【CN109557065A】一种检测土壤中-D-葡萄糖苷酶活性的分析方法【专利】

第26卷第2期2007年3月 食品与生物技术学报Journal of Food Science and Biotechnology V o l.26　N o.2M ar.　2007　文章编号:1673-1689(2007)02-0107-08 收稿日期:2006-12-29.作者简介:李华(1959-),男,重庆梁平人,教授,博导,主要从事分子生物学及葡萄与葡萄酒方面研究.Email :putj@β-葡萄糖苷酶活性测定方法的研究进展李华,　高丽(西北农林科技大学葡萄酒学院,陕西杨凌712100)摘　要:介绍了葡萄和葡萄酒中β-葡萄糖苷酶的研究概况,理化性质、酶活测定方法,以及不同来源的酶活检测的研究概况,并且经过分析提出以对硝基苯基β-D -葡萄糖苷(pN PG )为底物检测葡萄浆果中的β-葡萄糖苷酶酶活的关键影响因素:粗酶液的制备、酶最适反应温度、最佳反应时间、缓冲液类型和pH 及最佳吸收波长。

关键词:葡萄;β-葡萄糖苷酶;活性中图分类号:Q 55文献标识码:AResearch Advance on Methods of determining β-Glucosidase ActivityLi Hua ,　GAO Li(Colleg e of Enolo gy ,N o rthwest Univ ersity of A g riculture &Fo restry ,Yangling 712100,China )Abstract :Aro ma is one o f the impor tant factors that determining the character and quality o f w ine.β-g lucosidase is a kind of key enzy me w hich releasing aroma precurso rs.In this manuscript ,the prog re sses of the chemical pro perties ,determination methods ,and the source o f β-g lucosidase w ere review ed.On the o ther hand ,the key facto rs that involv e in the β-gluco sidasedetermination method w ith p -Nitrophenyl -β-D -gluco py ranoside as substrate as follow :tem perature ,reactio n tim e ,buffe r type ,pH and abso rb w avelength.Key words :g rape ;β-glucosidase ;activities 典型的葡萄酒风味主要源于葡萄中的挥发性化合物,然而葡萄浆果中存在着游离态和结合态两大类呈香物质。

土壤酶活性测定方法土壤脲酶的测定方法（苯酚钠—次氯酸钠比色法）一、原理脲酶存在于大多数细菌、真菌和高等植物里。

它是一种酰胺酶作用是极为专性的，它仅能水解尿素，水解的最终产物是氨和二氧化碳、水。

土壤脲酶活性，与土壤的微生物数量、有机物质含量、全氮和速效磷含量呈正相关。

根际土壤脲酶活性较高，中性土壤脲酶活性大于碱性土壤。

人们常用土壤脲酶活性表征土壤的氮素状况。

土壤中脲酶活性的测定是以脲素为基质经酶促反应后测定生成的氨量，也可以通过测定未水解的尿素量来求得。

本方法以尿素为基质，根据酶促产物氨与苯酚—次氯酸钠作用生成蓝色的靛酚，来分析脲酶活性。

二、试剂1）甲苯2）10%尿素：称取10g尿素，用水溶至100ml。

3）柠檬酸盐缓冲液（PH6.7）：184g柠檬酸和147.5g氢氧化钾（KOH）溶于蒸馏水。

将两溶液合并，用1mol/LNaOH将PH调至6.7，用水稀释定容至1000ml。

4）苯酚钠溶液（1.35mol/L）：62.5g苯酚溶于少量乙醇，加2ml甲醇和18.5ml丙酮，用乙醇稀释至100ml（A液），存于冰箱中；27gNaOH溶于100ml水（B液）。

将A、B溶液保存在冰箱中。

使用前将A液、B液各20ml混合，用蒸馏水稀释至100ml。

5）次氯酸钠溶液：用水稀释试剂，至活性氯的浓度为0.9%，溶液稳定。

6）氮的标准溶液：精确称取0.4717g硫酸铵溶于水并稀释至1000ml，得到1ml含有0.1mg 氮的标准液；再将此液稀释10倍（吸取10ml标准液定容至100ml）制成氮的工作液（0.01mg/ml）。

三、操作步骤称取5g土样于50ml三角瓶中，加1ml甲苯，振荡均匀，15min后加10ml10%尿素溶液和20ml PH 6.7柠檬酸盐缓冲溶液，摇匀后在37℃恒温箱培养24小时。

培养结束后过滤，过滤后取1ml滤液加入50ml容量瓶中，再加4ml苯酚钠溶液和3ml次氯酸钠溶液，随加随摇匀。

20min后显色，定容。

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810891591.4(22)申请日 2018.08.07(71)申请人 浙江农林大学地址 311300 浙江省杭州市临安市环城北路88号(72)发明人 梁辰飞　赵均宁　赵安英　卜爱爱　刘亦荐　陆潇　(74)专利代理机构 安化县梅山专利事务所43005代理人 夏赞希(51)Int.Cl.G01N 21/31(2006.01)(54)发明名称一种使用DNS法测定土壤中葡萄糖的方法(57)摘要本发明属于土壤检测领域，具体的说是一种使用DNS法测定土壤中葡萄糖的方法，包括以下步骤：步骤A、浸提土壤中的葡萄糖；步骤B、过滤葡萄糖浸提液；步骤C、DNS试剂制取；步骤D、样品测定：通过测定定容后的溶液在λ＝540nm处的吸光度，从而计算测定培养过程中土壤里葡萄糖的剩余量，在使用葡萄糖的土壤培养实验中，可以不用同位素标记的方法即可测出土壤中存留的葡萄糖余量，而且比较精确，回收率高。

权利要求书1页 说明书4页 附图1页CN 108956499 A 2018.12.07C N 108956499A1.一种使用DNS法测定土壤中葡萄糖的方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤A、浸提土壤中的葡萄糖：用电子天平称取15g鲜土样品装入30mL的离心管中，再加入15mL蒸馏水，放在25℃的震荡仪中以150r/min震荡30min后，然后放在3000r/min的速度离心机中离心10min；步骤B、过滤葡萄糖浸提液：用15mL的针筒吸取步骤A离心所得的上清液，再用0.22μ的水系的针头过滤器过滤，将滤液收集在灭菌的10mL离心管中待测；步骤C、DNS试剂制取：将5.0g 3,5-二硝基水杨酸溶于200mL 2mol/L NaOH溶液中，再加入500mL含130g酒石酸钾钠的溶液，缓慢混匀后加入5g结晶酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解后，定容至1000mL放置在暗处保存备用；步骤D、样品测定：在25ml的比色管里加入步骤B过滤后的葡萄糖浸提液1mL，再加入1mL 蒸馏水和步骤C制取的2mL DNS试剂，将试管内液体混匀之后，放在水浴锅中沸水浴5min，待冷却后用蒸馏水定容至25ml，测定定容后的溶液在λ＝540nm处的吸光度，从而计算测定培养过程中土壤里葡萄糖的剩余量。

专利名称：一种检测凋落物β-葡萄糖醛酸苷酶活性的方法专利类型：发明专利
发明人：刘兵,耿莉,刘怡,徐杰,曲朝磊,杨艺红,孙辉
申请号：CN202010062495.6
申请日：20200119
公开号：CN112210586A
公开日：
20210112
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种检测凋落物β‑葡萄糖醛酸苷酶活性的方法，涉及凋落物酶活性检测的技术领域。

该方法包括以下步骤：1)在凋落物碎屑中加入培养缓冲液，低温孵育，离心收集滤液，进一步稀释得到酶活测试液；并制备灭活对照酶液；2)制作MUB浓度与吸光值之间关系的标准曲线；3)将酶活测试液和灭活对照酶液分别添加到酶活测试孔和阴性孔，然后加入4‑MUB‑β‑D‑葡萄糖醛酸苷工作液，避光震荡孵育，反应结束后加入终止液终止反应，在检测条件下，读取荧光值；4)根据标准曲线，计算β‑葡萄糖醛酸苷酶比酶活。

本发明酶液耗量少、操作强度小；灵敏度呈数量级提高；且测试液pH对上机数据没有影响，能够真实反映凋落物中酶活性。

申请人：南京林业大学
地址：210037 江苏省南京市玄武区龙蟠路159号
国籍：CN
代理机构：南京申云知识产权代理事务所(普通合伙)
代理人：邱兴天
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葡萄糖底物UV分光光度法是一种用于测定酶活的常见方法。

本文将介绍葡萄糖底物UV分光光度法的原理、步骤及其在生物化学和生物医学研究中的应用。

一、原理1. 葡萄糖酶（也称葡萄糖氧化酶）能够催化葡萄糖与氧气在水溶液中发生氧化反应，生成葡萄糖内酯和过氧化氢。

这个氧化反应是可以通过UV分光光度法测定的。

2. 葡萄糖底物UV分光光度法的原理是通过测定在酶催化下葡萄糖与氧气反应所产生的过氧化氢的浓度变化来间接测定酶的活性。

二、步骤1. 样品处理：将待测样品中的葡萄糖与底物混合，使底物的浓度在一定范围内，以确保底物的过量不会影响酶的活性测定。

2. 加入酶液：将一定量的葡萄糖酶加入混合液中，并在一定温度下孵育一段时间，使酶与底物发生反应。

3. 反应停止：加入一种化学试剂使反应停止，同时转化过氧化氢形成一种有色产物。

4. 测定吸光度：使用紫外-可见分光光度计测定产生的有色产物的吸光度，根据标准曲线计算出反应体系中的过氧化氢的浓度。

5. 计算酶活：根据过氧化氢的浓度变化和所加的酶的蛋白质含量等数据，计算出酶的活性。

三、应用1. 生物化学研究中的应用：葡萄糖底物UV分光光度法广泛应用于酶动力学研究中，可以用来测定各种酶的活性及其对底物的亲和力。

2. 生物医学研究中的应用：在生物医学研究中，葡萄糖底物UV分光光度法可以用来研究酶与疾病的关联性，例如糖尿病患者血清中的葡萄糖酶活性与血糖水平的关系。

结论葡萄糖底物UV分光光度法是一种简单、敏感、精确的酶活测定方法，具有广泛的应用前景和重要的科研意义。

通过对葡萄糖底物UV分光光度法的原理、步骤及应用进行了解和掌握，可以更好地指导实验操作并推动生物化学和生物医学领域的研究进展。

近年来，随着生物技术的不断发展，葡萄糖底物UV分光光度法在生物医学研究中的应用越发广泛。

除了用于酶动力学研究和疾病相关性分析外，葡萄糖底物UV分光光度法还在其他领域展现出了巨大的潜力。

1. 新药研发在新药研发过程中，葡萄糖底物UV分光光度法被用于筛选潜在的药物候选化合物。

专利名称：一种葡萄糖氧化酶酶活性的测量方法专利类型：发明专利
发明人：洪军,耿方勇,肖保林
申请号：CN201610142392.4
申请日：20160314
公开号：CN105586388A
公开日：
20160518
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明涉及一种葡萄糖氧化酶酶活性的测量方法，具体为：1）配置pH值为5.8的磷酸盐缓冲液，然后室温下依次加入辣根过氧化物酶液、葡萄糖氧化酶液、愈创木酚和葡萄糖溶液；2）采用紫外可见光分光光度计进行时间扫描，获得产物四邻甲氧基连酚的吸光值随时间的变化数据；3）根据朗伯比尔定律将四邻甲氧基连酚的吸光值换算为浓度，然后以时间为横坐标，浓度为纵坐标，在excel中作散点图，添加趋势线，趋势线斜率即为四邻甲氧基连酚的生成速率，该生成速率乘以系数4即得到葡萄糖氧化酶催化葡萄糖的反应速率，再根据酶活力单位定义进行换算即得到葡萄糖氧化酶酶活性。

该方法具有操作简便，反应现象明显，灵敏度高，重复性好等优点。

申请人：河南大学
地址：475001 河南省开封市明伦街85号
国籍：CN
代理机构：郑州联科专利事务所(普通合伙)
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土壤月尿酶（urease^）活性的测定方法：靛酚比色法（一）方法原理土壤中脉酶活性的测定是以尿素为基质，酶促水解生成的氨与酚类化合物起反应生成蓝色的靛酚，颜色深度与氨含量相关，因而用丁脉酶活性的测定。

（二）试剂D甲苯2）10%尿素：称取10g尿素，用水溶至100mL。

3）柠檬酸盐缓冲液（PH6.7） : 184克和147.5克氢氧化钾溶丁蒸僻水。

将两溶液合并，用1mol/LNaOH将PH调至6.7,用水稀释至1000毫升。

4）苯酚钠溶液（1.35mol/L） : 62.5克苯酚溶丁少量乙醇，加2毫升甲醇和18.5毫升丙酮，用乙醇稀释至100毫升（A）,存丁冰箱中；27克NaOH溶丁100毫升水（B）。

将A、B溶液保存在冰箱中。

使用前将2溶液各20毫升混合，用蒸僻水稀释至100毫升。

5）次氯酸钠溶液：用水稀释试剂，至活性氯的浓度为0.9%,溶液稳定。

6）氮的标准溶液：精确称取0.4717克硫酸铉溶丁水并稀释至1000mL,得到1mL含有0.1mg氮的标准液。

（三）测定步骤（1）标准曲线绘制吸取配置好的氮溶液10mL,定容至100mL,即稀释了10倍，吸取1, 3, 5, 7, 9, 11, 13mL移至50mL容量瓶，加水至20mL,再加入4mL苯酚钠，仔细混合，加入3mL 次氯酸钠，充分摇荡，放置20分钟，用水稀释至刻度。

将着色液在紫外分光光度计上丁578nm处进行比色测定，以标准溶液浓度为横坐标，以光密度值为纵坐标绘制曲线图。

（2）土壤中脉酶活性的测定称取10 g 土壤置丁100mL容量瓶中。

用2mL甲苯处理15分钟。

往瓶中加入10mL 10%尿素溶液和20mL柠檬酸缓冲液（pH6.7）。

仔细混合后，将瓶放在37C包温箱中，放置3 ho与此同时，进行以水代替基质，及无土壤的基质对照测定。

培养结束后，用热至38C的水稀释至刻度。

摇匀，将悬液过滤。

吸取1mL 滤液丁50mL容量瓶中，用蒸僻水加至10mL。

土壤N-乙酰-β-D-葡萄糖苷酶（S-NAG）检测
土壤N-乙酰-β-D-葡萄糖苷酶（Soil N-acetyl-β-D-glucosidase, S-NAG）是一种酸性水解酶，主要分布于土壤微生物的溶酶体中，其活性变化与机体某些病理状态密切相关。

土壤N-乙酰-β-D-葡萄糖苷酶的测定原理：S-NAG分解对硝基苯β-N-乙酰氨基葡萄糖苷生成对-硝基苯酚，后者在400nm有最大吸收峰，通过测定吸光值升高速率来计算土壤N-乙酰-β-D-葡萄糖苷酶活性。

迪信泰检测平台采用生化法，可高效、精准的检测土壤N-乙酰-β-D-葡萄糖苷酶活性变化。

此外，我们还提供其他土壤酶类检测服务，以满足您的不同需求。

生化法测定土壤N-乙酰-β-D-葡萄糖苷酶样本要求：
1. 请确保样本量大于0.2g或者0.2mL。

周期：2~3周
项目结束后迪信泰检测平台将会提供详细中英文双语技术报告，报告包括：
1. 实验步骤（中英文）
2. 相关参数（中英文）
3. 图片
4. 原始数据
5. 土壤N-乙酰-β-D-葡萄糖苷酶活性信息。

土壤酶活性测定方法土壤酶活性测定方法一、蔗糖酶: 3，5-二硝基水杨酸比色法1. 试剂配制（1）2N氢氧化钠200mL：称取16g 氢氧化钠，用蒸馏水溶解，定溶于200mL容量瓶中。

（2）3，5-二硝基水杨酸溶液1000mL：称5g二硝基水杨酸，溶于200mL2N氢氧化钠和500mL蒸馏水中，再加300g酒石酸钾钠，用蒸馏水稀释至1000mL（不超过7天）。

（3）1/15M 磷酸氢二钠1000mL：23.867g N a2HPO4·12H2O 溶于1000mL蒸馏水中。

（4）1/15M 磷酸二氢钾1000mL：9.078g KH2PO4溶于1000mL蒸馏水中。

（5）pH5.5磷酸缓冲液100mL：5 mL磷酸氢二钠(1/15M)加95mL磷酸二氢钾(1/15M) （6）8%蔗糖1000mL：称取80g蔗糖，用水溶解，稀释至1000mL。

（7）甲苯。

（8）标准葡萄糖溶液（1mg/mL）1000mL：取少量葡萄糖在真空干燥箱中，于55℃条件下真空干燥至恒重。

然后取1.00g葡萄糖溶于100ml蒸馏水中成标准葡萄糖母液（10mg还原糖/ml）。

取此母液10ml, 用蒸馏水定容至100mL即成标准葡萄糖液（1mg/ml）；2. 操作步骤（1）标准曲线绘制：分别取标准葡萄糖液0.4mL，0.8 mL，1.2mL, 1.6mL, 2.0mL,2.8mL, 3.2mL于50 mL比色管中，另取一管做空白对照。

用蒸馏水补足至10mL。

加入3.0mL 3，5-二硝基水杨酸，沸水浴5min，随即在自来水流下冷却。

最后用蒸馏水稀释至50mL，并在分光光度计上于波长508nm处进行比色。

比色后，以光密度值为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标绘制成标准曲线。

（2）土壤蔗糖酶活性测定：称5.00g土样，置于50mL三角瓶中，注入15.0mL 8%蔗糖溶液，5.0mL pH5.5磷酸缓冲液和5滴甲苯。

摇匀混合物后，放入恒温箱，在37℃下培养24h。

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910808644.6(22)申请日 2019.08.29(71)申请人 中山大学地址 510275 广东省广州市海珠区新港西路135号(72)发明人 杨立群　尹林　吴柔君　魏书玥　罗嘉浩　(74)专利代理机构 广州粤高专利商标代理有限公司 44102代理人 赵崇杨(51)Int.Cl.G01N 24/08(2006.01)G01N 1/38(2006.01)(54)发明名称一种高效、快速检测α-葡萄糖苷酶活性的方法(57)摘要本发明公开了一种高效、快速检测α-葡萄糖苷酶活性的方法，该方法以寡糖作为反应底物，利用1H NMR法检测α-葡萄糖苷酶分解寡糖产生的葡萄糖的量来计算α-葡萄糖苷酶比活力值。

本发明检测α-葡萄糖苷酶活性具有高效、快速的优点，所采用的底物和反应条件更能体现α-葡萄糖苷酶水解反应的客观性和真实性。

本发明的工艺简单、操作方便，所需材料稳定且廉价。

本发明作为一种高效、快速检测α-葡萄糖苷酶活性的方法，有望应用于α-葡萄糖苷酶活性检测的相关科研及医疗诊断。

权利要求书2页 说明书10页 附图2页CN 110823939 A 2020.02.21C N 110823939A1.一种检测α-葡萄糖苷酶活性的方法，其特征在于，包括如下步骤：S1.将寡糖底物溶解于pH 4～8缓冲溶液中，得到寡糖底物溶液；S2.将α-葡萄糖苷酶溶解于pH 4～8缓冲溶液中，得到α-葡萄糖苷酶溶液；S3.取等体积比的寡糖底物溶液与α-葡萄糖苷酶溶液，混匀，20～40℃反应1～60分钟；S4.将步骤S3的反应溶液于沸水中煮沸1～10分钟，冷却至20～40℃，再冷冻高速离心；S5.将S4步骤离心所得上清液装入一端封管的毛细管内，然后将另一端封端；S6.将S5步骤所得样品毛细管装入含有内标及氘代试剂的核磁测试管中，进行NMR测试，得到反应溶液的1H NMR谱图；S7.将S1步骤所得寡糖底物溶液重复S5和S6操作，得到寡糖底物溶液的1H NMR谱图；S8.对步骤S6和S7所得的1H NMR谱图进行解析，以下述公式得到每毫克α-葡萄糖苷酶固体样品每分钟产生葡萄糖产物的微摩尔数即α-葡萄糖苷酶的比活力：式中，t为反应时间(min)；w为α-葡萄糖苷酶固体样品的质量(mg)；N0为寡糖的初始物质的量(mmol)；Iβ-Ha为反应t时间后葡萄糖中β-H a质子的峰面积积分；I内标为内标物的质子峰面积积分；I0为寡糖的初始H b质子的峰面积积分。