【CN109810185A】一种重组人血清白蛋白的分离纯化方法【专利】

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910164725.7(22)申请日 2019.03.05(71)申请人 上海医药工业研究院地址 200040 上海市静安区北京西路1320号申请人 中国医药工业研究总院(72)发明人 谢丽萍　胡又佳　朱文　吴珺艺　阮江雄　韩姝　徐磊　(74)专利代理机构 上海弼兴律师事务所 31283代理人 薛琦　王卫彬(51)Int.Cl.C12P 21/02(2006.01)C12N 15/81(2006.01)C07K 14/765(2006.01)C07K 1/22(2006.01)C12R 1/84(2006.01) (54)发明名称一种人血清白蛋白的制备方法及其纯化方法(57)摘要本发明提供了一种人血清白蛋白的制备方法，其包括将产人血清白蛋白的巴斯德毕赤酵母菌接种于培养基中发酵，从发酵液中获得人血清白蛋白即可；所述培养基为除了甘油和毕赤酵母微量元素1两种组分外，其余组分浓度均至多降低为1/4的BSM培养基，优选降低为1/4～1/2的BSM培养基。

本发明还提供了一种人血清白蛋白的纯化方法。

利用本发明的制备方法制得的人血清白蛋白的产量及其占总蛋白的比例均显著高于现有技术，且该制备方法中所使用的培养基成本显著降低，且无动物源性病毒污染的风险，从而显著降低制备方法的成本。

利用本发明所述的纯化方法纯化的回收率显著提升，并且最终产品的纯度也显著进一步提升。

权利要求书2页 说明书11页序列表2页 附图11页CN 111662944 A 2020.09.15C N 111662944A1.一种人血清白蛋白的制备方法，其特征在于，其包括将产人血清白蛋白的巴斯德毕赤酵母菌(Pichia pastoris)接种于培养基中发酵，从发酵液中获得人血清白蛋白即可；其中，所述培养基为除了甘油和毕赤酵母微量元素1两种组分外，其余组分浓度均至多降低为1/4的BSM培养基，优选降低为1/4～1/2的BSM培养基。

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202011544901.9(22)申请日 2020.12.24(71)申请人 河北医科大学第二医院地址 050000 河北省石家庄市和平西路215号(72)发明人 安雯婷　郭丽娜　(74)专利代理机构 石家庄知住优创知识产权代理事务所(普通合伙) 13131代理人 王丽巧(51)Int.Cl.C07K 14/765(2006.01)C07K 1/14(2006.01)C07K 1/16(2006.01)(54)发明名称一种重组人血清白蛋白的分离纯化方法(57)摘要本发明公开了一种重组人血清白蛋白的分离纯化方法，包括分离方法和纯化方法，分离的具体步骤如下：第一步：将人血清白蛋白溶液和盐按照比例进行混合，使白蛋白从溶液中分离出来，所述人血清白蛋白溶液和盐的比例为40‑50:1，初步得到粗提取液；第二步：将得到的粗提取液进行沉淀，使白蛋白上浮、球蛋白沉淀，得到白蛋白样品以及球蛋白样品；第三步：将得到的白蛋白、球蛋白样品溶液提取至容器中，用醋酸铵缓冲液对样品进行洗涤，洗涤次数为2‑4次。

本发明中提出的一种重组人血清白蛋白的纯化方法，提纯后的人血清白蛋白质量较高，可以满足使用者的使用需求。

权利要求书1页 说明书4页CN 112480240 A 2021.03.12C N 112480240A1.一种重组人血清白蛋白的分离纯化方法，包括分离方法和纯化方法，其特征在于，分离的具体步骤如下：第一步：将血清白蛋白溶液和盐按照比例进行混合，使白蛋白从溶液中分离出来，所述人血清白蛋白溶液和盐的比例为40‑50:1，初步得到粗提取液；第二步：将得到的粗提取液进行沉淀，使白蛋白上浮、球蛋白沉淀，得到白蛋白样品以及球蛋白样品；第三步：将得到的白蛋白、球蛋白样品溶液提取至容器中，用醋酸铵缓冲液对样品进行洗涤，洗涤次数为2‑4次；第四步：将洗涤后的样品血浆冷冻至‑10到‑20度之间，再将样品进行解冻，解冻后使用离心法，得到蛋白质液体，并收集；第五步：将收集后的蛋白质液体进行凝胶层析，用醋酸铵缓冲液进行洗流，再检查流出液，检查合格后即可再生平衡；纯化的具体步骤如下：第一步：将脱盐后的蛋白样品进行上柱，用醋酸铵缓冲液进行洗涤，使样品流出25‑35ML后，再将液面与床面齐平；第二步：再用醋酸铵缓冲液进行洗脱，检查流出液是否合格；第三步：将流出的蛋白进行收集，收集3管，每管15滴，得到纯化后的人血清白蛋白样品。

专利名称：一种人血白蛋白的分离方法
专利类型：发明专利
发明人：张翔,陈治海,周柏林,岳跃飞,单永红,张秋声申请号：CN200710035210.4
申请日：20070626
公开号：CN101333245A
公开日：
20081231
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明涉及一种生物制品技术中蛋白质的分离、提纯工艺方法，特别是一种人血白蛋白的分离方法，它包括有蛋白质的分离、提纯工艺，其特征在于：用人血浆为原料，首先将组分I、组分II+III分别沉淀，然后将组分I+II+III一并分离，最后将组分IV－1、IV－4分别沉淀，一并分离，固液分离采用压滤技术，其进液压力不超过0.2MPa。

本发明方法由于在分离过程中采用压滤法过滤，同时调控白蛋白分离的乙醇浓度、温度、pH值等参数，克服了现有低温乙醇分离法生产人血白蛋白技术中存在的蛋白成分收率偏低，白蛋白组份中的不稳定物质(如脂蛋白)去除不彻底等不足，与传统的低温乙醇法相比，具有白蛋白收率高(不低于2.9g/100ml)，产品质量好等优点。

申请人：湖南紫光古汉南岳制药有限公司
地址：421002 湖南省衡阳市珠晖区东风南路340号
国籍：CN
代理机构：衡阳市科航专利事务所
代理人：刘勋阶
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[19]中华人民共和国国家知识产权局[12]发明专利申请公开说明书[11]公开号CN 1239103A[43]公开日1999年12月22日[21]申请号98102506.4[21]申请号98102506.4[22]申请日98.6.17[71]申请人上海海济生物工程有限公司地址200031上海市肇嘉浜路288号鼎新大楼20楼[72]发明人李绍极 陆德如[51]Int.CI 6C07K 14/765C12N 15/14C12N 15/65C12N 1/19//C1 2N1/19,C12R1:84权利要求书 2 页 说明书 27 页 附图 14 页[54]发明名称重组人血清白蛋白的生产方法[57]摘要本发明涉及以重组DNA技术生产人血清白蛋白的方法，特别是涉及合成的由酵母偏性密码子组成的并经过适当修饰的人血清白蛋白基因，携带所说的基因的重组表达载体和用所说的载体转化的酵母宿主细胞，以及由所说的酵母宿主，特别是甲基营养型酵母宿主以可分泌形式生产人血清白蛋白的方法。

98102506.4权 利 要 求 书第1/2页1．基本上由酵母偏性密码组成的，并经过适当修饰的合成的编码人血清白蛋白的核苷酸序列及其功能等同物。

2．根据权利要求1的核苷酸序列，其中对所说的修饰包括对编码人血清白蛋白的核苷酸序列的内含子剪接位点、非转录终止区的转录终止序列、长的重复序列、内部启动子序列及核糖体结合位点的修饰。

3．根据权利要求1的核苷酸序列，其中所说的编码人血清白蛋白的核苷酸序列是分别合成三组各8个核苷酸链，然后再以基于聚合酶链反应的合成技术拼接成三个核苷酸片段，再经克隆和纠正个别碱基错误后彼此串联而得到的。

4．根据权利要求1的核苷酸序列，其中对所说的人血清白蛋白编码序列具有如图SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

5．包含根据权利要求1至4中任何一项的编码人血清白蛋白的核苷酸序列的重组表达载体。

6．根据权利要求5的重组表达载体，其中包括一个或多个由(1)甲基营养酵母之甲醇反应性基因的启动子区域，(2)编码啤酒酵母α交配因子(A M F)前原序列和编码H S A的核苷酸序列，(3)在甲基营养型酵母中有功能活性的转录终止子的，以及(4)至少一个可选择标志基因和细菌复制原点组成的表达盒。

(10)申请公布号 CN 102190722 A(43)申请公布日 2011.09.21C N 102190722 A*CN102190722A*(21)申请号 201010124935.2(22)申请日 2010.03.16C07K 14/765(2006.01)C07K 1/22(2006.01)C07K 1/20(2006.01)C07K 1/18(2006.01)C07K 1/16(2006.01)(71)申请人上海安睿特生物医药科技有限公司地址201203 上海市张江高科技园区牛顿路200号8号楼2层A 座-03座(72)发明人项炜 朱威 陈忠(74)专利代理机构上海专利商标事务所有限公司 31100代理人陈静(54)发明名称一种纯化重组人血白蛋白的方法(57)摘要本发明涉及一种纯化重组人血白蛋白(rHSA)的方法。

该方法包括将发酵液不经处理，直接用扩张床阴离子柱一步层析达到固液分离、浓缩和初步纯化的三个层析纯化作用。

再经过加热、疏水层析、阳离子交换、超滤、螯合、沉淀等步骤获得超高纯度的重组人血白蛋白。

(51)Int.Cl.(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书 1 页 说明书 8 页 附图 2 页1.一种纯化重组人血清白蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括：(a)将含有重组人血清白蛋白的发酵液上样到含有吸附剂的流化床，使得吸附剂选择性吸附所述重组人血清白蛋白；其中，所述的吸附剂是阴离子交换树脂；以及(b)回收被吸附的重组人血清白蛋白。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，上样前，将所述的含有吸附剂的流化床调节pH7.0-8.0；或上样后，将吸附了所述重组人血清白蛋白的含有吸附剂的流化床调节pH7.0-8.0。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的阴离子交换树脂是Streamline阴离子交换树脂。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的Streamline阴离子交换树脂选自：Streamline Q，Streamline Q XL，或Streamline DEAE。

[19]中华人民共和国国家知识产权局[12]发明专利申请公开说明书[11]公开号CN 1525977A [43]公开日2004年9月1日[21]申请号02813703.5[22]申请日2002.06.13[21]申请号02813703.5[30]优先权[32]2001.06.13 [33]US [31]60/297,884[86]国际申请PCT/US2002/018965 2002.06.13[87]国际公布WO2002/101021 EN 2002.12.19[85]进入国家阶段日期2004.01.07[71]申请人陶洛斯HSA有限责任公司地址美国马萨诸塞[72]发明人S·富尔顿[74]专利代理机构中国国际贸易促进委员会专利商标事务所代理人唐伟杰[51]Int.CI 7C07K 1/00C12P 21/00A01K 67/027C12N 5/00C12N 15/63权利要求书 2 页 说明书 15 页 附图 1 页[54]发明名称人血清白蛋白的纯化[57]摘要本发明涉及从生产人血清白蛋白(hSA)的宿主细胞的内源血清白蛋白中纯化hSA的方法。

该方法包括提供含hSA及宿主细胞的血清白蛋白的样品，将样品上样到亲和柱上，该柱结合hSA的亲和力大于其结合宿主细胞血清白蛋白的亲和力，从亲和柱上洗脱结合的hSA，并将洗脱的hSA结晶，本发明还涉及包含由本发明的方法生产的hSA的组合物。

02813703.5权 利 要 求 书第1/2页 1.一种从含有人血清白蛋白(hSA)和宿主细胞血清白蛋白的样品中纯化hSA的方法，包括：从宿主细胞获得含有h S A和宿主细胞血清白蛋白的样品； 上样至亲和柱，该亲和柱结合hSA的亲和力高于与宿主细胞的血清白蛋白的结合亲和力；从亲和柱上洗脱结合的hSA；和将洗脱下的hSA结晶。

2.权利要求1中所述方法，其中样品从转基因非人类动物中获得。

3.权利要求2中所述方法，其中动物选自牛、绵羊、山羊、猪、小鼠和兔。

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201780061276.2(22)申请日 2017.10.03(30)优先权数据2016-195644 2016.10.03 JP(85)PCT国际申请进入国家阶段日2019.04.02(86)PCT国际申请的申请数据PCT/JP2017/035983 2017.10.03(87)PCT国际申请的公布数据WO2018/066558 JA 2018.04.12(71)申请人 丝芭博株式会社地址 日本山形县(72)发明人 本间俊将　(74)专利代理机构 中原信达知识产权代理有限责任公司 11219代理人 盛曼　金龙河(51)Int.Cl.C07K 1/14(2006.01)C07K 1/30(2006.01)C07K 1/36(2006.01)C07K 14/435(2006.01)C12P 21/02(2006.01)D01F 6/68(2006.01)(54)发明名称重组蛋白的纯化方法(57)摘要本发明公开了一种重组蛋白的纯化方法，其为从以不溶体的形式在细胞内表达目标重组蛋白的重组细胞中纯化所述重组蛋白的方法，其特征在于，在添加或未添加无机盐的第一非质子性极性溶剂中在来源于宿主细胞的蛋白质溶解、但所述重组蛋白不溶解的条件下对所述重组细胞进行处理，除去第一可溶性级分后，将所得到的第一不溶性级分在添加无机盐的第二非质子性极性溶剂中在所述重组蛋白溶解的条件下进行处理。

权利要求书2页 说明书27页序列表12页 附图12页CN 109843905 A 2019.06.04C N 109843905A1.一种重组蛋白的纯化方法，其为从以不溶体的形式在细胞内表达目标重组蛋白的重组细胞中纯化所述重组蛋白的方法，其特征在于，在添加或未添加无机盐的第一非质子性极性溶剂中在来源于宿主细胞的蛋白质溶解、但所述重组蛋白不溶解的条件下对所述重组细胞进行处理，除去第一可溶性级分后，将所得到的第一不溶性级分在添加无机盐的第二非质子性极性溶剂中在所述重组蛋白溶解的条件下进行处理。