DEAE纤维素分离猪血清蛋白

DEAE—离子交换剂纯化血清IgGDEAE-纤维素（Diethylaminoethyl-cellulose，DEAE）是在纤维素上引入二乙基氨基乙基，属于弱碱型阴离子交换剂。

吸附蛋白质的最适pH范围为7～9，pH超过9.5，DEAE 基团则不解离带电荷。

每克DEAE含0.96～1.24mmol/L可解离基团，与蛋白质的交换量可75-122mg/100mgDEAE。

应用离子交换剂来纯化物质，可以是把要纯化的物质成分交换吸附于离子交换剂上，然后再分别洗脱下来获得纯品，或者把不需要的成分吸附于离子交换剂上，需要的成分直接流出，得到纯品。

本实验采用DEAE-纤维素层析柱纯化血清IgG，利用pH6.7的缓冲液溶解样品IgG，此时IgG粗物中除IgG外，其他杂蛋白均带上不同数量的负电荷，可以和DEAE 上的阴离子发生交换吸附于柱上。

IgG因不解离带电，而不发生交换吸附，利用此特点，让溶解后的样品流过DEAE纤维素柱，即可直接收集到较纯的IgG。

（一）试剂及器材1. 0.0175mol/L， pH6.7，磷酸盐缓冲溶液2. 奈氏试剂。

3. 20%（W/V）磺基水杨酸溶液。

4. 1cm×50cm5. 黑、白比色磁盘。

（二）操作步骤1．活化根据所需层析柱的柱床体积计算所需DEAE的用量，称取所需DEAE用蒸馏水浸泡过夜，其间换几次水，每次除去细小颗粒。

抽干，改用0.5ml/L NaOH溶液浸泡1h以上，抽干（可用布氏漏斗），用无离子水漂洗，使pH至8左右（用pH试纸检查）。

再改用0.5ml/L HCl 溶液浸泡1h以上，去酸溶液，用无离子水洗至pH6左右。

然后用0.0175mol/L，pH6.7磷酸盐缓冲液，浸泡平衡后使用。

2．装柱用0.0175mol/L，pH6.7，磷酸盐缓冲溶液浸泡已处理好的DEAE-纤维素，并更换1～2次。

然后搅拌均匀，灌入层析柱中，直至纤维素柱床高约17cm左右为止。

柱床形成后，在洗脱瓶装入0.0175mol/L pH6.7磷酸盐缓冲溶液，接在层析柱上口，打开柱下端出口，使磷酸盐缓冲溶液流过纤维素，直至流出液的pH值与磷酸盐缓冲溶液的pH值完全相同（用pH 试纸不断检查）为止。

实验八血清免疫球蛋白G的分离纯化及鉴定为了初步掌握蛋白质的分离纯化技术，选择了从家畜血清中分离纯化免疫球蛋白G （Immunoglobulin G，简称IgG）的实验。

血清中的蛋白质有数十种之多，IgG是球蛋白的一种。

分离纯化蛋白质的方法是利用不同蛋白质的某些物理、化学性质（如在一定条件下带电的情况、分子量、溶解度等）的不同而建立起来的，其中有盐析、离子交换、凝胶过滤、亲和层析、制备电泳和超速离心等。

在分离纯化时，要根据情况选用几种方法互相配合才能达到分离纯化一种蛋白质的目的。

本实验采用硫酸铵盐析、DEAE-纤维素离子交换及凝胶过滤等方法，提取家畜血清中IgG。

其原理及操作如下：㈠硫酸铵盐析1.试剂饱和硫酸铵溶液pH7.0：称取（NH4）2SO4760g,加蒸馏水至1000ml，加热至5℃，使绝大部分硫酸铵溶解，置室温过夜，取上清液，用氢氧化铵调pH至7.0。

（内含0.15mol/L NaCl，简称PBS）：取0.2mol/L Na2HPO4磷酸缓冲溶液（0.01mol/L，pH7.0）溶液30.5ml，0.2mol/L NaH2PO4溶液19.4ml，加NaCl8.5g，加蒸馏水至1000ml。

磷酸缓冲溶液（0.0175mol/L，pH6.7）（不含NaCl，简称PB）：取0.2mol/L Na2HPO4溶液43.5ml，0.2mol/L NaH2PO4溶液56.6ml混合，用蒸馏水稀释至1000ml。

2.操作①取家畜血清5ml，加磷酸缓冲溶液（0.1mol/L，pH7.0）5ml，混匀，滴加（边摇边搅拌）饱和硫酸铵4ml（此时溶液硫酸铵饱和度约为20%）。

静置20min，以3000r/min 离心15min，沉淀为纤维蛋白（弃去），上清液中含清蛋白、球蛋白。

②取上清液，再加饱和硫酸铵溶液6ml（方法同前），此时溶液硫酸铵饱和度为50%，静置20min，以3000r/min 离心15min，上清液中含清蛋白，沉淀为球蛋白。

血清蛋白质的分离纯化与鉴定刘欢1张唯2赵澜2彭垠婷2 徐波2郭小李2(1．生化专业细胞生物学 51041300069 导师：张红锋;2．华东师范大学生命科学学院)摘要：通过系统的生化制备与分析实验，让学生基本掌握了包括脱盐、亲和层析、醋酸纤维薄膜电泳、SDS-PAGE、HPLC和冷冻干燥在内的生化技术。

从而为以后的科研工作打好基础。

关键词：层析；电泳；SDS-PAGEAbstract:By doing biochemichal preparing and analyzing experiment, technologies such as protein concentration detecting,enzyme activity testing, chromatography, acetate green electrophoresis, HPLC ,SDS-PAGE and other biotechnological techniques are mastered. Students are made qualified to their research work.Keywords: chromatography ; electrophoresis ; SDS-PAGE一、前言生命物质的制备和分析是现代生物化学中必不可少且又非常实用的技术。

本实验通过对兔血清蛋白的分离，让我们基本掌握常用的技术，初步了解了纯化技术的整体步骤和整个生化技术的整体流程，为我们以后自己分离纯化蛋白质产物建立了一个基本的概念，以及为以后的研究工作打下基础。

这些技术都是常用而成熟的技术，但是一个多世纪以来，尽管生物技术有了飞速发展，它们仍一直在发挥着重要的，不可替代的作用。

这些技术包括：（一）．蛋白质检测技术——电泳技术Hardy[1，2，3]发现，许多生物胶体，如蛋白质、酶等有特征的电泳迁移率（electrophoretic mobilities）。

血清清蛋白、γ-球蛋白的分离纯化与鉴定之答禄夫天创作（一）血清清蛋白、γ-球蛋白的分离与纯化【目的要求】1．了解蛋白质分离提纯的总体思路。

2．掌握盐析法、分子筛层析、离子交换层析等实验原理及操纵技术。

【实验原理】血清中含有清蛋白和各种球蛋白（α-β-γ-球蛋白等），由于它们所带电荷分歧、相对分子质量分歧，在高浓度盐溶液中的溶解度分歧，因此可利用它们在中性盐溶液中溶解度的差别而进行沉淀分离，此法称为盐析法。

本实验应用分歧浓度硫酸铵分段盐析法可将血清中清蛋白、球蛋白初步分离。

在半饱和硫酸铵溶液中，血清清蛋白不沉淀，球蛋白沉淀，离心后清蛋白主要在上清液中，沉淀的球蛋白加少量水可使其重新溶解。

用盐析法分离而得的蛋白质含有大量的硫酸铵，会妨碍蛋白质的进一步纯化，因此必须去除，经常使用的有透析法、凝胶过滤法等。

本实验采取凝胶过滤法，该法是利用蛋白质与无机盐类之间相对分子质量的差别除去粗制品中盐类。

脱盐后的蛋白质溶液再经DEAE纤维素层析柱进一步纯化。

DEAE纤维素为阴离子交换剂，在pH 6.5的条件下带有正电荷，能吸附带负电荷的α-球蛋白和β-球蛋白（pl分别为4.9、5.06和5.12），而γ-球蛋白（pl7.3）在此条件下带正电荷，不被吸附故直接从层析柱流出，此时收集的流出液即为纯化的γ-球蛋白。

提高醋酸铵溶液的浓度到0.06 mol/L，DEAE纤维素层析柱上的ß-球蛋白及部分a-球蛋白可被洗脱下来。

将醋酸铵溶液的浓度提高至，则清蛋白被洗脱下来，此时收集的流出液即为较纯的清蛋白。

经DEAE纤维素阴离于交换柱纯化的清蛋白、γ－球蛋白液往往体积较大，样品质量分数较低。

为便于鉴定，常需浓缩。

浓缩的方法很多，本实验选用聚乙二醇透析浓缩的方法。

血清清蛋白、γ-球蛋白分离纯化后，选用醋酸纤维薄膜电泳法鉴定其纯度。

【试剂与器材】1.试剂.（1）饱和硫酸铵溶液：称取固体硫酸铵850g加入1000mL蒸馏水中，在70~80℃下搅拌促熔，室温中放置过夜，瓶底析出白色结晶，上清液即为饱和硫酸铵液。

deae-52 纤维素结构DEAE-52纤维素是一种柱色谱使用的弱碱性阴离子交换纤维素，其具体结构和性质如下：1. 它是一种不溶于水、酸、碱和乙醇的物质。

2. 采用平均粒径为50µm的颗粒型亲水高分子聚合物制成，表面又用大分子糖链接枝，这使得它具有更高的比表面积和更好的生物兼容性，可以保持更高的载量，同时又具有更好的分辨率。

3. 由于其比表面积大，平衡和洗脱的时间也更短。

4. 即使是纯化病毒、质粒等超大分子的物质，其载量也基本保持不变。

DEAE-52纤维素的主要用途是用于柱色谱分析，具体应用在生化研究中。

它可以被用作分离提纯各种生物高分子的材料，如多糖、肽、核苷酸、酶、血清组分和病毒等。

此外，由于其特定的化学和物理性质，如高比表面积和良好的生物兼容性，使其在保持高载量的同时，还能提供出色的分辨率。

请注意，虽然DEAE-52纤维素在实验中具有广泛的应用，但在使用和处理过程中仍需要遵循相应的安全规范。

DEAE-52纤维素作为一种弱碱性阴离子交换纤维素，在柱色谱分析中具有广泛的应用。

其主要优点包括：1. 高分辨率和高载量：由于其表面接枝了大分子糖链，增加了比表面积和生物兼容性，使其可以保持较高的载量，并具有出色的分辨率，能够有效地分离提纯各种生物高分子。

2. 快速平衡和洗脱：由于其比表面积大，离子交换速度快，使得平衡和洗脱的时间相对较短，提高了实验效率。

3. 稳定性好：DEAE-52纤维素不溶于水、酸、碱和乙醇，具有较好的化学稳定性，能够在不同的实验条件下保持稳定的性能。

然而，DEAE-52纤维素也存在一些缺点：1. 价格较高：与其他一些常见的离子交换材料相比，DEAE-52纤维素的价格可能较高，可能会增加实验成本。

2. 需要再生处理：使用一段时间后，DEAE-52纤维素可能会失去交换能力，需要进行再生处理才能恢复其性能，这可能会增加实验操作的复杂性。

以上优缺点可能会因具体实验条件和应用场景的不同而有所变化。

For personal use only in study and research; not for commercial use生物化学实验报告姓名：学号：专业年级：组别：生物化学与分子生物学实验教学中心【实验报告第一部分（预习报告内容）：①实验原理、②实验材料（包括实验样品、主要试剂、主要仪器与器材）、③实验步骤（包括实验流程、操作步骤和注意事项）；评分（满分30分）：XX】实验目的：1、掌握盐析法分离蛋白质的原理和基本方法2、掌握凝胶层析法分离蛋白质的原理和基本方法3、掌握离子交换层析法分离蛋白质的原理和基本方法4、掌握醋酸纤维素薄膜电泳法的原理和基本方法5、了解柱层析技术实验原理：1、蛋白质的分离和纯化是研究蛋白质化学及其生物学功能的重要手段。

2、不同蛋白质的分子量、溶解度及等电点等都有所不同。

利用这些性质的差别，可分离纯化各种蛋白质。

3、盐析法：盐析法是在蛋白质溶液中，加入无机盐至一定浓度或达饱和状态，可使蛋白质在水中溶解度降低，从而分离出来。

蛋白质溶液中加入中性盐后，由于中性盐与水分子的亲和力大于蛋白质，致使蛋白质分子周围的水化膜减弱乃至消失。

中性盐加入蛋白质溶液后由于离子强度发生改变，蛋白质表面的电荷大量被中和，更加导致蛋白质溶解度降低，蛋白质分子之间聚集而沉淀。

4、离子交换层析:离子交换层析是指流动相中的离子和固定相上的离子进行可逆的交换，利用化合物的电荷性质及电荷量不同进行分离。

5、醋酸纤维素薄膜电泳原理：血清中各种蛋白质的等电点不同，一般都低于pH7.4。

它们在pH8.6的缓冲液中均解离带负电荷，在电场中向正极移动。

由于血清中各种蛋白质分子大小、形状及所带的电荷量不同，因而在醋酸纤维素薄膜上电泳的速度也不同。

因此可以将它们分离为清蛋白（Albumin)、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白5条区带。

实验材料：人混合血清葡聚糖凝胶（G-25)层析柱DEAE纤维离子交换层析柱饱和硫酸铵溶液醋酸铵缓冲溶液 20%磺基水杨酸1%BaCl溶液氨基黑染色液2漂洗液 pH8.6巴比妥缓冲溶液电泳仪、电泳槽实验流程：盐析（粗分离）→葡聚糖凝胶层析（脱盐）→DEAE纤维素离子交换层析（纯化）→醋酸纤维素薄膜电泳（纯度鉴定）实验步骤：（一）盐析+凝胶柱层析除盐：（二）离子交换层析（纯化）：（三）醋酸纤维素薄膜电泳：1、点样（如下图）：-点样线尽量点得细窄而均匀,宁少勿多2、电泳：①薄膜粗面向下②点样端置阴极端③两端紧贴在滤纸盐桥上，膜应轻轻拉平电压：110V时间：50min3、染色和漂洗：电泳完毕后，关闭电源，将膜取出，直接浸于染色液中5min。

DEAE纤维素分离猪血清蛋白
罗磊;樊金铃;丁霄霖
【期刊名称】《食品与生物技术学报》
【年(卷),期】2008(027)004
【摘要】对DEAE纤维素52(简称DE52)分离猪血清蛋白进行了研究.结果表明:pH 7.4时,以0～0.3 mol/L的NaCl磷酸盐缓冲液梯度洗脱,DE52可以将血清蛋白分为7个部分.在梯度洗脱的基础上,分别以NaCl浓度0、0.05、0.08、0.1、0.12、0.15、0.2 mol/L的磷酸盐缓冲液进行阶段洗脱,将血清蛋白分为8个部分.【总页数】4页(P75-78)
【作者】罗磊;樊金铃;丁霄霖
【作者单位】河南科技大学食品与生物工程学院,河南洛阳471003;河南科技大学食品与生物工程学院,河南洛阳471003;江南大学食品学院,江苏无锡214122【正文语种】中文
【中图分类】Q503;Q592.1
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4.用Percoll试剂和DEAE-纤维素层析柱分离纯化鳝锥虫 [J], 顾泽茂;汪建国;章晋
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5.双峰驼精清诱导排卵活性成分的DEAE-纤维素柱层析分离及其生物活性 [J], 赵兴绪;李喜龙
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一、实验目的1、掌握盐析法、凝胶层析法、离子交换层析法分离蛋白质的原理和基本方法。

2、掌握醋酸纤维素薄膜电泳法的原理和基本方法。

3、了解柱层析技术。

二、实验原理1、粗提（盐析法）：蛋白质分子能稳定存在于水溶液中是因为有两个稳定因素：表面的电荷和水化膜。

当维持蛋白质的稳定因素破坏时，蛋白质分子可相互聚集沉淀而析出。

盐在水溶液中电离所形成的正负离子可吸引水分子，从而夺取蛋白质分子上的水化膜，还可中和部分电荷使蛋白质分子聚集而沉淀，从而达到盐析沉淀蛋白质的目的。

由于血清中各种蛋白质颗粒大小、所带电荷多少及亲水程度不同，因此，利用不同浓度的硫酸铵溶液分段盐析，便可将血清中清蛋白和球蛋白从溶液中沉淀出来，达到初步分离清蛋白、球蛋白的目的。

2、脱盐（凝胶层析法）凝胶层析法利用蛋白质与无机盐类之间分子量的差异。

当溶液通过凝胶柱时，溶液中分子量较大的蛋白质因为不能通过网孔进入凝胶颗粒，沿着凝胶颗粒间的间隙流动，所以流程较短，向前移动速度较快，最先流出层析柱。

而盐的分子量较小，可通过网孔进入凝胶颗粒，所以流程长，向前移动速度较慢，较晚流出层析柱。

从而可达到去盐的目的。

3、纯化（离子交换层析法）离子交换是溶液中的离子和交换剂上的离子进行可逆的的交换过程。

带正电荷的交换剂称为阴离子交换剂；带负电荷的交换剂称为阳离子交换剂。

本实验采用的DEAE纤维素是一种阴离子交换剂，溶液中带负电荷的离子可与其进行交换结合，带正电荷的离子则不能，这样便可达到分离纯化的目的。

脱盐后的蛋白质溶液尚含有各种球蛋白，利用它们的等电点的不同可进行分离。