博士专题：基因功能研究技术之基因敲除及基因编辑技术 PPT

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基因编辑技术PPT课件

GAATTC
AGATCT
CTTAAG
TCTAGA
AATTC G
EcoRⅠ+ Bg lⅡ
双酶切
A TCTAG
AATTC G
GATCT
A
GAATTC CTTAAG
AGATCT TCTAGA
Eco RⅠ+ Bg lⅡ 双酶切
+AATTC G
A TCTAG
T4 DNA连接酶
GAATTC CTTAAG
AGATCT TCTAGA
CELLECTIS S.A. NASDAQ
2015.11.18 DNA剪切技术治疗1岁女童获成功
基因组编辑技术简介
Genome Editing
2015.11.22 HuangCH @ J208
修改遗传信息的第一步：按我们的设计来重组DNA
第一节基本概念
重组DNA技术：
是指在基因水平上，将目的DNA在体外重组于能自我复制的载体DNA分子上，然后将重组 DNA导入宿主细胞中进行增生，以获得大量的目的DNA片段，或以此为基础，通过基因的诱导表达，得到大量相应蛋白质产物的过程。
植物遗传转化方法和技术
根癌农杆菌介导的植物转基因
图10-1 农杆菌侵染伤口的模式图
基因枪介导法电转化法 PEG转化法花粉管通道法
动物遗传转化方法和技术
原核显微注射法胚胎干细胞介导法病毒载体法
SUCCESS
THANK YOU
2019/8/9
基因重组/敲除的概念及简史
1980年代初，ES细胞分离和体外培养成功奠定了基因重组/敲除的技术基础
构建与靶基因同源 (10～15kb)的载体
技外显子插有新霉素抗

基因编辑技术和原理ppt课件

为了规范事业单位聘用关系，建立和完善适应社会主义市场经济体制的事业单位工作人员聘用制度，保障用人单位和职工的合法权益
什么是基因编辑技术？
基因编辑是指对基因组进行定点修饰的一项新技术。利用该技术，可以精确地定位到基因组的某一位点上，在这位点上剪断靶标 DNA 片段并插入新的基因片段。此过程既模拟了基因的自然突变，又修改并编辑了原有的基因组，真正达成了“编辑基因”。
为了规范事业单位聘用关系，建立和完善适应社会主义市场经济体制的事业单位工作人员聘用制度，保障用人单位和职工的合法权益
CRISPR/Cas 系统由 Cas9 核酸内切酶与sgRNA构成. 转录的 sgRNA 折叠成特定的三维结构后与 Cas9 蛋白形成复合体, 指导 Cas9 核酸内切酶识别特定靶标位点, 在 PAM 序列上游处切割 DNA 造成双链 DNA 断裂, 并启动 DNA 损伤修复机制. 从不同菌种中分离的 CRISPR/Cas 系统, 其 CrRNA(或者是人工构建的sgRNA) 靶向序列的长度不同, PAM 序列也可能不同。
为了规范事业单位聘用关系，建立和完善适应社会主义市场经济体制的事业单位工作人员聘用制度，保障用人单位和职工的合法权益
三种不同技术的比较
为了规范事业单位聘用关系，建立和完善适应社会主义市场经济体制的事业单位工作人员聘用制度，保障用人单位和职工的合法权益
为了规范事业单位聘用关系，建立和完善适应社会主义市场经济体制的事业法权益
基因编辑的不足 • 基因编辑是一项新技术，还存在构建复杂和价
格的问题，其脱靶效应限制了其在基因治疗等应用上的发展。

《基因功能分析》课件

通过荧光染料或探针标记的特异引物，对特定基因进行实时荧光检测，实现对基因表达的定量分析。
蛋白质组学分析
利用质谱等技术对蛋白质进行鉴定和定量分析，了解蛋白质的表达情况和功能。
基因突变分析
Sanger测序
通过对目标基因进行双脱氧终止法测序，检测基因突变位点和类型。
高通量测序
对全基因组或目标区域进行深度测序，发现基因突变和结构变异。
随着基因技术的进步，相关的伦理和法规也将不断完善，以保障技术的安全和合理应用。
THANKS
[ 感是生物多样性的基础。不同物种或同一物种不同种群间的基因变异导致了生物多样性的产生和发展。了解基因变异对生物多样性的影响有助于保护和利用生物资源。
CHAPTER 04
基因功能研究的应用
医学诊断与治疗
基因诊断
利用基因检测技术，对遗传性疾病进行早期诊断，有助于制定个性化的治疗方案。
基因与药物反应个体差异
不同个体对同一种药物的反应可能存在差异，这种差异部分由基因变异引起。了解个体基因变异情况有助于预测患者对特定药物的反应。
基因与进化
基因变异与物种形成
基因变异是生物进化的驱动力之一。通过自然选择和遗传漂变，基因变异在种群中积累并最终导致新物种的形成。
基因与适应性进化
生物在适应环境过程中，某些基因变异有助于提高生存和繁殖能力，从而在自然选择作用下得到保留和传播。这些变异可以影响生物的生理机能、行为和形态等方面。
03
基因与个性化医疗
了解基因变异对疾病的影响有助于实现个性化医疗，为患者提供更精准
的诊断和治疗方案。
基因与药物反应
基因与药物代谢
药物代谢酶的基因变异可以影响药物的代谢速率和效果。有些变异可能导致药物代谢过快或过慢，从而影响治疗效果。

博士专题：基因功能研究技术之基因敲除及基因编辑技术讲课讲稿101页PPT

博士专题：基因功能研究技术之基因敲除及基因编辑技术讲课讲稿
1、合法而稳定的权力在使用得当时很少遇到抵抗。 ——塞 ·约翰逊 2、权力会使人渐渐失去温厚善良的美德。— —伯克
3、最大限度地行使权力总是令人反感；权力不易确定之处始终存在着危险。— —塞·约翰逊 4、权力会奴化一切。以拉着它的鼻子走。— —莎士比
1、最灵繁的人也看不见自己的背脊。——非洲 2、最困难的事情就是认识自己。——希腊 3、有勇气承担命运这才是英雄好汉。——黑塞 4、与肝胆人共事，无字句处读书。——周恩来 5、阅读使人充实，会谈使人敏捷，写作使人精确。——培根

博士专题：基因功能研究技术之基因敲除及基因编辑技术 ppt课件

2011年8月， Nature Biotechnology 上同时发表了用TALEN 技术进行基因敲除的4篇研究文章，另加一篇综述。
• 一篇人类干细胞《Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases》
• 一篇大鼠《Knockout rats generated by embryo microinjection of TALENs》
ppt课件
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条件型基因打靶的优势： 1. 克服了重要基因被敲除所导致的早期致死 2. 并能客观、系统地研究基因在组织器官发生、发育以及
疾病发生、治疗过程中的作用和机制
这一技术亦存在一些缺点： 1. 费用太高 2. 周期较长 3. 许多基因在剔除后并未产生明显的表型改变，可能是这
些基因的功能为其他基因代偿所致
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TALEN 发展过程
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TALEN 基因敲除
TALEN (TALE+FOK I) 表达质粒对
TALEN 表达质粒对转染、表达切割靶位点
切割诱发DNA损伤修复机制（nonhomologous end-joining， NHEJ）。由于在此修过程中总是有一定的错误率存在。在修复中发生移码突变错误的个体即形成目标基因敲除突变体
• 常见的几种诱导型基因敲除类型有：四环素诱导型；干扰素诱导型；激素诱导型；腺病毒介导型。
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III、基因编辑技术
• ZFN系统 • TALEN系统 • CRISPR/Cas 系统
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（一）ZFN技术系统
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博士专题：基因功能研究技术之基因敲除与基因编辑技术

（一）完全基因敲除
• 基因载体的构建：把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA 分子都重组到带有标记基因(如neo 基因，TK 基因等)的载体上，成为重组载体。基因敲除是为了使某一基因失去其生理功能，所以一般设计为替换型载体。
基因被完全敲除之后使得表型分析受到很多限制：
有些重要的靶基因被敲除后会引起胚胎早期死亡，使得无法分析该基因在胚胎发育晚期和成年期的功能；某些基因在不同的细胞类型中执行不同的功能，完全敲除会导致突变小鼠出现复杂的表型，使研究者很难判断异常的表型是由一种细胞引起的，还是由几种细胞共同引起的。
Cre/loxP系统作用原理示意图
FLP／FRT 系统
• 该系统与Cre／loxP系统相同，也是由一个重组酶和一段特殊的 DNA序列组成。从进化的角度上考虑，Flp／FRT系统是Cre／loxP 系统在真核细胞内的同源系统。其中，重组酶Flp是酵母细胞内的一个由423个氨基酸组成的单体蛋白。与Cre相似，Flp发挥作用也不需要任何辅助因子，同时在不同的条件下具有良好的稳定性。该系统的另一个成分Flp识别位点(Flp recognition target，FRT)与loxP位点非常相似，同样由两个长度为13bp的反向重复序列和一个长度为8 bp的核心序列构成。在该系统发挥作用时，FRT位点的方向决定了目的片段的缺失还是倒转。这两个系统比较明显的区别是它们发挥作用的最佳温度不同，Cre重组酶发挥作用的最佳温度为37℃，而Flp 重组酶为30℃。因此，Cre／loxP系统最适宜在动物体内使用。loxP 和FRT位点的序列如图所示
（二）条件型基因敲除
• 条件型基因敲除法可定义为将某个基因的敲除限制于小鼠某些特定类型的细胞或发育的某一特定阶段的一种特殊的基因敲除方法。

《基因敲除技术》PPT课件

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1.什么是传统机械按键设计？
传统的机械按键设计是需要手动按压按键触动PCBA上的开关按键来实现功能的一种设计方式。
传统机械按键结构层图：
按键
PCBA
开关键
传统机械按键设计要点：
1.合理的选择按键的类型，尽量选择平头类的按键，以防按键下陷。
2.开关按键和塑胶按键设计间隙建议留0.05~0.1mm，以防按键死键。 3.要考虑成型工艺，合理计算累积公差，以防按键手感不良。
系统来介导Cre 的表达，则可省去建立携带 Cre 的转基因动物的过程。
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2.2利用随机插入突变进行基因敲除。
2.2.1 原理：
此法利用某些能随机插入基因序列的病毒，细菌或其他基因载体，在目标细胞基因组中进行随机插入突变，建立一个携带随机插入突变的细胞库，然后通过相应的标记进行筛选获得相应的基因敲除细胞（原理见图5）[11,12] 。根据细胞的不同，插入载体的选择也有所不同。逆转率病毒可用于动植物细胞的插入；对于植物细胞而言农杆菌介导的T-DNA 转化和转座子比较常用；噬菌体可用于细菌基因敲除。
ｄ．选择筛选已击中的细胞：由于基因转移的同源重组自然发生率极低，动物的重组概率为10－2～10-5，植物的概率为10－4～10－5。因此如何从众多细胞中筛出真正发生了同源重组的胚胎干细胞非常重要。目前常用的方法是正负筛选法（PNS法），标记基因的特异位点表达法以及PCR法。其中应用最多的是PNS法。
并且这种效应可以传递到子代细胞中,所以 RNAi的反应过程也可以用于基因敲除。近年来，越来越多的基因敲除采用了RNAi这种更为简单方便的方法。
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2.3.1 RNAi阻断基因表达的机理双链RNA进入细胞后，能够在Dicer酶的作用下被裂

分子生物技术《转基因、基因克隆与基因敲除技术》课件

4、转基因大豆、西红柿、玉米等。
我室构建：
ALA过表达小鼠，体内血红素增加。
成功制作内含子Micro-RNA-483过表达转基因小鼠，证明了其直接靶向细胞因子信号因子3（Socs3)de 3’UTR.
（博士论文，研究其与宿主基因Igf2的表达与功能的关系）
成功制作内含子Micro-RNA-483过表达转基因小鼠—
待剔除基因
克隆载体
克隆
重组载体
切割基因使待剔除基因失去活性
连接
阳性标记基因Neor
打靶载体
HSV-tk 转入胚胎肝细胞
这样打靶载体包含了： 1、部分待剔除的基因片段，（用于与野生型的该基因进行交换重组） 2、阳性筛选标志基因（Neor ，neomycinresistance gene) 、使细胞具有抵抗G418（能被新霉素抵抗基因的表达产物分解）的能力。 3、阴性筛选标志基因即胸苷酸激酶(thymidine kinase-tk)基因，来自单纯庖疹病毒（HSV），当它在受体细胞内合成出tk时，可以分解细胞培养液中加入更昔洛韦，即gangcyclovir（一种环鸟苷酸底物)而产生有毒的分解物使细胞死亡，为阴性筛选标志。
胚胎干细胞
HSV-tk
褐色大鼠、制备基因敲除的胚胎干细胞
A
在特定基因剔除时，利用打靶载体上留下的部分待剔除的基因片段作为基因组上相同基因的同源臂，当打靶载体与细胞基因组的同源基因发生同源重组时（联会），打靶载体上的失活基因替代基因组上的基因，同时利用插入在基因同源臂之间的阳性、阴性标志基因进行筛选鉴定。
新霉素抗性基因 (neo)是真核表达载体的常用筛选标志 ,neo基因编码新霉素磷酸转移酶Ⅱ(NPTⅡ) ,能催化G418、卡那霉素等多种氨基糖苷抗生素分子磷酸化而使之失去抗菌活性

基因敲除ppt课件

LoxP
Cre
Target gene
它是将cre 基因与各种组织(位点、时间、发育阶段)
特异性的启动子连接构建载体，获得相应的转基因小鼠。即可通过诱导表达Cre 重组酶而将lox P 位点间的基因切除,从而实现特定基因在特定时间的失活。
1.2.3 Cre-LoxP系统的实验方案
（1）在胚胎干细胞（ES ）中通过置换型载体进行同源重组，向基因组靶位点引入选择标记基因，并在其两侧引入两个同向排列的Loxp位点。将该 ES细胞打入假孕母鼠中，发育成“floxed小鼠”。
•neo 基因有双重作用,一方面形成靶位基因的插入突变，同时作为正向筛选的标记。
•HSV - tk 基因是负选择基因，含有HSV - tk (胸苷激酶蛋白)的重组细胞在GANC 培养基中不能存活。
胸苷激酶蛋白（TK）可使无毒性的丙氧鸟苷（GANC）转变为毒性核苷酸而杀死细胞。
外源基因
整合到染色体的其他位置
基因转座常伴随着基因缺失、重排等，因而可以应用到基因敲除。
1.3.2 基因敲除与RNAi的关系
•RNAi是指通过双链RNA介导特异性降解靶mRNA，导致转录后水平基因沉默的现象。 •RNAi是从转录水平抑制基因的作用，也可以看作是基因敲除的一种形式。
DNA mRNA
（2）显微注射方法获得转基因“Cre 小鼠”，此转基因小鼠在特定的启动子下表达Cre重组酶。（3）“Cre小鼠”跟“floxed小鼠”交配，Cre 重组酶会切掉Loxp位点之间的靶基因和1个 Loxp位点，从而达到靶基因的失活或敲除。
此外，还可以从细胞水平进行Cre-LoxP系统实验。
1.3 其他基因敲除技术
3’ 5’
Exo蛋白 3’ 5’

基因编辑技术和原理讲述 ppt课件

连接而成的ZFN可识别24 bp的特异性序列，由此揭开了ZFN
在基因组编辑中的应用。
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ZFN 由锌指蛋白(ZFP)和 FokⅠ核酸内切酶组成。其中，由 ZFP 构成的 DNA 识别域能识别特异位点并与之结合，而由FokⅠ构成的切割域能执行剪切功能，两者结合可使靶位点的双链DNA 断裂 (DSB)。于是，细胞可以通过同源重组(HR)修复机制和非同源末端连接(NHEJ)修复机制来修复 DNA。HR 修复有可能会对靶标位点进行恢复修饰或者插入修饰，而 NHEJ 修复极易发生插入突变或缺失突变。两者都可造成移码突变，因此达到基因敲除的目的。
端连接和同源重组修复两条途径。
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4
• 1.非同源末端连接（NHEJ ）是一种低保真度的修
复过程，断裂的DNA 修复重连的过程中会发生碱基随
机的插入或丢失，造成移码突变使基因失活,实现目的
基因敲除。如果一个外源性供体基因序列存在，NHEJ
机制会将其连入双链断裂DSB 位点，从而实现定点的
基因敲入。
录的 sgRNA 折叠成特定的三维结构后与 Cas9 蛋白形
成复合体, 指导 Cas9 核酸内切酶识别特定靶标位点,
在 PAM 序列上游处切割 DNA 造成双链 DNA 断裂, 并
启动 DNA 损伤修复机制. 从不同菌种中分离的
CRISPR/Cas 系统, 其 CrRNA(或者是人工构建的sgRNA)
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基因编辑原理
PPT课件
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基因编辑技术的种类
目前主要有 3 种基因编辑技术，分别为：人工核酸酶介导的锌指核酸酶(zinc- finger nucleases，ZFN)
技术；转录激活因子样效应物核酸酶(transcription activator- like

基因功能研究技术之基因敲除及基因编辑技术ppt课件

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（二）条件型基因敲除
• 条件型基因敲除法可定义为将某个基因的敲除限制于小鼠某些特定类型的细胞或发育的某一特定阶段的一种特殊的基因敲除方法。
• 该系统在80年代被引入后，已成功被应用于酵母菌、植物、哺乳动物细胞及小鼠身上。
• 现阶段条件型基因敲除以噬菌体的Cre/Loxp系统和酿酒酵母的FLP/FRT系统应用最为广泛。
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Cre/loxP系统作. 用原理示意图
14
FLP／FRT 系统
• 该系统与Cre／loxP系统相同，也是由一个重组酶和一段特殊的DNA 序列组成。从进化的角度上考虑，Flp／FRT系统是Cre／loxP系统在真核细胞内的同源系统。其中，重组酶Flp是酵母细胞内的一个由423 个氨基酸组成的单体蛋白。与Cre相似，Flp发挥作用也不需要任何辅助因子，同时在不同的条件下具有良好的稳定性。该系统的另一个成分Flp识别位点(Flp recognition target，FRT)与loxP位点非常相似，同样由两个长度为13bp的反向重复序列和一个长度为8 bp的核心序列构成。在该系统发挥作用时，FRT位点的方向决定了目的片段的缺失还是倒转。这两个系统比较明显的区别是它们发挥作用的最佳温度不同，Cre重组酶发挥作用的最佳温度为37℃，而Flp重组酶为30℃。因此，Cre／loxP系统最适宜在动物体内使用。loxP和FRT位点的序列如图所示
博士专题：基因功能研究技术之 ——基因敲除、基因编辑技术
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II、基因敲除：可以使基因的功能完全缺失
• 基因敲除，又称基因打靶，是一种遗传工程技术，是在转染细胞中发生外源打靶基因与核基因组目标基因之间的DNA同源重组，能够使外源基因定点地整合到核基因组的特定位置上，从而达到改变细胞遗传特性的目的。

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靶向基因技术
• 经典方法：
– 自杀质粒，同源重组 – 几率低(~1 HR event per 106 cells），难！
• 饱含希望与失望的技术：
– ZFN，被Sigma公司垄断
• 新的里程碑：
– TALEN
TALEN技术
基于TALEN (transcription activator-like (TAL) effector nucleases，类转录因子效应物核酸酶)的靶向基因敲除技术是一种崭新的分子生物学工具，现已应用于细胞、酵母、斑马鱼与大鼠等各类研究对象。
• 常见的几种诱导型基因敲除类型有：四环素诱导型；干扰素诱导型；激素诱导型；腺病毒介导型。
III、基因编辑技术
• ZFN系统 • TALEN系统 • CRISPR/Cas 系统
（一）ZFN技术系统
ZFN 技术原理
锌指核酸酶（Zinc-finger nucleases, ZFN）是人工改造的限制性核酸内切酶，利用不同的锌指结构识别特异DNA序列，利用核酸酶切断靶DNA。
• 一篇人类干细胞《Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases》
• 一篇大鼠《Knockout rats generated by embryo microinjection of TALENs》
• 两篇斑马鱼《Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs》
• 条件型基因敲除法可定义为将某个基因的敲除限制于小鼠某些特定类型的细胞或发育的某一特定阶段的一种特殊的基因敲除方法。
• 该系统在80年代被引入后，已成功被应用于酵母菌、植物、哺乳动物细胞及小鼠身上。
• 现阶段条件型基因敲除以噬菌体的Cre/Loxp系统和酿酒酵母的FLP/FRT系统应用最为广泛。
Cre/loxP系统作用原理示意图
FLP／FRT 系统
• 该系统与Cre／loxP系统相同，也是由一个重组酶和一段特殊的 DNA序列组成。从进化的角度上考虑，Flp／FRT系统是Cre／loxP 系统在真核细胞内的同源系统。其中，重组酶Flp是酵母细胞内的一个由423个氨基酸组成的单体蛋白。与Cre相似，Flp发挥作用也不需要任何辅助因子，同时在不同的条件下具有良好的稳定性。该系统的另一个成分Flp识别位点(Flp recognition target，FRT)与loxP位点非常相似，同样由两个长度为13bp的反向重复序列和一个长度为8 bp的核心序列构成。在该系统发挥作用时，FRT位点的方向决定了目的片段的缺失还是倒转。这两个系统比较明显的区别是它们发挥作用的最佳温度不同，Cre重组酶发挥作用的最佳温度为37℃，而Flp 重组酶为30℃。因此，Cre／loxP系统最适宜在动物体内使用。loxP 和FRT位点的序列如图所示
…… 14 – 18个重复真核表达
34氨基酸单元
…… 14 – 18个重复
特异识别指定的14 -18 个核酸序列并与之结合
TALEN 发展过程
TALEN 基因敲除
TALEN (TALE+FOK I) 表达质粒对
TALEN 表达质粒对转染、表达切割靶位点
切割诱发DNA损伤修复机制（nonhomologous end-joining， NHEJ）。由于在此修过程中总是有一定的错误率存在。在修复中发生移码突变错误的个体即形成目标基因敲除突变体
条件型基因打靶的优势： 1. 克服了重要基因被敲除所导致的早期致死 2. 并能客观、系统地研究基因在组织器官发生、发育以及
疾病发生、治疗过程中的作用和机制
这一技术亦存在一些缺点： 1. 费用太高 2. 周期较长 3. 许多基因在剔除后并未产生明显的表型改变，可能是这
些基因的功能为其他基因代偿所致
（三）诱导型基因敲除
X2 X2
5. 检测突变效率，筛选（移码） Mut 突变体
• 锌指结构中每一个α螺旋可以特异识别 3-4个碱基；
• 人工设计识别特异DNA序列的α螺旋采用如上的通用序列，通过改变其中7个 X来实现识别不同的三联体碱基， TGEK是多个螺旋间的连接序列；
• 构建成对人工锌指结构域和FokI融合蛋白（ZFN）可以在指定区域切断 DNA双链。
• 单个ZFN的DNA结合结构域一般包含3-6个Cys2-His2锌指结构域，每个锌指结构域能特异识别1个三联体碱基，与锌指蛋白相连接的非特异性核酸内切酶来自FokI的C端 96个氨基酸残基组成的DNA剪切域，每个FokI单体与一个锌指蛋白组相连构成一个ZFN，识别特定的位点，但2 个识别位点相距6-8bp距离时，2个单体ZFN相互作用产生酶切功能。在此特异位点产生1个DNA双链切口，然后利用固有的同源重组或非同源末端连接修复机制进行切口修复。从而达到对精确位点进行定点修饰的目的。
基因功能研究技术之 ---基因敲除、基因编辑技术
II、基因敲除：可以使基因的功能完全缺失
• 基因敲除，又称基因打靶，是一种遗传工程技术，是在转染细胞中发生外源打靶基因与核基因组目标基因之间的DNA同源重组，能够使外源基因定点地整合到核基因组的特定位置上，从而达到改变细胞遗传特性的目的。
• 传统的基因敲除技术依赖于细胞内自然发生的同源染色体的随机交换，但在体细胞内，基因同源重组的效率特别低（低于 10-6），增加了实际操作的工作量，限制了该项技术的应用。
• 但是，该技术制备复杂，成本昂贵，而且其技术专利被少数几家商业公司控制。
（二）
崭新的技术解决经典的挑战
崭新的技术 - TALEN 经典的挑战 – 染色体DNA序列的人工编辑修改
• （点）突变：Silห้องสมุดไป่ตู้nt；Missense； Nonsense；Frame shift （基因敲除， Knockout） • 片段删除 • 片段插入目的与用途：生物模型；表达工具；基因治疗
• 条件型基因敲除是指通过定位重组系统实现特定时间和空间的基因敲除。
• 诱导型基因敲除是通过对诱导剂给予时间的控制，在动物的一定发育阶段和一定组织细胞中实现对特定基因进行敲除的技术。
（一）完全基因敲除
• 基因载体的构建：把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA 分子都重组到带有标记基因(如neo 基因，TK 基因等)的载体上，成为重组载体。基因敲除是为了使某一基因失去其生理功能，所以一般设计为替换型载体。
《Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENs》
• 一篇综述
《Move over ZFN》
1. 选择、确定靶点 2. TALE识别模块串联构建
TALEN靶向（基因敲除）技术基本流程
X2
3. TALEN真核表达质粒构建
4. TALEN真核表达质粒转入（卵）细胞，表达TALEN重组蛋白
技术原理：
表达一个重组核酸酶，在靶点识别结构域的作用下，核酸酶识别靶点核酸序列，并发挥内切酶活性，从而打断目标基因，完成基因敲除的过程。
TALEN 发展过程
• 1989年植物病原体黄单胞菌属（Xanthomonas spp.） avrBs3 基因被克隆。
• 2007年发现其序列特异性核酸结合特性， avrBs3 – TA
1987年，Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型，此后基因敲除技术得到进一步的发展和完善，目前该技术已经成为研究基因功能最直接、最有效的方法之一。
• 基因敲除技术分为完全基因敲除、条件型基因敲除、诱导型基因敲除。
• 完全基因敲除是指通过同源重组法完全消除细胞或动物个体中的靶基因活性。
• 诱导型基因敲除法也是利用Cre/Loxp系统为基础，利用控制Cre表达的启动子的活性或所表达的Cre酶活性具有可诱导的特点，通过对诱导剂给予时间的控制从而在动物的一定发育阶段和组织细胞中实现对特定基因的敲除。
• 由Cre/Loxp系统和诱导系统两个部分组成。Loxp 转基因动物是用常规基因打靶技术构建成的，基因组中待修饰区域两端各携带1个Loxp位点的转基因动物。诱导系统是指所携带的Cre基因的表达或所表达的Cre的酶活性具有可诱导性的转基因动物。人们可以通过对诱导剂给予时间的预先设计来对动物基因敲除的时空特异性进行人为控制，以避免出现死胎或动物出生后不久即死亡的现象。
• 5' - ATAACTTCGTATA - ATGTATGC - TATACGAAGTTAT - 3' • 3' - TATTGAAGCATAT - TACATACG - ATATGCTTCAATA - 5'
• Cre-LoxP系统的特性
条件性基因敲除法可定义为将某个基因的修饰限制于小鼠某些特定类型的细胞或发育的某一特定阶段的一种特殊的基因敲除方法。它实际上是在常规的基因敲除的基础上，利用重组酶Cre介导的位点特异性重组技术，在对小鼠基因修饰的时空范围上设置一个可调控的“按钮”，从而使对小鼠基因组的修饰的范围和时间处于一种可控状态。
• 2009年 Xanthomonas TA氨基酸序列与核酸靶序列的对应关系被破译
由34个aa组成一个单元模块，重复17 -18次 34个aa中的第12和13个氨基酸（Repeat Variant Diresidue, RVD) 对应识别一个目标碱基
人工构建TALE模块识别指定核酸序列
102碱基模块单元
Cre-LoxP重组酶系统
• Cre-LoxP重组酶系统在新型基因打靶中获得广泛应用，是条件型基因打靶、诱导型基因打靶、时空特异性基因打靶策略的技术核心。
Cre-LoxP重组酶系统