紫外灯、0.22um 微孔滤膜、电磁炉、电子分析天平、铝箔、试管刷等。
实验材料：玻璃器皿（三角瓶、烧杯、量筒、试剂瓶）塑料器皿（离心管、吸头等）、眼科剪刀、眼科镊、金属饭盒、报纸等。
主要试剂：75%乙醇、盐酸、0.2%的新洁尔灭、高锰酸钾、重铬酸钾、浓硫酸、次氯酸钠(NaClO)、洗涤剂、蒸馏水、去离子水等。
4．试验方法4.1 玻璃器皿的清洗（1）浸泡：初次使用和培养用的玻璃器皿都需要先用清水浸泡，水要完全进入器皿中，不要留有气泡。
小鼠骨髓间充质干细胞的体外培养和鉴定张华华;周汝滨【期刊名称】《西部医学》【年(卷),期】2009(21)7【摘要】目的采用全骨髓贴壁培养法分离和体外培养小鼠骨髓间充质干细胞,并通过形态学现察和排除鉴定法进行初步鉴定.方法无菌分离小鼠胫骨和股骨,剪开骨干骺端,用RPMI 1640培养基反复液冲洗骨髓腔,收集并过滤离心.DMEM-LG培养基重悬细胞,将细胞悬液转入0.1%明胶包被的培养瓶中,37℃,5%CO2常规进行原代培养并传代.在培养过程中,取不同代数的细胞做CD45流式标记鉴定.结果采用全骨髓贴壁培养法获得的骨髓间充质干细胞贴壁时间短,增殖快,经传代后能够纯化.第4-5代骨髓间克质干细胞形态单一均匀,呈典型的极性漩涡状生长,并不表达白细胞标志抗原CD45.结论本实验可稳定获得均质性良好的小鼠骨髓同充质干细胞,并初步通过鉴定.【总页数】3页(P1076-1078)【作者】张华华;周汝滨【作者单位】广东医学院医学遗传学研究室,广东,湛江,524023;广东医学院医学遗传学研究室,广东,湛江,524023【正文语种】中文【中图分类】R551.3;R322.7+1【相关文献】1.致敏小鼠骨髓间充质干细胞体外培养及多向分化功能的测定 [J], 洪冬玲;吴燕峰;许吕宏;方建培2.绿色荧光蛋白转基因小鼠骨髓间充质干细胞的体外培养和鉴定 [J], 段晴月;董金山;金超威;文军;郝靖惠;林媛;陆群3.小鼠骨髓间充质干细胞的体外培养和鉴定 [J], 朱建宇;施伟民4.成人骨髓间充质干细胞体外培养、鉴定与成骨诱导 [J], 张铭杰;张庆文;何伟;陈镇秋;欧志学;贾晓军;5.丙二醛对体外培养下小鼠骨髓间充质干细胞凋亡的诱导作用 [J], 李烨;王逸安;张君;刘如石;汪保和因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
小鼠间充质干细胞培养扩增后生物学特性研究作者：解琳娜, 王健民,邱慧颖, 高磊, 周虹, 龚胜兰【摘要】本研究目的是分离富集小鼠骨髓间充质干细胞（mMSC），鉴定其生物学特性和多向分化潜能。
取4-5周龄雄性C57BL/6小鼠骨髓细胞，采用全骨髓贴壁法和单克隆培养法分离、纯化和扩增mMSC；分析细胞免疫表型、生长曲线、细胞周期；进行多向分化潜能鉴定；传代培养达30代后，进行成瘤性检测。
结果表明：建立的小鼠间充质干细胞系在体外可连续传代培养达30代，细胞仍保持多向分化潜能，细胞高表达CD29、CD44、Sca??1、MHC?并瘢?中度表达CD13、CD90.2，不表达CD117、CD45、Flk??1、MHC?并蚶嗫乖?。
mMSC 体外能诱导分化成骨、脂肪、软骨细胞。
结论：全骨髓贴壁法和集落培养法富集可获得mMSC，其在体外连续传代30代以上仍能维持生物学特性稳定，具有高度的增殖和多向分化潜能，无成瘤性。
【关键词】间充质干细胞骨髓细胞培养生物学特性Enrichment and Biological Characteristicsof Murine Mesenchymal Stem Cells Abstract The study was aimed to isolate and establish mesenchymal stem cellline from adult murine bone marrow as well as to identify its biological characteristics and differentiation potential. Bone marrow cells (BMCs) were collected by flushing the femurs and tibias of4??5??week??old male C57BL/6 mice, and were inoculated at a concentration of 1×106/cm2. mMSCs were isolated, enriched and expanded by using bone marrow adherant culture and monoclonal culture. The characteristics of the cells, such as morphology, growth pattern, cell cycle, phenotype, karyotype and multipotent differentiation potential, cytogenetic stability and tumorigenesis were determined. The results indicated that the cell population consisted of spindle?? and star??shaped cells, they were highly positive for CD29, CD44, Sca??1, MHC?并?, moderate positive for CD13, CD90.2 and negative for CD117, CD45, Flk??1 and MHC?并?. mMSCs could be induced todifferentiate into adipocytes, osteoblast cells and chondrocytes. Itis concluded that mMSC can be isolted, expanded and enriched by using bone marrow adhcrent culture and monoclonal culture. No tumor formations are observed for 3 months in nude mice after subcutaneous injection. mMSCs retain their properties after at least 30 passages in culture as well as from frozen stocks. Keywords mesenchymal stem cell; bone marrow; cell culeure; biological characteristics J Exp Hematol 2007; 15(3):542-546 间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSC）是来源于中胚层的一种成体干细胞，MSC易于富集和扩增，不涉及伦理学问题，已被越来越广泛地应用到组织工程中,是理想的种子细胞。
骨髓间充质干细胞（BMSC）是什么？骨髓间充质干细胞详细介绍骨髓间质干细胞(Bone Mesenchymal Stem Cells, BMSC)是骨髓中除造血干细胞以外的另一种重要的成体干细胞，参与构成造血微环境，同时还具有多向分化潜能、低免疫原性、取材方便、扩增迅速、遗传背景稳定等特点，在组织工程和细胞及基因治疗等方面具有广阔的应用前景。
骨髓间充质干细胞(BMSC),既往称为骨髓基质成纤维细胞,是一类起源于中胚层的成体干细胞,具有自我更新及多向分化潜能,可分化为多种间质组织,如骨骼、软骨、脂肪、骨髓造血组织等。
骨髓BMSC的迁移、定植、增殖与分化,需要从外界获取信息。
其分化方向取决于所在的微环境。
这里的”微环境”不仅包括骨髓微环境,还包括局部间质组织微环境。
骨髓间充质干细胞具有向中胚层和神经外胚层来源的组织细胞分化的能力，这些细胞包括成肌细胞、肝细胞、成骨细胞、软骨细胞、成纤维细胞、神经胶质细胞、神经细胞、造血干细胞、基质细胞等，在两性霉素B和5-氮胞苷作用下，还可形成肌小点，骨髓间充质干细胞用于中胚层和神经外胚层来源的组织损伤及退行性病变的治疗前景巨大。
动物实验已经证实，骨髓间充质干细胞单独应用可以较好地促进骨折愈合和软骨损伤的修复，通过体外培养使其覆盖于陶瓷支架或碳纤维网络等再植入患处效果更明显。
骨髓间充质干细胞体外培养，因具有黏附于塑料培养皿壁的能力而易于分享，体外经过长期连续培养和冷冻保存后不会改变其分化潜能，植入以后可以分化成造血以外的组织，如肺、软骨、骨、神经等，并表现出相应组织细胞的表型。
将骨髓间充质干细胞植入小鼠体内，发现其可向肌肉组织处迁移并参与新肌的再生；而将人的骨髓间充质干细胞植入大鼠的脑内，发现其分化为星形胶质细胞并较好地与受体组织结合。
将流产胎儿体内的骨髓干细胞植入人为诱发病变的实验鼠肝脏内，发现干细胞在实验鼠体内渐渐长为肝细胞，病鼠肝脏恢复正常功能。
骨髓间充质干细胞易于外源基因的导入和表达，可作为基因载体，从而将组织工程治疗和基因治疗有机地结合在一起。
