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应用蛋白质芯片技术从电针胃经大鼠血清中快速筛选低分子量差异蛋白质1姚雯1，杨宗保1，严洁1*，常小荣1，易受乡1，叶能胜21.湖南中医药大学针灸推拿学院，湖南长沙（430007）2.中关村生命科学园北京市蛋白组学研究中心，北京（100080）E-mail：yj5381159@摘要：目的筛选正常大鼠血清与电针胃经大鼠血清中差异表达的低分子量蛋白质，为进一步阐明针刺效应的体液机理提供理论依据。
方法采用表面增强激光解吸离子化飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)技术和WCX2(弱阳离子交换芯片)对正常大鼠血清和电针胃经大鼠血清进行蛋白质指纹图谱检测分析，通过Biomarker Wizard 和Biomarker Patterns System软件判别分析处理数据并结合生物信息学方法筛选差异表达蛋白质。
结果与正常大鼠血清比较，电针胃经大鼠血清蛋白质在质荷比为2000-50000有25个蛋白质峰差异有显著意义，其中有19个标志蛋白在电针胃经大鼠血清中呈现高表达，6个标志蛋白在电针胃经大鼠血清中呈现低表达。
结论电针胃经大鼠血清与正常大鼠血清中低分子量蛋白质存在明显差异，这种差异蛋白质可能与电针促进胃黏膜损伤修复效应密切相关。
关键词：表面增强激光解吸离子化飞行时间质谱，电针，胃黏膜损伤，血清蛋白质组针刺疗法是祖国传统医学疗法之一，其历史可追溯到三千多年前，近年来在西方发达国家作为一种补充替代疗法而备受人们所青睐[1,2]。
胃黏膜损伤是消化系统疾病中常见的一种病理反应，针刺对其有很好的修复作用[3,4]，以往研究证实电针足三里、四白等胃经腧穴可引起胃运动及其分泌功能变化，同时血液及胃黏膜中胃泌素、P物质、胃动素、生长抑素、表皮生长因子、转化生长因子等浓度发生改变[5,6]。
然而目前对于针刺修复效应的客观物质基础仍未完全明了，SELDI技术是近年来新兴的蛋白质组学技术，具有优于二维电泳和其他质谱方法的特点，可广泛用于低丰度小分子生物标志蛋白质的筛选[7-9]。
SELDI蛋白质芯片技术传统蛋白质研究的方法如色谱分离纯化技术、二维电泳、质谱等方法因操作过程繁锁、耗时冗长、重复性差、检测样本量小等缺点而不适合对蛋白质开展大规模的筛选研究，蛋白质组学研究迫切需要一种高通量、快速、全自动化的用于对批苗蛋白质进行快速研究的仪器。
SELDI蛋白质芯片技术，又称为表面增强激光解吸离子化飞行时间质谱(surface-enhanced laser desorption/ionization-time of flight-mass spectrometry，SELDI-TOF-MS)。
自2002年日本科学家田中耕一因发明该技术而荣获诺贝尔化学奖后。
该技术发展十分迅速，目前已经广泛应用于生物技术、药学、基因学、临床诊断、生物信息等诸多领域。
其在临床实验诊断学中的主要工作原理是利用蛋白质芯片(proteinchip)和表面增强激光解吸离子化飞行时间质谱仪对体液中各种蛋白质．包括疾病早期最微小基因表达产物如低分子量蛋白质、多肽等。
进行动态、全景的分析。
获得待检标本中各种蛋白的含量及其分子量等信息，绘制成蛋白质指纹图谱。
再通过计算机软件将正常人、亚健康状态人群、良性疾病和癌症病人的指纹图谱库对照。
比较分析差异。
就能快速、敏感和特异地发现和捕获新的与疾病相关的蛋白。
目前发现通过SELDI蛋白质芯片技术所获得的生物标记物．大多是特异性肿瘤微环境所产生的低分子量的蛋白质，通过对多种肿瘤的检测表明。
其敏感性和特异性均优于传统的肿瘤标记物．对某些肿瘤的敏感性已达到100％。
特异性也超过95％。
因而该技术能在肿瘤早期诊断中具有很重要的临床应用价值。
1 SELDI-TOF-MS系统的组成1.1蛋白质芯片又称蛋白质微阵列(protein mieroarray)。
把制备好的蛋白质样品固定于经化学修饰的玻片或硅片等载体上。
蛋白质与载体表面结合。
同时仍保留蛋白质的理化性质和生物活性，可以高效地大规模获取生物体中蛋白质的信息。
应用SELDI技术建立喉癌患者血清蛋白质指纹图谱筛选模型田英;王斌;闫志勇;李娜【摘要】背景与目的:建立喉癌患者血清蛋白质指纹图谱筛选模型.材料与方法:用表面加强激光解析/电离飞行时间质谱技术(SELDI-TOF-MS)及WCX2蛋白芯片对33例喉癌患者、30例声带息肉患者血清样本进行分析,将获得的血清蛋白质指纹图谱,用计算机软件进行比较分析,并建立喉癌的筛选模型.结果:喉癌组与声带息肉对照组共有27个蛋白质具有显著性差异;以其中3个蛋白质生物标志物(质/荷比分别为2 779、4 626和5 663)组建的筛选模型检测灵敏度为93.9%,特异性为100%.结论:建立的血清蛋白质指纹图谱模型能够区分喉癌与声带息肉患者,SELDI技术在喉癌的诊断及肿瘤特异性蛋白质生物标志分子的筛选等方面是一种快速而有效的工具.【期刊名称】《癌变·畸变·突变》【年(卷),期】2007(019)005【总页数】4页(P358-361)【关键词】喉癌;表面加强激光解析/电离蛋白质芯片;生物标志分子【作者】田英;王斌;闫志勇;李娜【作者单位】青岛大学医学院附属医院耳鼻喉科,山东青岛,266003;青岛大学医学院微生物学教研室,山东,青岛,266021;青岛大学医学院微生物学教研室,山东,青岛,266021;青岛大学医学院附属医院耳鼻喉科,山东青岛,266003【正文语种】中文【中图分类】R739.65喉癌约占全身恶性肿瘤的1%～5%，为头颈部肿瘤第二位［1］。
早期诊断、治疗对喉癌的预后起关键作用，据报道喉癌患者若能在早期阶段被诊断，其5年存活率为90%。
然而，由于目前尚缺乏特异性高的早期诊断技术，且患者早期常无症状，被发现时已属中、晚期，丧失了最佳治疗时机，以致患者预后差。
近年的研究表明，肿瘤在早期阶段就在蛋白质水平上出现细微但重要的组合改变，并通过血清中的蛋白质模式反映出来，因此，通过比较不同疾病患者血清中蛋白质表达的差异，可能筛选出肿瘤相关的标志分子［2-3］。
应用 SELDI-TOF MS 技术筛选乳腺癌蛋白标志物肖代雯;杨永长;腾飞鹏;刘华;黄文芳【摘要】目的：应用表面增强激光解吸电离飞行时间质谱技术（SELDI-TOF MS）筛选乳腺癌的特异性蛋白标志物，建立诊断模型。
方法用表面增强激光解吸电离飞行时间质谱仪及CM10蛋白芯片检测35例乳腺癌患者标本及53例对照组标本（包括35例乳腺良性病变和18例正常人）的血清蛋白指纹图谱，Ciphergen Proteinchip 软件自动采集数据，Ciphergen Biomaker Wizard 软件筛选差异蛋白，Biomarker Pattern软件建立乳腺癌的分类树诊断模型。
结果乳腺癌组及对照组血清蛋白质谱图共检测到59个蛋白质峰，其中19个蛋白峰表达差异具有显著性（P＜0．01）。
以2个蛋白质峰（质荷比分别为M6636．62，M13889．6）建立的诊断模型，诊断的准确率达到94．3％，灵敏度和特异度分别为80．0％和71．7％。
结论 SELDI-TOF MS技术可用于乳腺癌特异性蛋白的筛选，为其快速诊断奠定基础。
%Objective To screen specific biomarkers and to developa diagnostic model of breast cancer by SELDI -TOF MS.Methods SELDI-TOF MS and CM10 protein chips were used to detect the serum proteomic pattern of 35 samples from breast cancer and 53 matchedcontrols ,including 35 benign lesion of breast and 18 health adults .The data was automatically collected by Ciphergen Proteinchip software and analyzed by Ciphergen Biomaker Wizard and Biomarker Patternsoftware .Re-sults About 59 protein peaks were detected by SELDI-TOF-MS between 3,000 and 30,000 m/z, among which 19 peaks were significantly different between breast cancer and controls ( P<0.01 ) .Diagnostic model was developed by two protein peaks (M/Z 6636.62 and 13889.6) withclassification accuracy of 94.3%,sensitivity and specificity of 80.0% and71.7%, re-spectively .Conclusion SELDI-TOF MS shows great potential in screening novel biomarkers , which may lay a foundation for rapid diagnosis of breast cancer .【期刊名称】《淮海医药》【年(卷),期】2014(000)002【总页数】3页(P114-115,116)【关键词】乳腺肿瘤;表面增强激光解吸电离飞行时间质谱;蛋白质组学【作者】肖代雯;杨永长;腾飞鹏;刘华;黄文芳【作者单位】四川省人民医院检验科，四川成都610072;四川省人民医院检验科，四川成都610072;四川省人民医院检验科，四川成都610072;四川省人民医院检验科，四川成都610072;四川省人民医院检验科，四川成都610072【正文语种】中文【中图分类】R737.9乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，其死亡率仅次于肺癌位于第二位[1]。
21差异蛋白SELDI蛋白质芯片筛选差异蛋白分子的二级鉴定摘要目的探讨以SELDI蛋白质芯片筛选后的细胞差异表达蛋白的分离和鉴定方法及其意义。
方法以经体外培养及10JAM褪黑素药物干预的内皮祖细胞差异表达蛋白质为研究对象，分别采用Tricine—SDS—PAGE和双向凝胶电泳方法进行差异蛋自分离及结果比较，以FTICR—MS二级质谱鉴定。
结果经Tricine—SDS —PAGE分离后，选取的分子量为53kDa左右的趋势性的差异表达蛋白进行FTICR—MS分析，质谱鉴定为微管蛋白一a3(吻合度评分为87)。
经双向凝胶电泳分离后，于凝胶近酸性端、分子量在72—95kD之间区域，选取蛋白表达量较高的一点，质谱鉴定其为人热休克蛋白90一Q(吻合度评分为91)。
结论在本文结果中，Tricine—SDS—PAGE对于大致35—70kDa范围的蛋白分离较清晰、重复性好，且样品用量少。
2-DE对最低上样量有较严格要求，但它能提供分子量、等电点双重参数来更准确定位所感兴趣蛋自点，且对较大分子量蛋白的分离效果更佳。
电喷雾傅立叶变换离子回旋共振高分辨质谱分辨率高且质量稳定性较好。
关键词：SELDI；Tricine—SDS—PAGE；双向凝胶电泳；质谱SELDI蛋白质芯片技术，即表面增强激光解吸离子化飞行时间质谱(surface—enhanced laser desorption／ionization—time of flight—massspectromet巧)，是蛋白质组学研究中的一项新兴技术，在识别特定蛋白质表达物、蛋自质差异分析、测定血清中小分子物质含量方面提供了新的思路与方法。
该技术已经逐渐应用与临床，目前已见其应用于传染病、肿瘤等疾病诊断筛选的临床报道【1,2】。
本课题组前文‘3，41研究建立了SELDI蛋白质芯片技术检测体外培养细胞蛋白质差异表达方法，发现与传统方法比较，SELDI技术对于5kDa以下的低分子量差异蛋白和低丰度的差异蛋白质的检出效果较佳，而且该技术具有高通量、上样量低和灵敏度高等优势。
用SELDI蛋白芯片技术筛选缺血性脑卒中患者血清蛋白标志物的研究韦叶生;蓝艳;黄瑞雅;蒙兰青;徐群清;解海源【摘要】目的研究缺血性脑卒中患者血清蛋白质谱的变化,从而筛选特异性的蛋白标志物.方法采用表面增强激光解吸离子化飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)技术和弱阳离子交换芯片(CM10)首先对训练组72例缺血性脑卒中患者和性别年龄匹配的80例正常对照者血清蛋白表达谱的差异进行分析,建立决策树分类模型后,对测试组(55例缺血性脑卒中患者和60例正常对照者)进行盲法验证.结果在质荷比(M/Z)2 000～56000Da范围内,共检测到94个蛋白质峰,筛选出差异蛋白质峰29个,以质荷比(M/Z)分别为5 659、5 878、7 304、7 398和9 003 Da的5个差异蛋白峰,建立的决策树分类模型对缺血性脑卒中患者诊断的敏感性为95.8%(69/72),特异性为97.5%(78/80),正确诊断率为96.7%(147/152).用该模型对测试组进行双盲检测,结果显示敏感性、特异性和正确诊断率分别为94.5%(52/55)、95.0%(57/60)和94.8%(109/115).结论应用SELDI-TOF-MS技术可以筛选出缺血性脑卒中患者相关的血清蛋白标志物,建立的决策树分类模型可能对缺血性脑卒中患者的诊断具有重要的临床价值.【期刊名称】《分子诊断与治疗杂志》【年(卷),期】2010(002)002【总页数】4页(P77-80)【关键词】缺血性脑卒中;飞行时间质谱;诊断;蛋白质组学【作者】韦叶生;蓝艳;黄瑞雅;蒙兰青;徐群清;解海源【作者单位】右江民族医学院附属医院检验科,广西,百色,533000;右江民族医学院医学检验学院,广西,百色,533000;右江民族医学院附属医院皮肤科,广西,百色,533000;右江民族医学院附属医院神经科,广西,百色,533000;右江民族医学院附属医院神经科,广西,百色,533000;右江民族医学院医学检验学院,广西,百色,533000;右江民族医学院附属医院检验科,广西,百色,533000【正文语种】中文缺血性脑卒中是一种致死和致残率很高的常见疾病，严重影响人类的健康。
ＳＥＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ技术检测正常肾细胞株与肾癌细胞株的差异表达蛋白摘要目的分析体外培养的正常肾细胞株和肾癌细胞株的蛋白质表达差异。
方法运用表面增强激光解吸离子化蛋白质芯片。
两种细胞株均用IMAC3。
震荡孵育5分钟。
g．将蛋白芯片放入蛋白工作平台，每孔加入200μl缓冲液。
剧烈震荡，室温孵育5分钟。
h．弃去缓冲液，每孔立即加入50μl：2稀释于缓冲液中的样品，置于震荡器，室温孵育5分钟。
b．重复上述操作一次。
c．每孔中加入50μl 1:2稀释于缓冲液中的样品，剧烈震荡，孵育1小时。
d．弃掉样品，每孔用200μl结合缓冲液洗涤2次，每次5分钟。
e．弃去孔中液体，每孔加入200μl水洗涤，立刻甩干。
f．从蛋白工作平台中取出蛋白芯片，空气中干燥。
g．每孔加入0.5μlSPA，重复一次。
h．干燥后用蛋白质飞行质谱仪进行质谱分析。
1．7数据采集和结果分析蛋白质芯片采用PBSⅡC型读取数据，仪器用标准多肽校正，系统的质量偏差为0.1％。
检测芯片时参数设置如下：激光强度210。
检测敏感度10，优化分子质量范围为2000～10000Da，最高分子量为50000 Da，采用Cipher-gen proteinchip 3.1版本的分析软件自动采集数据，然后用Bio-marker Wizard软件分析样本细胞的蛋白质谱差异。
两个蛋白峰比较时，差异蛋白定义为蛋白峰强度相差1倍以上。
根据差异蛋白的分子量及等电点和极小蛋白质无法鉴定的不足，进一步提高了蛋白质分离和坚定的速度。
因此，已广泛应用于肿瘤细胞体外培养的研究中。
其基本原理是根据蛋白质的荷质比的不同，利用将粗提物或样品加于芯片表面，使靶蛋白与探针分子结合，洗脱芯片表面，保留靶蛋白的芯片结合能量吸收分子(EAM)后，在真空管中用激光轰击，蛋白质在吸收能量后脱离芯片表面，由于其中加有一个正电荷，在电场中向阴极飞去，分子量大的飞行时间长，分子量小的飞行时间短，以此标记蛋白质的分子量，绘出蛋白质的图谱。
SELDI－MS，MALDI－TOF-MS和二维电泳做蛋白的对比来自论坛的整理SELDI技术最大的检测值为150KD，但是由于其飞行时间检测管较短，一般检测分子量范围是1000－20KD,其检测的最佳分子量范围是2000－10000。
有人买MS过程中，有机会与Ciphergin公司的技术部主任交流过几次，SELDI-TOF技术最大的检测值最大好象可以做到300KD，在30KD以下比较好，根据他的一次实验结果，从峰型上看比较的好的范围应该是3000-20000。
MALDI－TOF-MS理论上可以达到500KD以上，但是实际应用中能够检测的值也在300KD以下。
TOF－MS不是鉴定蛋白用的，自然只能测出分子量。
因为SELDI的TOF性能有限，因此用SELDI检测，只能得到蛋白的分子量，而无法鉴定蛋白。
即使使用芯片原位酶解，做PMF，由于分子量误差可大2，因此准确度不够。
Ciphergen的PBSII仪器说明书上标注可以测到500KD，跟据我们的经验，只要实验控制和芯片选择的好，100KD－250KD的蛋白都可以做出很漂亮的结果。
如果操作傻瓜化，500Da－60000Da是有效的检测范围。
SELDI检测大分子量蛋白效果差一些，不是飞行管长度的问题，飞行管长度可以决定分辨率，同时影响灵敏度。
实际上，飞行管越长往往越不容易做高丰富的大分子量蛋白质检测。
SELDI原理本身决定了它在有大量小分子量蛋白或者肽存在时，大分子量蛋白的检测必然要差一些MS测定蛋白分子量的一个重要目的就是鉴定蛋白质。
如果用TOF－MS做PMF，自然能鉴定蛋白，只不过与目前的MS/MS 比成功率比较低而已。
在MS/MS 问世之前，用TOF-MS鉴定蛋白是经典的方法。
军科院、复旦等处鉴定蛋白的一般流程就是：PMF(鉴定出50%)------MS/MS（PST）（鉴定出70-80%）-------sequence（de novo）（80-95%）如果在SELDI芯片上原位裂解蛋白，自然可以做PMF，一样可以鉴定蛋白。
中国生物工程杂志 Ch i n a B i o techno l o gy ,2008,28(8):118~122SELD I 蛋白质芯片检测技术*马 可 仉红刚**(北京协和医学院研究生院中国医学科学院微循环研究所 北京100005)摘要 从基因组学到蛋白质组学,到当前有关小RNA 对蛋白质合成调控的研究无一例外地说明蛋白质是直接发挥对生命活动调控的物质。
同基因研究相比较,由于蛋白质分子种类繁多,有复杂的修饰成份和空间结构,使得蛋白质研究比较困难。
新近发展起来的蛋白质芯片技术为蛋白质的检测和研究提供了新的技术平台,比如荧光标记技术,蛋白质指纹图谱-飞行时间-质谱联用技术(SELD I 蛋白质芯片),表面等离子基元共振生物传感器技术(SPR 芯片)以及初步应用的光学蛋白质芯片技术,其中,后三种是新兴的无需标记进行蛋白质检测的技术。
就SELD I 蛋白质芯片及其新近研究作一综述。
关键词 蛋白质指纹图谱-飞行时间-质谱联用技术 蛋白质芯片 疾病检测中图分类号 Q819收稿日期:2008-03-27 修回日期:2008-06-03*科技部社会公益专项(2005DIB1J086)资助项目**通讯作者,电子信箱:z hanghg1966126@yahoo 蛋白质在调节人体生命活动中扮演着重要的角色,其表达受多环节因素调控,尤其在病理条件下,细胞蛋白质的组成及其变化也与正常状态下有很大差异。
因此,有效地鉴别正常状态和病理状态时细胞表达的蛋白质变化会为疾病的诊断和预防提供依据。
如何进行疾病蛋白质组高通量的检测已成为当今研究的热点[1,2]。
蛋白质芯片的出现为满足上述研究目的提供了可能,目前,可以应用的固相蛋白质芯片主要有3种:已有市售商品的有SELD I 蛋白质芯片和SPR 芯片,以及已有临床指标检测应用报道的光学蛋白质芯片[3]。
本文对SELD I 蛋白质芯片及其最新应用综述如下。
1 SELDI 蛋白质芯片检测原理SELD I 蛋白质芯片技术,全称为表面增强激光解吸离子化飞行时间质谱(surface -enhanced l aser desor pti on /i onization -tm i e of fli ght -mass spectr o m etr y ,SELD I -TOF -M S)。
