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基因敲除小鼠的制作方法基因敲除小鼠是一种常用的遗传工具，在科学研究中被广泛应用于功能基因组学和疾病模型研究。
基因敲除是指通过特定技术手段，将小鼠体内的目标基因完全沉默或失活，从而研究该基因在发育、生理以及疾病机制中的功能。
本文将介绍基因敲除小鼠的制作方法，包括设计目标基因的敲除载体、胚胎干细胞的筛选和注射、外显子敲除策略的选择等。
1.设计目标基因的敲除载体敲除载体是嵌入目标基因的重要工具。
它通常包含正向与反向的同源臂（homology arms）以及选择标记（如抗生素抗性基因）。
同源臂的长度通常在2-5 kb之间，确保在同源重组时准确而有效地替代目标基因。
此外，敲除载体中还应该包含可诱导甲基化的Cre-loxP重组体系或者FLP-FRT重组体系，以用于后续的基因定向敲除或基因重新组装。
2.筛选胚胎干细胞胚胎干细胞是从内胚层发育而来的多潜能细胞，可以分化为整个鼠体的各种组织和器官。
敲除载体首先需要通过电转或霰粒枪等手段转染到胚胎干细胞系中。
转染后，胚胎干细胞需要进行抗生素筛选，以过滤未转染的细胞。
为了确保目标基因的敲除率，可以使用增强绿色荧光蛋白（eGFP）等标记基因，通过荧光显微镜观察转染细胞的表达情况。
3.敲除载体注射到小鼠受精卵中一旦确认胚胎干细胞中存在敲除载体，接下来就是将胚胎干细胞植入小鼠受精卵。
这个步骤一般由经验丰富的研究人员或者专业公司进行。
首先，选择合适的受精卵（通常为C57BL/6J小鼠品系），然后利用显微操作技术，将敲除载体注射到受精卵的核酸注入腔。
注射后，将受精卵转入对应营养液中培养一定时间，以期达到最佳着床率。
4.敲除鼠胚移植到配子体内经过培养后，将敲除的胚胎植入雌性激素准备好的代孕小鼠（通常为白色的株系，如ICR）。
移植后，将代孕小鼠继续养育，直至分娩。
5.验证敲除小鼠的敲除效果通过提取敲除小鼠的DNA，可以利用PCR、Southern blot和DNA测序等技术验证敲除效果。
..一、常规基因敲除鼠（Conventional Knockout）常规基因敲除是通过基因打靶，把需要敲除的基因的几个重要的外显子或者功能区域用Neo Cassette 替换掉。
这样的小鼠其全身所有的组织和细胞中都不表达该基因产物。
此类基因敲除鼠一般用于研究某个基因在对小鼠全身生理病理的影响，而且这个基因没有胚胎致死性。
二、条件性基因敲除小鼠（Conditional Knockout）条件性基因敲除小鼠是通过基因打靶，把两个loxP 位点放到目的基因一个或几个重要的外显子的两边。
该小鼠和表达Cre酶小鼠杂交之前，其目的基因表达完全正常。
当和组织特异性表达Cre酶的小鼠进行杂交后，可以在特定的组织或细胞中敲除该基因，而该基因在其他组织或细胞表达正常。
条件性基因敲除鼠适用范围为：（1）该基因有胚胎致死性；（2）用于研究该基因在特定的组织或细胞中的生理病理功能。
三、基因敲入小鼠（Knockin）基因敲入小鼠是通过基因打靶，把目的基因序列敲入到小鼠的相应基因位点，使用小鼠的表达调控元件指导目的基因表达。
此类基因敲入鼠一般用于药物的筛选，信号通路的研究等。
获得嵌合体及之后品系纯化详细流程：基因敲除其他方法：一、ZFN技术制作基因敲除鼠ZFN能够识别并结合指定的基因序列位点，并高效精确地切断。
随后细胞利用天然的DNA 修复过程来实现DNA的插入、删除和修改，这样研究人员就能够随心所欲地进行基因组编辑。
这在过去是无法想象的，传统的基因敲除技术依赖细胞内自然发生的同源重组，其效率只有百万分之一，而ZFN的基因敲除效率能达到10%。
利用这些技术进行小鼠基因的定点敲除和敲入，可以把时间从一年缩短到几个月。
这项技术中设计特异性的ZFN是最关键的环节，目前研究者采用计算生物学方法设计高特异性的ZFN，但ZFN的脱靶（off target），也就是把不该切的地方切了的问题仍是一个挑战。
也正因为这个原因，利用ZFN技术进行小鼠的基因修饰还无法完全取代传统技术。
Hepcidin基因敲除对小鼠骨代谢的影响及相关机制
研究的开题报告
背景介绍：Hepcidin是一种铁调节激素，其作用是调节体内铁的吸
收和排泄，进而影响机体内的铁代谢。
近年来的研究表明，Hepcidin除
了对铁代谢的调节作用外，还与骨代谢存在着密切的关系。
然而，目前
关于Hepcidin对骨代谢的作用机制还存在很多争议和未知之处。
目的：本研究旨在探讨Hepcidin基因敲除对小鼠骨代谢的影响及其
相关机制。
研究内容：采用Hepcidin基因敲除小鼠作为研究对象，通过比较敲
除小鼠和野生型小鼠的骨代谢指标，如骨密度、骨形态、骨质量、骨小
梁结构等，来初步探究Hepcidin对骨的影响。
同时，将从细胞分子水平
上分析Hepcidin基因敲除后对骨细胞分化及功能的影响，如成骨细胞和
破骨细胞的数目、形态、分泌细胞因子的能力、骨再生能力等，以此揭
示Hepcidin调节骨代谢的机制。
研究意义：通过本研究，将进一步认识Hepcidin在骨代谢中的作用，并且为解决一些与骨代谢相关的疾病提供新的治疗思路。
成纤维细胞生长因子23在骨矿物质代谢中的作用及其调控机理董中亮;任晓曼;卜舒扬;闪爱婷;王玉婷;杨建成【摘要】骨源性激素成纤维细胞生长因子23(FGF23)介导由甲状旁腺、肾脏、骨骼和维生素D组成的负反馈回路,建立"骨骼-肾脏-甲状旁腺"内分泌轴,参与骨矿物质代谢并发挥重要作用.钙、磷、铁、维生素D、甲状旁腺素(PTH)、成纤维细胞生长因子受体(FGFR)/FGF以及蛋白质翻译后修饰调控FGF23的分泌、活性和胞内过程.随着深入的研究,探索出了一些以FGF23为靶点治疗骨矿物质代谢障碍疾病的新疗法.本文综述了FGF23在骨矿物质代谢中的作用及其调控机理的研究进展,以期为相关研究提供参考依据.%fibroblast growth factor?23 ( FGF23 ) as a bone?derived hormone plays an important role in bone mineral metabolism by mediating the negative feedback loops formed by parathyroid gland, kidney, bone and vitamin D to constructing abone?kidney?parathyroid gland endocrine axis. The secretion, activity and intracel?lular processes of FGF23 are regulated by calcium, phosphate, iron, vitamin D, parathyroid hormone ( PTH) , fibroblast growth factor receptor ( FGFR)/FGF and posttranslational modifications. With the increase of study on FGF23, the researchers have explored new therapeutic interventions on bone mineral metabolism disorder. In order to provide reference for relevant research, functions and regulation mechanism of FGF23 in bone min?eral metabolism were reviewed in this paper.【期刊名称】《动物营养学报》【年(卷),期】2017(029)010【总页数】5页(P3467-3471)【关键词】成纤维细胞生长因子23;骨矿物质代谢;钙;磷;铁【作者】董中亮;任晓曼;卜舒扬;闪爱婷;王玉婷;杨建成【作者单位】沈阳农业大学畜牧兽医学院,沈阳 110866;沈阳农业大学畜牧兽医学院,沈阳 110866;沈阳农业大学畜牧兽医学院,沈阳 110866;沈阳农业大学畜牧兽医学院,沈阳 110866;沈阳204医院,沈阳 110043;沈阳农业大学畜牧兽医学院,沈阳110866【正文语种】中文【中图分类】S852.2钙、磷是动物生长、骨骼发育和维持机能所必需的矿物质元素，是骨骼的基本组成成分，它们结合生成的羟基磷灰石构成骨盐。
小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化中的核受体Rev-erbα及Rorα林富伟;徐晓梅;崔琰;谢乙加;赵青【摘要】BACKGROUND: The orphan nuclear receptors Rev-erbα and Rorα play important roles in lipid metabolism and glucose metabolism. But it is unclear whether they are involved in bone metabolism. OBJECTIVE: To observe the expression of Rev-erbα and Rorα during the osteoblastogenesis process of bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs). METHODS: BMSCs were isolated and purified from C57BL/6 mice by the whole bone marrow adherence method followed by morphology observations and then BMSCs were induced to differentiate into osteoblasts and adipocytes. We detected their differentiation abilities using oil red O staining and alizarin red staining, respectively. Real-time PCR and western blot assay were conducted to detect the mRNA and protein levels of Rev-erbα and Rorα in BMSCs cultured in the osteogenic medium for 0, 7, 14 days. RESULTS AND CONCLUSION: BMSCs fromC57BL/6 mice were mainly spindle-shaped and exhibited the swirl-like pattern of growth. Following induction, oil red O staining and alizarin red staining produced a positive reaction in these cells. Rev-erbα expression at both gene and protein levels decreased at 0, 7, 14 days after osteogenic induction, while Rorα expression increased at both gene and pro tein levels. These findings indicate that Rev-erbα and Rorα may participate in the osteoblastogenesis of BMSCs.%背景:孤儿核受体Rev-erbα及Rorα已经被广泛证实与糖代谢、脂肪代谢等密切相关,但与骨代谢的关系尚不明确.目的:探讨孤儿核受体Rev-erbα及Rorα在骨髓间充质干细胞成骨分化过程中的作用.方法:采用全骨髓贴壁法分离培养C57BL/6小鼠骨髓间充质干细胞,进行形态学观察和成脂、成骨诱导分化,采用油红O染色,茜素红染色对其分化能力进行鉴定.在骨髓间充质干细胞成骨诱导分化第0,7，14天,采用Real Time PCR及Western Blot分别检测孤儿核受体Rev-erbα及Rorα的mRNA及蛋白表达变化.结果与结论:①骨髓间充质干细胞形态以梭形为主,呈典型的漩涡样生长.油红O染色及茜素红染色呈阳性;②在成骨诱导的第0,7,14天,Rev-erbα的mRNA及蛋白表达均呈下降趋势,而Rorα的mRNA及蛋白表达均呈上升趋势,提示Rev-erbα及Rorα在骨髓间充质干细胞成骨诱导过程中可能发挥了一定的作用.【期刊名称】《中国组织工程研究》【年(卷),期】2018(022)017【总页数】6页(P2625-2630)【关键词】干细胞;骨髓间充质干细胞;成骨分化;核受体;Rev-erbα;Rorα【作者】林富伟;徐晓梅;崔琰;谢乙加;赵青【作者单位】西南医科大学附属口腔医院正畸科,口颌面修复重建与再生实验室,四川省泸州市 646000;西南医科大学附属口腔医院正畸科,口颌面修复重建与再生实验室,四川省泸州市 646000;西南医科大学公共卫生学院,四川省泸州市 646000;西南医科大学附属口腔医院正畸科,口颌面修复重建与再生实验室,四川省泸州市646000;口腔疾病研究国家重点实验室,国家口腔疾病临床研究中心,四川大学华西口腔医院正畸科,四川省成都市 610041【正文语种】中文【中图分类】R394.2文章快速阅读：文题释义：Rev-erbα：又名Nr1D1，是孤儿核受体超家族中的一员，Rev-erbα基因位于人类第17号染色体上。
FGFR1在骨骼发育、稳态维持和损伤修复中的作用研究进展陈涵纲;陈华;苏楠;聂茂
【期刊名称】《中国骨质疏松杂志》
【年(卷),期】2024(30)6
【摘要】骨骼是全身最大的器官之一,其发育及稳态维持异常可引起多种骨骼疾病,如骨骼遗传病、骨退行性疾病(如骨质疏松症、骨性关节炎)和骨折等。
成纤维细胞生长因子受体(fibroblast growth factor receptors,FGFRs)家族重要成员FGFR1在骨骼发育和稳态维持中发挥关键作用。
FGFR1功能增强点突变可引起囟门早闭综合征等骨骼遗传病,同时也参与调节骨形成、骨吸收过程以及关节炎的发生。
此外,FGFR1在骨损伤修复不同阶段的骨骼相关细胞中均有表达,提示其参与骨修复过程。
笔者总结了FGFR1在骨骼发育、稳态维持及损伤修复中的作用和机制研究进展,为从干预FGFR1信号角度治疗骨骼相关疾病提供借鉴。
【总页数】6页(P869-874)
【作者】陈涵纲;陈华;苏楠;聂茂
【作者单位】重庆医科大学附属第二医院骨科关节外科中心;陆军军医大学大坪医院骨质疏松与骨发育中心/战伤组织修复与康复医学研究室
【正文语种】中文
【中图分类】R681.1
【相关文献】
1.维生素D信号通路在骨骼稳态维持中的作用
2.不同亚型的真皮成纤维细胞在皮肤再生发育与稳态维持中作用的研究进展
3.Hippo信号通路在骨骼肌损伤修复中作用的研究进展
4.YAP/TAZ蛋白在骨骼形成及稳态维持中的作用
5.MicroRNA在骨骼肌生成发育及损伤修复中的研究进展
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FGFR1在雌激素调控成骨细胞增殖分化过程中的作用研究魏霆;肖国宁;孙惠强【摘要】目的:明确Ⅰ型成纤维细胞生长因子受体(FGFR1)在雌激素促成骨细胞增殖分化过程中的作用,并进一步探索其作用机制.方法:在雌激素作用下采用抑制剂PD166866抑制FGFR1的活性,(四唑甲基噻唑)MTT、(碱性磷酸酶)ALP检测成骨细胞增殖分化活性;Western Not比较各组成骨细胞Runx2和OCN表达水平以及(丝裂原活化蛋白激酶)MAPK信号通路关键因子ERK1/2,JNK,P38表达水平及磷酸化水平.结果:雌激素作用下,加入抑制剂后,成骨细胞中MTT值明显降低,ALP值明显增高(P＜0.05),且Runx2,OCN蛋白表达水平明显增高(P＜0.05);雌激素作用下,ERK、JNK和P38蛋白表达无明显改变,但磷酸化水平均显著升高,加入抑制剂后,仅ERK磷酸化水平明显上升(P＜0.05).结论:本实验结果提示FGFR1对成骨细胞具有促进增殖、抑制分化的作用,且介导雌激素调控成骨细胞增殖分化的过程;此外,多条MAPK信号通路中,仅ERK通路参与了该过程.%Objective:To investigate the role of fibroblast growth factor receptor 1 (FGFR1) in the proliferation and differentiation of bone cells induced by estrogen,and to further explore the FGFR1 regulatory mechanism on MC3T3-E1 cells.Methods:Under the action of estrogen,inhibitor PD166866 was used to inhibit the activityofFGFR1.Methyl thiazol tetrazolium (MTT) and alkaline phosphatase (ALP) were used to detect the proliferation and differentiation acivties of osteoblasts.The expression levels of Runx2 and OCN of osteoblasts in each group,and the expression levels and phosphorylation levels of the key genes(ERKl/2,JNK,P38) in the MAPK signaling pathway by Western blot were compared and elevated.Results:Under the effects ofestrogen,treatment with inhibitor PD 166866 reduced the MTT values,increased ALP activity and increased the levels of Runx2 and OCN protein significantly (P＜0.05).And under the effects of estrogen,no significant changes on the expression level of ERK,JNK and P38 while the phosphorylation levels of ERK,JNK and P38 is higher (P＜ 0.05).After adding the FGFR 1 inhibitor PD 166866,only the phosphorylation level of ERK increased (P＜ 0.05).Conclusion:FGFR1 may promote osteoblast proliferation and inhibit osteoblast differentiation,and participate in the process of estrogen regulating osteoblast proliferation and differentiation.And in multiple MAPK signaling pathways,only the ERK pathway participates in the process.【期刊名称】《口腔颌面修复学杂志》【年(卷),期】2018(019)002【总页数】6页(P113-118)【关键词】雌激素;Ⅰ型成纤维细胞因子受体;成骨细胞;ERK/MAPK信号通路【作者】魏霆;肖国宁;孙惠强【作者单位】山东大学口腔医学院修复科山东250012;天津医科大学总医院天津300052;山东大学口腔医学院山东250012【正文语种】中文【中图分类】R780.2雌激素对人体多种生理功能的正常运行至关重要，既往研究表明，雌激素可促进骨形成，并在促进颌骨细胞增殖分化中发挥重要作用[1，2]。
