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甲状腺恶性潜能未定的高分化肿瘤差异表达蛋白的蛋白质组学分析唐铭;杨慧;刘鹏杰;徐敏洁;张迎红;陈天星【摘要】Objective To identify the differential expression proteins in thyroid well-differentiated tumour of uncertain malignant potential (WT-UMP) and to look for new protein biomarkers.Methods A total of 20 thyroid WT-UMP resection samples and 20 normal thyroid tissues adjacent to thyroid WT-UMP were obtained from January 2015 to December 2016 in the First People's Hospital of Yunnan Province (hereinafter referred to as "our hospital").In addition,30 blocks papillary thyroid carcinoma (PTC) were obtained from the pathology department of our hospital from January to December 2016.The total proteins which were extracted from frozen thyroid samples in each group were profiled with two-dimensional electrophoresis (2-DE).The differential protein spots were identified by PDQuest 7.3 software and identified by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-fight mass spectrometry (MALDI-TOFMS) and SWISS-PROT database.The different proteins were classified by PANTHER analysis and five differentially expressed proteins of these spots were further validated through immunohistochemistry (IHC).Results 27 proteins were identified with MS.There were 25 high expression and 2 low level expression proteins in thyroid WT-UMP.IHC revealed the following five proteins located in the cytoplasm:cytosolic non-specific dipeptidase (CNDP2),cytokeratin 18 (CK18),cathepsin B (CTSB),calreticulin (CRT).andannexin A5 (ANXA5).Four kinds of proteins include CK18,CTSB,CRT and ANXA5 were over-expressed in thyroid WT-UMP compared with normal tissues,the difference was statistically significant (P ＜ 0.05);Meanwhile,the four proteins were over-expressed in PTC compared with thyroid WT-UMP (P ＜ 0.05).Conclusion The differentially expressed protein molecules were successfully screened and identified in thyroid WT-UMP.The changes of these proteins expression may be involved in the genesis and development of thyroid WT-UMP.The newly identified protein biomarkers can positively contribute to early thyroid WT-UMP diagnosis by using IHC.%目的筛选与鉴定甲状腺恶性潜能未定的高分化肿瘤(WT-UMP)差异表达蛋白质分子,寻找新的蛋白质标志物.方法收集2015年1月～2016年12月云南省第一人民医院(以下简称“我院”)手术切除新鲜标本甲状腺WT-UMP 20例及其周围正常甲状腺组织20例,另收集2016年1～12月我院病理科甲状腺乳头状癌(PTC)蜡块30例.从冰冻新鲜样本中分别提取总蛋白进行双向凝胶电泳(2-DE),经PDQuest 7.3图像分析软件检测表达差异点,利用基质辅助激光解吸电离串联飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)和SWISS-PROT数据库对差异蛋白进行鉴定,通过PANTHER分析对差异蛋白进行分类,选择其中5种差异表达蛋白通过免疫组织化学染色进行验证.结果共鉴定出27种差异蛋白,在甲状腺WT-UMP中呈高表达的25个,呈低表达的2个.免疫组化染色显示5种蛋白Cytosolic non-specific dipeptidase (CNDP2)、Cytokeratin18(CK18)、Cathepsin B(CTSB)、Calreticulin (CRT)及Annexin A5(ANXA5)均定位于细胞浆.CK18、CTSB、CRT及ANXA5这4种蛋白的表达在WT-UMP中均高于正常甲状腺,差异有统计学意义(P＜0.05),在PTC中均高于WT-UMP,差异有统计学意义(P＜0.05).结论成功筛选了甲状腺WT-UMP差异表达蛋白质分子,这些蛋白质表达的改变,可能参与了WT-UMP的发生和发展.同时通过免疫组化的验证,有利于WT-UMP的早期诊断.【期刊名称】《中国医药导报》【年(卷),期】2018(015)007【总页数】7页(P60-65,封3)【关键词】甲状腺恶性潜能未定的高分化肿瘤;差异表达蛋白;蛋白质组学;蛋白质标志物【作者】唐铭;杨慧;刘鹏杰;徐敏洁;张迎红;陈天星【作者单位】云南省第一人民医院病理科,云南昆明650000;云南省第一人民医院病理科,云南昆明650000;云南省肿瘤医院核医学科,云南昆明市650118;云南省第一人民医院病理科,云南昆明650000;云南省第一人民医院病理科,云南昆明650000;云南省第一人民医院病理科,云南昆明650000【正文语种】中文【中图分类】R3652017年第四版内分泌肿瘤WHO分类提出了甲状腺交界性肿瘤的概念。
热带作物学报2022, 43(5): 904 914 Chinese Journal of Tropical Crops收稿日期 2021-07-27；修回日期 2022-01-11基金项目 海南省自然科学基金项目（No. 320QN336）；中国热带农业科学院基本科研业务费专项资金（No. 1630052017007，No. 1251632021004）。
作者简介 王 丹（1984—），女，硕士，研究方向：热带作物蛋白质组学。
*通信作者（Corresponding author ）：徐兵强（XUBingqiang ），E-mail ：*****************；仝 征（TONG Zheng ），E-mail ：*********************。
橡胶树PR107和CATAS8-79中胶乳蛋白的差异分析及磷酸化蛋白的鉴定王 丹1，徐兵强2*，孙 勇3，彭存智1，常丽丽1，仝 征1*1. 中国热带农业科学院热带生物技术研究所，海南海口 571101；2. 中国热带农业科学院海口实验站（热带果树研究所），海南海口 571101；3. 中国热带农业科学院橡胶研究所，海南儋州 571737摘 要：橡胶树是合成天然橡胶的重要植物。
PR107和CATAS8-79是具有不同产排胶性状的2个无性系。
在以往的研究中，胶乳中蛋白表达差异被认为是影响天然橡胶合成的关键因子之一。
然而，这2个无性系之间与胶乳产量相关的蛋白质图谱尚未明确。
本研究采用蛋白质组学方法对这些蛋白质进行鉴定，有助于探讨巴西橡胶树胶乳合成机理。
经双向凝胶电泳和质谱鉴定分析，共获得65个差异表达蛋白信息。
通过磷酸化蛋白质组分析，在PR107胶乳中鉴定出31个磷酸化蛋白质，含有74个磷酸化氨基酸残基，在CATAS8-79胶乳中鉴定出80个磷酸化蛋白质，含有166个磷酸化氨基酸残基。
橡胶延伸因子/小橡胶粒子蛋白（REF/SRPP ）家族成员被鉴定为差异表达蛋白和磷酸化修饰蛋白，这些蛋白在调节天然橡胶合成中起着重要作用。
脑和脊髓动静脉畸形血管中蛋白质表达谱的差异简介脑和脊髓动静脉畸形（CMAVM）是一种脑血管发育不良性疾病，其中血管异常增生并形成异常的血管团块。
病理生理学研究表明，CMAVM形成的主要原因是神经发育制导错误和遗传因素。
蛋白质表达是疾病的重要表型，因此对其进行研究具有重要意义。
在本文中，我们将关注脑和脊髓动静脉畸形血管中蛋白质表达谱的差异，探索其病理生理学机制。
方法我们在脑和脊髓动静脉畸形血管中分离了蛋白质，并使用质谱法分析不同样本之间的蛋白质表达。
结果使用质谱法技术，我们鉴定出了336个蛋白质，并发现46个蛋白质表达在CMAVM组中有明显变化（P<0.05）。
其中有21个蛋白质的表达水平显著上调，25个蛋白质的表达水平显著下调。
我们使用蛋白-蛋白相互作用网络对变化的蛋白质进行了功能分析和分类，大多数蛋白质与细胞外基质、细胞增殖和血管生成相关。
讨论基于我们的结果，我们推断CMAVM可能与细胞外基质和血管生成的异常有关。
我们的发现还表明，CMAVM与蛋白质网络的异常有关，这可能会导致细胞内和细胞间信号传导通路的紊乱。
此外，我们的结果还提供了进一步了解CMAVM和相关疾病病理生理学机制的机会。
我们希望我们的研究为CMAVM的预防和治疗提供新的思路和方法。
结论本研究对脑和脊髓动静脉畸形血管中蛋白质表达谱的差异进行了分析，我们发现有46个蛋白质表达在CMAVM组中有明显变化。
我们的结果指出CMAVM可能与细胞外基质和血管生成的异常有关，这为CMAVM的治疗提供了新的思路和方法。
参考文献1.Kim HJ, Cho WS, et al. Comparative proteomics analysis ofcerebrospinal fluid of patients with cerebral arteriovenous malformation. Clin Chim Acta. 2017;468:36-43.2.Liang Q, et al. Altered cerebrospinal fluid proteome in early cryptogenic hemorrhagic stroke. J Proteomics. 2019;192:42-51.3.Yu S, et al. Proteomic analysis of cerebrospinal fluid in patients with central nervous system lymphoma. Clin Proteomics. 2019;16:6.。
同位素标记相对和绝对定量蛋白组学技术筛选儿童哮喘不同病情控制水平血清差异蛋白刘姬艳;王瑛;王远照;朱佳文;戴芳甸【摘要】目的从整体蛋白水平研究不同控制水平儿童哮喘患者血清的差异性蛋白,为防治儿童哮喘提供依据.方法采用同位素标记相对和绝对定量标记结合二维液相色谱串联质谱定量蛋白组学技术筛选鉴定控制、部分控制和未控制儿童哮喘患者血清中差异表达蛋白,通过酶联免疫吸附测定法进行差异蛋白验证.结果共鉴定蛋白260种,筛选出不同控制水平儿童哮喘间两两比较均有差异的蛋白57种(变化倍数＜0.8或变化倍数＞1.2),主要参与21种生物过程,主要具有8种分子功能类型,主要为17种细胞成分类型.酶联免疫吸附测定结果显示控制组的玻连蛋白含量(573.92±412.43)μg/ml高于未控制组的(382.27±238.64)μg/ml,差异有统计学意义(P =0.0399).结论发现不同病情控制水平儿童哮喘患者血清中的差异性蛋白57种,这些差异蛋白可作为控制儿童哮喘的潜在生物学靶点.%Objective To screen serum differential proteins for childhood asthma at different control levels,which provided the basis for the prevention and treatment of childhood asthma.Methods Isobaric tags for relative and absolute quantification,two-dimensional liquid chromatography,nanoelectrospray ionization,and high-resolution tandem mass spectrometry using the hybrid quadrupole time-of-flight platform was used to screen the differential proteins in serum samples from pediatric patients with controlled,partly controlled,or uncontrolled childhood asthma.Differential proteins were validated using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).Results A total of 260 expressed proteins were identified.Among them 57differentially expressed proteins were found among the different control levels of childhood asthma (fold ＜ 0.8 or fold ＞ 1.2).The differentially expressed proteins were involved mainly in 21 biological processes and 8 molecular functions and were located in 17 cellular components.ELISA showed that the serum vitronectin level was significantly higher in controlled group [(573.92 ±412.43) μg/ml] than in uncontrolled group [(382.27 ±238.64)] μg/ml (P =0.0399).Conclusion We identified 57 differential proteins for childhood asthma at different control levels,which may be used as potential biological targets for the control of childhood asthma.【期刊名称】《中国医学科学院学报》【年(卷),期】2017(039)006【总页数】10页(P817-826)【关键词】儿童哮喘;定量蛋白组学;差异性蛋白;质谱【作者】刘姬艳;王瑛;王远照;朱佳文;戴芳甸【作者单位】杭州师范大学生命与环境科学学院,杭州310036;杭州师范大学生命与环境科学学院,杭州310036;浙江中医药大学附属第一医院儿科,杭州310006;浙江中医药大学附属第一医院儿科,杭州310006;杭州师范大学生命与环境科学学院,杭州310036【正文语种】中文【中图分类】R562.2支气管哮喘(以下简称哮喘)是严重影响人类健康的慢性气道炎症性疾病，世界卫生组织估计全球由于哮喘丧失的伤残调整生命年数目每年达到1380万，约占总伤残调整生命年的1.8%[1]，全球哮喘患病率为2.62‰～4‰，其中5岁以下儿童的患病率达8.1‰～14‰[2]。
不同强度跑台运动后男运动员尿液差异蛋白表达变化及其意义杨玲1，蔺海旗2，翁锡全3，徐国琴3，林文弢3（1.韶关学院体育学院，广东韶关512005；2.华南理工大学体育学院，广东广州510641；3.广州体育学院运动生物化学实验室，广东广州510500）摘要:目的应用蛋白质组学技术，检测不同强度跑台运动后运动员尿液中差异蛋白的表达，探讨不同强度运动后尿液蛋白质组分的变化特点及其与人体免疫功能、运动性疲劳的关联性，为运动生化监控提供科学依据和实用方法。
方法应用双向电泳法，分析8名男性运动员分别以55%、75%、85%、95%最大摄氧量（VO 2max ）的强度进行跑台运动后其尿液蛋白质组图谱的差异性表达，选取运动后差异蛋白表达量上调≥5倍且具有重复性的蛋白点，用基质辅助激光解吸电离串联飞行时间质谱法（MALDI-TOF-TOF-MS ）进行质谱分析。
结果经双向电泳确定的4种不同强度运动后尿液蛋白质组的差异性蛋白点共275个，其中，下调蛋白点85个，上调蛋白点190个；对差异蛋白表达量上调≥5倍且具有重复性的蛋白点进行质谱鉴定，共鉴定出29种蛋白，包括载脂蛋白、锌-α2-糖蛋白、免疫球蛋白、白蛋白、补体蛋白C3、甘露糖结合凝集素相关蛋白19、维生素D 结合蛋白等；生物信息学分析结果表明，这些差异蛋白的功能主要与机体免疫调节和炎症反应的生物过程关系密切。
结论蛋白质组学分析可以更好地诠释运动后尿液蛋白质组分的变化，其中差异表达的载脂蛋白、锌-α2-糖蛋白与运动后能量代谢有关，免疫球蛋白、白蛋白、补体蛋白C3、甘露糖结合凝集素相关蛋白19、维生素D 结合蛋白与运动后免疫调节有关，这为考察运动训练后人体免疫功能和疲劳状态的变化提供了理论依据与应用方法。
关键词:运动；尿液；蛋白质组；双向电泳；质谱；男运动员中图分类号:G804.2文献标志码：A文章编号：1000-5498（2021）06-0071-09DOI ：10.16099/j.sus.2021.06.005尿蛋白的组成和数量已成为评价运动后负荷强度简便、实用的指标［1］，但现有评价指标多采用尿白蛋白、β2微球蛋白、尿总蛋白等几个常见蛋白［2-4］，对于尿液蛋白质组整体的变化研究甚少；随着科技的发展，蛋白质组学技术无疑成为诠释尿蛋白携带信息最有效的方法［5］。
21差异蛋白SELDI蛋白质芯片筛选差异蛋白分子的二级鉴定摘要目的探讨以SELDI蛋白质芯片筛选后的细胞差异表达蛋白的分离和鉴定方法及其意义。
方法以经体外培养及10JAM褪黑素药物干预的内皮祖细胞差异表达蛋白质为研究对象，分别采用Tricine—SDS—PAGE和双向凝胶电泳方法进行差异蛋自分离及结果比较，以FTICR—MS二级质谱鉴定。
结果经Tricine—SDS —PAGE分离后，选取的分子量为53kDa左右的趋势性的差异表达蛋白进行FTICR—MS分析，质谱鉴定为微管蛋白一a3(吻合度评分为87)。
经双向凝胶电泳分离后，于凝胶近酸性端、分子量在72—95kD之间区域，选取蛋白表达量较高的一点，质谱鉴定其为人热休克蛋白90一Q(吻合度评分为91)。
结论在本文结果中，Tricine—SDS—PAGE对于大致35—70kDa范围的蛋白分离较清晰、重复性好，且样品用量少。
2-DE对最低上样量有较严格要求，但它能提供分子量、等电点双重参数来更准确定位所感兴趣蛋自点，且对较大分子量蛋白的分离效果更佳。
电喷雾傅立叶变换离子回旋共振高分辨质谱分辨率高且质量稳定性较好。
关键词：SELDI；Tricine—SDS—PAGE；双向凝胶电泳；质谱SELDI蛋白质芯片技术，即表面增强激光解吸离子化飞行时间质谱(surface—enhanced laser desorption／ionization—time of flight—massspectromet巧)，是蛋白质组学研究中的一项新兴技术，在识别特定蛋白质表达物、蛋自质差异分析、测定血清中小分子物质含量方面提供了新的思路与方法。
该技术已经逐渐应用与临床，目前已见其应用于传染病、肿瘤等疾病诊断筛选的临床报道【1,2】。
本课题组前文‘3，41研究建立了SELDI蛋白质芯片技术检测体外培养细胞蛋白质差异表达方法，发现与传统方法比较，SELDI技术对于5kDa以下的低分子量差异蛋白和低丰度的差异蛋白质的检出效果较佳，而且该技术具有高通量、上样量低和灵敏度高等优势。
但经SELDI技术检出的差异蛋自质仅具有分子量特征，需进一步进行分离和准确鉴定。
本研究在前文基础上进一步以内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)细胞培养及褪黑素药物干预为研究对象，探讨以SELDI蛋白质芯片筛选后的细胞差异表达蛋白的进一步分离和鉴定方法及其意义。
1.1研究对象采用10μM褪黑素作用于培养至第7天并经免疫组化鉴定人脐血来源的EPCs，37℃、5％CO2条件下培养24小时后，经细胞裂解提取的细胞总蛋自(样品于一80。
C贮存)，分别采用Tricine—SDS—PAG双向凝胶电泳方法进行分离蛋自及结果比较，采用二级质谱鉴定。
2方法2.1差异蛋白质电泳方法选择2.1.1 Tricine—SDS—PAGE分离蛋白(1)溶液的配制：Tricine—SDS—PAGE的凝胶由不同分子组成的丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺混合液聚合而成。
其中浓缩胶由3C丙烯酰胺储存液配成4％的丙烯酰胺溶液聚合而成，夹层胶由3C丙烯酰胺储存液配成10％的丙烯酰胺溶液聚合而成，致密胶由5C丙烯酰胺储存液或6C丙烯酰胺储存液配成16．5％的丙烯酰胺溶液(添加或不添加36．5％尿素)聚合而成。
凝胶配方如下表。
丙烯酰胺储存液配制：(D3C丙烯酰胺储存液：将489丙烯酰胺和1．59甲叉双丙烯酰胺溶于重蒸水中至100mL。
②5c丙烯酰胺储存液：用重蒸水溶解479丙烯酰胺和2．59甲叉双丙烯酰胺成100ml溶液。
③6C丙烯酰胺储存液：用重蒸水溶解46．59丙烯酰胺和3．Og甲叉双丙烯酰胺成100ml溶液。
样品缓冲液：样品缓冲液由4％SDS、12％甘油、50mmol／L Tris、2％巯基乙醇(v／v)，及少许溴酚蓝组成，pH6．8。
考马斯亮蓝溶液：考马斯亮蓝G一250 100mg，95％乙醇50mL，磷酸100mL，加双蒸水定容至1000mL，用Whatman 1号滤纸过滤，4X2保存。
考马斯亮蓝脱色液：甲醇100mL，冰醋酸100mL，纯水定容至1L。
Tricine—SDS—PAGE蛋白质电泳溶液：①正极缓冲液(i0×)：121．149Tris溶于400mL重蒸水，用1．0mol／L HCI调至pH8．9，定容至500mL。
②负极缓冲液(10 X)：将60．559 Tris、89．589 Tricine及59 SDS溶于400mL 重蒸水中，加水至终体积为500mL。
③凝胶缓冲液(3X)：将181．59 Tris、1．59 SDS溶于400mL重蒸水中，用Imol／L HCI滴定至pH8．45，再加水稀释至500mL。
(2)灌胶：灌胶前，各种丙烯酰胺溶液分别加入10]aL过硫酸氨和ilaL TEMED，随即灌胶。
先灌下层的致密胶，再覆盖以中间的夹层胶，然后铺浓缩胶。
静置以聚合形成三明治式的不连续梯度凝胶。
(3)点样：取10laL蛋白质标准品，10pM药物干预后细胞提取蛋白，煮沸5min 使蛋自质与SDS结合变性，小心点入凝胶的点样孔中。
(4)电泳：内槽加负极电泳缓冲液，外槽加正极电泳缓冲液，形成Trcine—SDS—PAGE电泳系统，20mA恒流电泳3h。
考马斯亮兰染色后，用甘油溶液孵育，并用凝胶成像仪成像。
2．1．2双向凝胶电泳分离蛋白(1)用2D clean—up试剂盒抽提蛋自样品(除杂)(2)用双向电泳蛋白定量试剂盒测定样品浓度(3)双向电泳分离样品I第一向等电聚焦(IEF)①将上述除杂后的样品，加水化液振荡溶解，放入标准型胶条槽中。
②选用7cm IPG胶条，从酸性端(标“+”端)一侧剥去保护膜，胶面朝下，先将IPG胶条阳极端朝标准型胶条槽的尖端方向放入胶条槽中，慢慢下压胶条，并前后移动，避免产生气泡，最后放下IPG胶条平端(阴极)，使水化液浸湿整个胶条，并确保胶条的两端与槽的两端的电极接触。
③IPG胶条上覆盖适量Immobiline DryStrip覆盖油，盖上盖子。
将标条槽的尖端背面阳极与IPGphor仪器的阳极平台接触；胶条槽的平端背与IPGphor仪器的阴极平台接触。
④设置IPGphor仪器运行参数：Ettan TM IPGphor II TM Prot#3．File 7cm(20℃，50μA／Strip)Step1 Stp 30V 14hStep2 Stp 200V lhStep3 Stp 500V lhStep4 Grd 1000V lhStep5 Grd 2000V lhStep6 Grd 5000V lhStep7 Stp 5000V 15000(v·h)Step8 Stp 200V 3hStep9 Stp 0V END⑤配制平衡胶条所需溶液：4X分离胶缓冲液(1．5M Tris—HCI，pH8．8和0．4％(w／v}SDS)：45．59Tris和lgSDS溶于200mL去离子水中，用6N HCl调节pH到8．8，最后用去离子水将体积补足到250mL，加入25mg叠氮钠并过滤。
平衡缓冲液(0．05M Tris—HCl，pH8．8，6M尿素，30％(w／v)甘油和2％(W／v}SDS)：1809尿素，1509甘油，109 SDS和16．7mL分离胶缓冲液溶于去离子水中，最终将体积补足到500mL。
溴酚蓝溶液：25mg溴酚蓝溶于10mL分离胶缓冲液中。
⑥IPG胶条的第1次平衡：取出IPG胶条放入玻璃管中，加入使用前加入25mgDTT的2．5mL平衡缓冲液和12．5BL溴酚蓝溶液，用Parafilm封口，在振荡仪上振荡15min，倒掉平衡缓冲液。
IPG胶条的第2次平衡：加入使用前加入100mg碘乙酰胺的2．5mL平衡缓冲液和12．5BL溴酚蓝溶液，用Parafilm 封口，在振荡仪上振荡15min，倒掉平衡缓冲液。
⑦用去离子水润洗IPG胶条1秒钟，将胶条的边缘置于滤纸上数分钟，以去除多余的平衡缓冲液。
⑧IPG胶条的转移：将IPG胶条放在位于玻璃板之间的凝胶面上，使胶条支持膜贴着其中的一块玻璃板，用一薄尺将IPG胶条轻轻向下推，使整个胶条下部边缘与板胶的上表面完全接触。
确保在IPG胶条与板胶之间以及玻璃板与塑料支持膜间无气泡产生。
⑨加入分子量标准蛋白质：分子量标准蛋白质溶液与等体积的1％琼脂糖溶液混合后，加入到IEF上样滤纸片上，然后用镊子将上样滤纸片放置在IPG胶条末端一侧，与板胶的凝胶表面接触。
⑩用琼脂糖密封液封顶：用少量的密封液(约1一1．5mL)使IPG胶条被完全覆盖住，在此过程中不要产生气泡。
II第二向SDS—PAGE①溶液配制：丙烯酰胺／甲叉双丙烯酰胺溶液(30．8％T，2．6％C)：30％(W／V)丙烯酰胺和0．8％甲叉双丙烯酰胺的水溶液。
将3009丙烯酰胺和89甲叉双丙烯酰胺溶解于去离子水中，最后用去离子水将体积补足到1000mL。
分离胶缓冲液(1．5M Tris—HCI，pH8．6和O．4％(w／v)SDS)：90．859 Tris和29 SDS溶于400mL去离子水中，用6N HCI调节pH到8．6，最后用去离子水将体积补足到500mL，加入50mg叠氮钠并过滤。
lO％{w／v)过硫酸铵溶液：ig过硫酸铵溶于10mL去离子水中。
覆盖液(缓冲液饱和的异丁醇)：混合20mL上述分离胶缓冲液和30mL异丁醇，数分钟后去掉异丁醇层。
取代液(50％(v／v)甘油和0．0 1％溴酚蓝水溶液)：混合250mL甘油(100％) 和250mL去离子水，再加入50mg溴酚蓝，搅拌数分钟。
低熔点琼脂糖溶液：含有0．5％(w／v)低熔点琼脂糖的电极缓冲液。
②灌胶：本实验选用分离范围为14—200kD、浓度为10％的SDS分离胶。
其组成为：10％T的均匀胶，2．6％C，0．I％SDS，375mM Tris—HCI，pH8．8。
配制方法是：单体贮存液33．3mL、4X分离胶缓冲液25mL和IO％SDS ImL溶解于40．2mL去离子水中，灌胶前加入TEMED 33ILL和10％过硫酸铵500DL。
按仪器说明书装好灌胶模具，倒入凝胶溶液(本实验制备Imm厚的胶，需凝胶溶液1 0mL)。
灌胶后立即在凝胶上方铺上一层用水饱和的异丁醇覆盖液，以减少凝胶暴露于氧气，形成平展的凝胶上样面。
③电泳：电泳槽中装满电泳缓冲液，打开温控系统，调节温度为12。
C；将平衡好的IPG胶条浸入电极缓冲液中数秒；将IPG胶条小心放置于SDS胶面上，轻压使二者充分结合，上面覆盖2mL热的琼脂糖溶液(75。
C)，使琼脂糖在5min内凝固；将胶盒插入电泳槽中，开始垂直的SDS胶电泳(参数设置：10mA／gelI 5min，之后20mA／gel约5h)当溴酚蓝染料迁移到胶的底部边缘即可结束电泳；跑好的胶转移到染色盒里固定，准备染色。
