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人血清白蛋白的提取纯化和分子量测定

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一种人血清白蛋白的制备方法及其纯化方法[发明专利]

一种人血清白蛋白的制备方法及其纯化方法[发明专利]

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910164725.7(22)申请日 2019.03.05(71)申请人 上海医药工业研究院地址 200040 上海市静安区北京西路1320号申请人 中国医药工业研究总院(72)发明人 谢丽萍　胡又佳　朱文　吴珺艺　阮江雄　韩姝　徐磊　(74)专利代理机构 上海弼兴律师事务所 31283代理人 薛琦　王卫彬(51)Int.Cl.C12P 21/02(2006.01)C12N 15/81(2006.01)C07K 14/765(2006.01)C07K 1/22(2006.01)C12R 1/84(2006.01) (54)发明名称一种人血清白蛋白的制备方法及其纯化方法(57)摘要本发明提供了一种人血清白蛋白的制备方法，其包括将产人血清白蛋白的巴斯德毕赤酵母菌接种于培养基中发酵，从发酵液中获得人血清白蛋白即可；所述培养基为除了甘油和毕赤酵母微量元素1两种组分外，其余组分浓度均至多降低为1/4的BSM培养基，优选降低为1/4～1/2的BSM培养基。

本发明还提供了一种人血清白蛋白的纯化方法。

利用本发明的制备方法制得的人血清白蛋白的产量及其占总蛋白的比例均显著高于现有技术，且该制备方法中所使用的培养基成本显著降低，且无动物源性病毒污染的风险，从而显著降低制备方法的成本。

利用本发明所述的纯化方法纯化的回收率显著提升，并且最终产品的纯度也显著进一步提升。

权利要求书2页 说明书11页序列表2页 附图11页CN 111662944 A 2020.09.15C N 111662944A1.一种人血清白蛋白的制备方法，其特征在于，其包括将产人血清白蛋白的巴斯德毕赤酵母菌(Pichia pastoris)接种于培养基中发酵，从发酵液中获得人血清白蛋白即可；其中，所述培养基为除了甘油和毕赤酵母微量元素1两种组分外，其余组分浓度均至多降低为1/4的BSM培养基，优选降低为1/4～1/2的BSM培养基。

血清蛋白、-球蛋白的分离纯化与鉴定

血清蛋白、-球蛋白的分离纯化与鉴定

血清清蛋白.γ-球蛋白的分别纯化与判定（一）血清清蛋白.γ-球蛋白的分别与纯化【目标请求】1．懂得蛋白质分别提纯的总体思绪.2．控制盐析法.分子筛层析.离子交流层析等试验道理及操纵技巧.【试验道理】血清中含有清蛋白和各类球蛋白（α-β-γ-球蛋白等）,因为它们所带电荷不合.相对分子质量不合,在高浓度盐溶液中的消融度不合,是以可运用它们在中性盐溶液中消融度的差别而进行沉淀分别,此法称为盐析法.本试验运用不合浓度硫酸铵分段盐析法可将血清中清蛋白.球蛋白初步分别.在半饱和硫酸铵溶液中,血清清蛋白不沉淀,球蛋白沉淀,离心后清蛋白重要在上清液中,沉淀的球蛋白加少量水可使其从新消融.用盐析法分别而得的蛋白质含有大量的硫酸铵,会妨害蛋白质的进一步纯化,是以必须去除,经常运用的有透析法.凝胶过滤法等.本试验采取凝胶过滤法,该法是运用蛋白质与无机盐类之间相对分子质量的差别除去粗成品中盐类.脱盐后的蛋白质溶液再经DEAE纤维素层析柱进一步纯化.DEAE纤维素为阴离子交流剂,在pH 6.5的前提下带有正电荷,能吸附带负电荷的α-球蛋白和β-球蛋白（pl分别为4.9.5.06和5.12）,而γ-球蛋白（pl7.3）在此前提下带正电荷,不被吸附故直接从层析柱流出,此时收集的流出液即为纯化的γ-球蛋白.进步醋酸铵溶液的浓度到0.06 mol/L,DEAE纤维素层析柱上的ß-球蛋白及部分a-球蛋白可被洗脱下来.将醋酸铵溶液的浓度进步至,则清蛋白被洗脱下来,此时收集的流出液即为较纯的清蛋白.经DEAE纤维素阴离于交流柱纯化的清蛋白.γ－球蛋白液往往体积较大,样品德量分数较低.为便于判定,常需浓缩.浓缩的办法许多,本试验选用聚乙二醇透析浓缩的办法.血清清蛋白.γ-球蛋白分别纯化后,选用醋酸纤维薄膜电泳法判定其纯度.【试剂与器材】1.试剂.（1）饱和硫酸铵溶液：称取固体硫酸铵850g参加1000mL蒸馏水中,在70~80℃下搅拌促熔,室温中放置留宿,瓶底析出白色结晶,上清液即为饱和硫酸铵液.（2）醋酸铵缓冲液：称取醋酸铵23.12g,加蒸馏水800mL,用稀氨水或稀醋酸调pH至,定容至1000mL.(不得加热)（3）醋酸铵缓冲液：取上液用蒸馏水稀释5倍.（4）醋酸铵缓冲液：取上液用蒸馏水稀释3倍.（上述3种缓冲液要确保浓度和pH的精确性,稀释后要重调pH）（5）300g/L三氯乙酸（6）纳氏试剂（7）葡聚糖凝胶G-25（8）DEAE纤维素（9）新颖血清（10）聚乙二醇（11）双缩脲试剂2.器材离心计心情刻度离心管pH试纸抽滤瓶黑.白反响板透析袋铁架台×20cm）移液枪布氏漏斗造就皿【操纵办法】1. 硫酸铵盐析（1）取刻度离心管1支,参加mL新颖血清,边摇边迟缓滴入饱和硫酸铵液mL.混匀后室温下放置10min,4000r/min离心10min.用滴管当心吸出上清液置于试管中,即为粗清蛋白液.（2）离心管底部的沉淀参加0.8mL蒸馏水,振荡消融,即为粗球蛋白液.2.凝胶柱层析脱盐（1）凝胶的处理：量取30mLSephade G-25醋酸铵缓冲液,置于滚水浴中1h,并经常动摇负气泡逸出.掏出冷却,待凝胶下沉后,倾去含有细微悬浮物的上层液.×醋酸铵缓冲液,将上述处理过的凝胶粒悬液持续注入层析柱内,直至所需凝胶床高度距层析柱上口约3~4cm为止.装柱时应留意凝胶粒装填平均,凝胶床内不得有界面和蔼泡,凝胶床面应平整.打开下口夹,调节柱下端螺旋夹流速2mL/min,用2倍柱床体积的醋酸铵缓冲液均衡.封闭下口夹.（3）上样与洗脱：打开下口夹,使床面上的缓冲液流出,待液面降到凝胶床概况时,封闭出水口.用滴管汲取盐析所得清蛋白溶液,在距离床面1mm处沿管内壁轻轻迁移转变加进样品,切勿搅动床面.然后打开下口夹,使样品进入床内,直到与床面平齐为止.立刻醋酸铵缓冲液冲洗柱内壁,待缓冲液进入凝胶床后再加少量缓冲液.如斯反复2次,以洗净内壁上的样品溶液.然后再参加适量缓冲液于凝胶床上,调流速10滴/min,开端洗脱.用小试管收集流出的液体,每管收集20滴,收集10管后封闭出水口.（4）检测蛋白质与NH4+：取诟谇反响板各一块,按洗脱液的次序每管取1滴,分别滴入反响板中,在黑色反响板中加300g/L三氯乙酸溶液（或用双缩脲试剂检测）2滴,消失白色混浊或沉淀即示有蛋白质析出,并记载各管白色混浊程度.于白色反响板中加人奈氏试剂溶液l滴,不雅察NH4消失的情形.归并含有蛋白质的各管,即为已脱盐的清蛋白溶液,γ-球蛋白的收集同清蛋白的操纵.3.离子交流层析柱纯化（1）DEAE纤维素处理：量取 DEAE-纤维素20mL,加0.5mol/L HCl 溶液50mL,搅拌后放置20min,虹吸去除上清液(也可用布氏漏斗抽干),再用蒸馏水反复洗数次直至pH 4.0 为止.加等体积 0.5 mol/LNaOH 溶液,搅拌后放置20min,虹吸去除上清液,同上用蒸馏水反复洗至pH<7为止.醋酸铵缓冲液40mL 放置30min.待装柱.×醋酸铵缓冲液均衡.调流速20滴/min,将脱盐后的γ-球蛋白溶液上柱,办法与上述脱盐法雷同.同样用300g/L三氯乙酸溶液或双缩脲试剂检讨有无蛋白质流出.收集不被纤维素吸附的蛋白质即为纯化的γ-球蛋白溶液.DEAE纤维素层析柱不必再生,可直接用于血清蛋白.（3）清蛋白的纯化：将脱盐后的清蛋白溶液上柱后,用醋酸铵缓冲液洗脱,流出约6mL后.将柱上的缓冲液液面降至与纤维素床概况平齐.再改用醋酸铵缓冲液洗脱,并用300g/L三氯乙酸溶液或双缩脲试剂检讨流出液是否含有蛋白质.流出液中有蛋白质时,立刻收集,即为纯化的清蛋白液,留作纯度判定用.4.蛋白溶液浓缩将待浓缩的蛋白质溶液放入较细的透析袋中,置入造就皿内.透析袋四周撒上聚乙二醇.经由一准时光后即可不雅察到显著的浓缩现象.该浓缩样品留作纯度判定.以上物资在运用后可以经由过程加温及吹风而收受接管.【要点提醒】1.装柱时,不克不及有气泡和分层现象,凝胶悬液尽量一次加完.2.加样时,切莫将床面冲起,亦不要沿柱壁参加.不克不及搅动床面,不然分别带不整洁.3.流速不成太快,不然分子小的物资来不及集中,随分子大的物资一路被洗脱下来,达不到分别目标.4.在全部洗脱进程中,始终应保持层析柱床面上有一段蒸馏水,不得使凝胶干结.（二）血清清蛋白.γ-球蛋白的判定——醋酸纤维素薄膜电泳【试验目标】1.控制电泳的基起源基础理;2.熟习醋酸纤维素薄膜电泳的办法和运用.【试验道理】蛋白质是两性电解质,在统一pH情形下,混杂蛋白质中各类成分带电量不合.分子大小不合,在统一电场中泳动的速度不合,导致雷同的时光迁徙的距离不合而把它们离开.血清中含有多种蛋白质,用醋酸纤维素薄膜电泳可分为五个区带,γ-球蛋白的等电点为7.3,在pH8.6的巴比妥缓冲液中,带的负电荷起码,是以在电场中比其它蛋白质移动速度慢.而清蛋白等其它蛋白质的等电点均小于7.3（pl分别为4.9.5.06和5.12）,是以在电场中比γ-球蛋白移动速度快.本试验分别全血清中各类蛋白质成分,同时判定前次试验清蛋白.γ-球蛋白的提纯成果.【试剂与器材】1.试剂（1）巴比妥缓冲液（pH8.6,离子强度0.06）：称取巴比妥纳12.76g,巴比妥1.66g,蒸馏水消融并定容至1000mL.（2）染色液：氨基黑10B 0.25g,用甲醇50mL.冰醋酸10mL.水40mL消融.（3）漂洗液：甲醇或乙醇45mL,冰醋酸5mL,水50mL,混匀.2.器材电泳仪电泳槽醋酸纤维薄膜造就皿滤纸点样器吸量管竹镊子吹风机【操纵办法】1.取醋酸纤维薄膜3张,在薄膜的无光泽面的1.5cm处用铅笔轻轻整洁条线.2.将薄膜浸入pH8.6的巴比妥-巴比妥钠缓冲液中,浸泡约30min(膜上没有白色斑痕).3.将完整浸透的薄膜轻轻掏出,平铺在滤纸上,用滤纸吸去过剩的缓冲液.分别用点样器蘸取正常血清.清蛋白和γ-球蛋白溶液点在点样线上(光滑面).4.薄膜的无光泽面向下,两头紧贴在电泳槽支架上的滤纸条上（点样端在阴极）.薄膜应位正,平直无曲折,加上槽盖均衡5分钟后通电电泳,调电流0.5mA/cm膜宽（几条薄膜就是通几毫安的电流,是按横向盘算的）,通电时光约40~60min.5.电泳停止后,封闭电源,将薄膜浸于氨基黑10B染色液中染色5min,掏出后用漂洗液漂洗4~5次,每次约5min,待布景无色为止.【成果处理】依据脱色后薄膜上消失的黑点,对清蛋白.γ-球蛋白与正常血清比较,剖析样品的纯度.【思虑题】假如电泳成果证实γ球蛋白的分别后果不睬想,应从哪些方面剖析？。

实验教学内容：血清蛋白质的分离与纯化

实验教学内容：血清蛋白质的分离与纯化

实验教学内容：血清蛋白质的分离与纯化实验教学时间：(本实验需12学时，分3次实验完成)教学对象：临床医学、护理学、影像各专业实验目的：1、分离血清得到高纯度的白蛋白2、掌握蛋白质盐析原理与实验操作技术、葡聚糖凝胶G-25脱盐原理与实验操作技术、DEAE-纤维素离子交换原理与实验操作技术、考马斯亮蓝G250染色法定量检测蛋白质的原理和操作方法、SDS-PAGE电泳的原理和操作技术3、掌握紫外检测仪、自动部分收集器、记录仪、恒压高位槽的原理与使用方法教学重点：1、熟悉蛋白质分离纯化的思路和一般方法；2、掌握蛋白质盐析原理、葡聚糖凝胶G-25脱盐原理、DEAE-纤维素离子原理、考马斯亮蓝G250染色法定量检测蛋白质的原理和SDS-PAGE电泳的原理；3、掌握凝胶层析、离子交换层析法、考马斯亮蓝G250染色法和SDS-PAGE电泳的实验操作技术4、掌握紫外检测仪、自动部分收集器、记录仪、恒压高位槽的原理与使用方法教学难点：1、DEAE-纤维素离子原理；2、SDS-PAGE电泳的原理；3、凝胶层析、离子交换层析法和SDS-PAGE电泳的实验操作技术；4、紫外检测仪、自动部分收集器、记录仪的使用方法教学方法：幻灯片结合黑板板书，并有教师演示操作教学内容及时间分配：第一次实验（4小时）：1、讲解实验目的、思路和安排（10分）2、盐析的原理（5分）3、脱盐的原理和方法比较（10分）4、盐析和凝胶层析的操作步骤（10分）5、紫外检测仪、自动部分收集器、记录仪、恒压高位槽的原理与使用（30分）6、学生开始调试仪器、测定流速、设置实验条件（10分）7、学生进行盐析（15分）8、教师演示上样操作（5分）9、学生脱盐处理、收集样品并保存（2小时）10、学生平衡层析柱，处理图形并记录（20分）第二次实验（4小时）：1、分析上次实验结果和总结经验（10分）2、讲解离子交换的原理（15分）3、离子交换的操作步骤（10分）4、复习紫外检测仪、自动部分收集器、记录仪、恒压高位槽的使用（5分）5、学生开始调试仪器、测定流速、设置实验条件（10分）6、学生把上次样品进行处理、收集样品并保存（3小时）7、学生再次平衡离子交换柱，处理图形并记录（20分）第三次实验（4小时）：1、分析上次实验结果和总结经验（5分）2、讲解蛋白质定量方法的原理和各个方法的比较（10分）3、考马斯亮蓝G250染色法的操作步骤（5分）4、讲解SDS-PAGE电泳的原理和操作技术（20分）5、学生用考马斯亮蓝G250染色法检测并计算样品中蛋白质浓度（10分）6、学生制胶、并对上次保存样品进行处理（2小时）7、学生上样、电泳（2小时）8、教师指导学生剥胶（30分）9、教师对凝胶进行染色、漂洗（课下操作，在下次实验时观察实验结果）。

实验层析技术血清球蛋白的分离纯化与鉴定正式版ppt

实验层析技术血清球蛋白的分离纯化与鉴定正式版ppt

G-75 G-100
40～120 40～120
12～15 15～20
3×103 ～ 8×104 4和个性
共性： *生命高分子：透析、超滤、超离心、凝胶层析 *蛋白质溶液是亲水胶体：稳定因素为水化膜和电荷→盐析/
有机溶剂沉淀 *两性电解质和等电点：pH> pI，蛋白质带负电；反之带正 电→电泳、离子交换层析 *有一定的功能：抗原性→ 免疫沉淀
交联葡聚糖凝胶层析介质的有关技术参数
凝胶型号 颗粒大小（μm) 溶胀体积(ml/g) 分离范围（Mr）
G-10 G-15 G-25 G-50
40～120 50～150 50～150 40～120
2～3 2.5～3.5 4～6 9～11
＜7×102 ＜1.5×103 1×103 ～5×103 1.5×103 ～ 3×104
*洗脱液：溶解待分离物质，不变性
阳离子交换剂 带负电荷，与混合物中带正电的组分结合 阳离子交换层析
交联葡聚糖凝胶
➢多聚葡萄糖与环氧丙烷交联而成，网状结构珠状颗 粒，商品名为Sephadex G系列 ➢G—交联度：G后面的阿拉伯数字表示不同的规格型 号，有G-10，G-15，G-25，G-50，G-75，G-100， G-150，和G-200八种，具体含义为凝胶得水值的10 倍或吸水量（g）/10g干胶 ➢交联度与孔径大小成反比：交联度越大，孔径越小， 吸水性小；交联度越小，孔径越大，吸水性大。因此， “G”反映凝胶的交联程度，膨胀程度及分部范围。
异—吸附力、分子形状、大小、酸碱性或分子 ③浓缩：sephadex G-25吸水，利用高分子性质。
01M磷酸盐缓冲液（0. 分离依据：蛋白质理化性质的和个性
极性、分子亲和力以及分配系数。 蛋白质为两性电解质，有一定的等电点，在大于其等电点的溶液中带负电，在电场中向阳极移动，由于各种蛋白质的分子大小与结构

人血清白蛋白的纯化[发明专利]

人血清白蛋白的纯化[发明专利]

[19]中华人民共和国国家知识产权局[12]发明专利申请公开说明书[11]公开号CN 1525977A [43]公开日2004年9月1日[21]申请号02813703.5[22]申请日2002.06.13[21]申请号02813703.5[30]优先权[32]2001.06.13 [33]US [31]60/297,884[86]国际申请PCT/US2002/018965 2002.06.13[87]国际公布WO2002/101021 EN 2002.12.19[85]进入国家阶段日期2004.01.07[71]申请人陶洛斯HSA有限责任公司地址美国马萨诸塞[72]发明人S·富尔顿[74]专利代理机构中国国际贸易促进委员会专利商标事务所代理人唐伟杰[51]Int.CI 7C07K 1/00C12P 21/00A01K 67/027C12N 5/00C12N 15/63权利要求书 2 页 说明书 15 页 附图 1 页[54]发明名称人血清白蛋白的纯化[57]摘要本发明涉及从生产人血清白蛋白(hSA)的宿主细胞的内源血清白蛋白中纯化hSA的方法。

该方法包括提供含hSA及宿主细胞的血清白蛋白的样品，将样品上样到亲和柱上，该柱结合hSA的亲和力大于其结合宿主细胞血清白蛋白的亲和力，从亲和柱上洗脱结合的hSA，并将洗脱的hSA结晶，本发明还涉及包含由本发明的方法生产的hSA的组合物。

02813703.5权 利 要 求 书第1/2页 1.一种从含有人血清白蛋白(hSA)和宿主细胞血清白蛋白的样品中纯化hSA的方法，包括：从宿主细胞获得含有h S A和宿主细胞血清白蛋白的样品； 上样至亲和柱，该亲和柱结合hSA的亲和力高于与宿主细胞的血清白蛋白的结合亲和力；从亲和柱上洗脱结合的hSA；和将洗脱下的hSA结晶。

2.权利要求1中所述方法，其中样品从转基因非人类动物中获得。

3.权利要求2中所述方法，其中动物选自牛、绵羊、山羊、猪、小鼠和兔。

血清蛋白的分离、提纯与鉴定

血清蛋白的分离、提纯与鉴定

血清清蛋白、γ-球蛋白的分离、提纯于鉴定一、实验目的：1、掌握盐析法分离蛋白质的原理和基本方法2、掌握凝胶层析法分离蛋白质的原理和基本方法3、掌握离子交换层析法分离蛋白质的原理和基本方法4、掌握醋酸纤维素薄膜电泳法的原理和基本方法5、了解柱层析技术二、实验原理：蛋白质的分离和纯化是研究蛋白质化学及其生物学功能的重要手段。

对于不同的蛋白质，其分子量、溶解度及等电点等都有所不同。

利用不同蛋白质在这些性质上的差别，利用相应的物理方法可分离纯化不同蛋白质。

A.盐析法：在蛋白质溶液中加入大量中性无机盐后，由于中性盐与水分子的亲和力大于蛋白质，致使蛋白质分子周围的水化膜减弱乃至消失。

同时，加盐后由于离子强度发生改变，蛋白质表面的电荷大量被中和，从而破坏了蛋白质的胶体性质，导致蛋白质溶解度降低，蛋白质分子之间易于聚集沉淀，进而使蛋白质从水溶液中沉淀析出。

B.凝胶层析：利用蛋白质与无机盐类之间分子量的差异。

当溶液通过SephadeG-25凝胶柱时，溶液中分子直径大的蛋白质不能进入凝胶颗粒网孔，而分子量小的无机盐能进入凝胶颗粒的网孔中，因此在洗脱过程中，小分子的盐会被阻滞而后洗脱出来，从而达到去盐的目的。

C.离子交换层析:离子交换层析是指流动相中的离子和固定相上的离子进行可逆的交换，利用化合物的电荷性质及电荷量不同进行分离。

D.纯度鉴定（醋酸纤维素薄膜电泳）：血清中各种蛋白质的等电点不同，一般都低于pH7.4。

它们在pH8.6的缓冲液中均解离带负电荷，在电场中向正极移动。

由于血清中各种蛋白质分子大小、形状及所带的电荷量不同，因而在醋酸纤维素薄膜上电泳的速度也不同。

因此电泳时可将它们分离为清蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白5条区带。

三、材料与方法A材料样品：人混合血清试剂：葡聚糖凝胶（G-25)层析柱、DEAE纤维离子交换层析柱、饱和硫酸铵溶液、醋酸铵缓冲溶液、20%磺基水杨酸、1%BaCl溶液、氨基黑染色液、漂洗液、pH8.6巴比妥缓2冲溶液、电泳仪、电泳槽B实验步骤盐析（粗分离）→葡聚糖凝胶层析（脱盐）→DEAE纤维素离子交换层析（纯化）→醋酸纤维素薄膜电泳（纯度鉴定）具体操作流程示意：（一）盐析+凝胶柱层析除盐：（二）离子交换层析（纯化）：（三）醋酸纤维素薄膜电泳：1、点样（如下图）：-点样线尽量点得细窄而均匀,宁少勿多2、电泳：①薄膜粗面向下②点样端置阴极端③两端紧贴在滤纸盐桥上，膜应轻轻拉平电压：110V时间：50min3、染色和漂洗：电泳完毕后，关闭电源，将膜取出，直接浸于染色液中5min。

血清白蛋白的分离纯化及鉴定(一)-盐析、G-25脱盐、G-75层析

血清白蛋白的分离纯化及鉴定(一)-盐析、G-25脱盐、G-75层析

紫外检测仪记录仪
1、量程一定用10mv。 2、走纸速度：G25，2A，5 cm；G75,1A，1-2 cm。 紫外检测仪使用方法： 1、首先将主机和记录仪二部分电路接妥，然后把主 机的电源插头插入220V电源插座上。 2、出厂前波长设定280nm，若所需其它波长，只需 在仪器右侧转动波长转换旋钮拨到实验所需档。
紫外检测仪的使用
紫外检测仪主要技术指标： 量程范围：0-100%T、0-2A、0-1A、0-0.5A、0-0.2A、0-0.1A、0-0.05A 1、调节光量旋钮，量程旋钮放置100%T档，使LED数字显示为 100，T拨到A档，使LED面板上读数为0左右，若作透光度T测试，就 可在层析柱上加样，对样品进行分离分析。 2、若做光密度A测试，把量程旋钮（即灵敏度）拨到所需光密度 A，调节光量旋钮，使LED面板为0。此时记录仪回到零点附近（注： 零点附近即可，在实验中可自来定）。 3、如绘出图谱峰值过小，把量程旋钮（即敏度）拨到所需位置。 4、在测试过程中，“光量”均不再变动。测试完毕，并用蒸馏水 清洗样品池和管道。
紫外检测仪工作原理
仪器工作原理的依据是光吸收定律。从光源发出的光 经狭缝、滤光片、样品池到光电培增管上，使束由于样品 浓度不同所引起光强的变化转换成光电流的变化，此光电 流经放大器输入到对数转换器，使透光率T转成A输出，即 A=1g — =εCL式中ε为待测样品的克分子消光系统，C为样 品浓度，采用克分子/升单位，L为光程，用厘米作单位。 根据上式就知测出了A，就知样品浓度C。若从放大器直接 输入记录仪，绘出的是样品透光率T变化的图谱，若从对数 转换器输入到记录仪绘出的是样品光密度A变化的图谱。
层析柱，从而达到分离的目的。
凝胶层析
3、当样品通过层析柱时，分子量较大的物质因为不能或 较难通过网孔而进入凝胶颗粒间隙，沿着凝胶颗粒间 的间隙流动，所以流程较短，向前移动的速度较快， 即受阻滞的程度较小，最先流出层析柱；反之，分质

血清免疫球蛋白的提取分离、纯化及鉴定

血清免疫球蛋白的提取分离、纯化及鉴定

I 血液及组织样品的制备分析组织中某种物质的含量、探索物质代谢的过程和规律，经常使用动物的肝、肾、脑、粘膜和肌肉等组织，也选用全血、血浆、血清或者无蛋白血滤液等血液样品，有时也采用尿液、胃液等完成各种生化实验。

掌握以上各种实验样品的正确处理和制备方法是保证生化实验顺利进行的关键。

一、血液样品(一）采血测定用的血液，多由静脉采集。

一般在饲喂前空腹采取，因此时血液中化学成分含量比较稳定，采血时所用的针头、注射器，盛血容器要清洁干净；接血时应让血液沿着容器壁慢慢注入，以防溶血和产生泡沫。

(二）血清、全血及血浆的制备1.血清的制备血清是全血不加抗凝剂自然凝固后析出的淡黄清亮液体。

制备方法是：将刚采集的血液直接注入试管或离心管中。

将试管放成斜面，让其自然凝固，一般经3h 血块自然收缩而析出血清；也可将血样放入37 ℃恒温箱内，促使血块收缩，能较快约析出血清。

为了缩短时间，也可用离心机分离（未凝或凝固的均可离心），分离出的血青，用吸管吸出置于另一试管中，若不清亮或带有血细胞，应重离心，加盖冷藏备用。

2.全血及血浆的制备取清洁干燥的试管或其它容器，收集动物的新鲜血液，立即与适量的抗凝剂充分混合，所得到的抗凝血为全血。

每毫升血液中加入抗凝剂的种类可以根据实验的需要进行选择，但是用量不宜过大，否则将影响实验的结果。

将已抗凝的全二于2，000r / min 离心10min ，沉降血细胞，取上层清液即为血浆。

血浆比血清分离得快而且量多：两者的差别，主要是血浆比血清多含一种纤维蛋白原，其它成分基本相同。

3.抗凝剂凡能够抑制血液凝固反应进行的化合物称为抗凝剂。

抗凝剂种类甚多，实验室常用的有如下几种，可根据情况选择使用。

（1）草酸钾（钠）优点是溶解度大，可迅速与血中钙离子结合，形成不溶性草酸钙，使血液不凝固。

每毫升血液用1-2mg 即可。

配制方法：配制10％草酸钾水溶液二吸取此液0.1ml 放入一试管中，慢慢转动试管，泛草酸钾尽量铺散在试管壁上，置80 ℃烘箱烤干（若超过150 ℃则分解），管壁即呈一薄层三色粉末，加塞备用。

血清蛋白的分离实验报告

血清蛋白的分离实验报告

血清蛋白的分离实验报告血清蛋白的分离实验报告引言：血液是人体内最重要的生命液体之一，其中含有多种生物活性物质。

血清蛋白作为血液中的重要组分，具有多种功能，如携带养分、调节免疫反应等。

为了更好地了解血清蛋白的组成和功能，本实验旨在通过分离血清蛋白的方法，研究其组成和特性。

材料与方法：1. 血清样本：从健康志愿者中采集血液样本，并将其离心，得到血清。

2. 离心机：用于离心血液样本，分离血清。

3. SDS-PAGE凝胶：用于分离血清蛋白。

4. 电泳槽：用于进行SDS-PAGE电泳。

5. 蛋白质标记物：用于判断蛋白质分子量。

6. 蛋白质染色剂：用于染色分离后的蛋白质。

实验步骤：1. 准备血清样本：将采集的血液样本置于无菌离心管中，以3000rpm离心10分钟，得到血清。

2. 准备SDS-PAGE凝胶：根据实验需要，配制相应浓度的凝胶。

3. 加载样品：将分离得到的血清样品加入凝胶槽中，加入适量的蛋白质标记物。

4. 电泳：将凝胶槽连接至电泳系统，设置合适的电压和电流，进行电泳分离。

5. 染色：将分离后的蛋白质凝胶进行染色，以显现蛋白质条带。

6. 分析：观察并记录蛋白质分离结果，根据标记物的位置，推测血清蛋白的分子量。

结果与讨论：通过实验，我们成功地分离出了血清蛋白，并观察到了明显的蛋白质条带。

根据标记物的位置，我们可以初步推测出血清蛋白的分子量范围。

血清蛋白主要分为白蛋白、球蛋白和纤维蛋白原三个主要组分。

白蛋白是血清蛋白中含量最高的成分，具有携带养分、调节渗透压等功能。

球蛋白包括α球蛋白、β球蛋白和γ球蛋白，其中γ球蛋白是免疫反应中的重要组成部分。

纤维蛋白原参与血液凝固过程，是维持血液正常凝固的关键。

通过本实验，我们可以进一步研究血清蛋白的组成和功能。

例如，可以通过蛋白质质谱等方法，进一步鉴定和定量血清蛋白的各个组分。

同时，可以通过Western blot等技术，研究血清蛋白在不同疾病中的变化，探究其在疾病诊断和治疗中的潜在应用。

2021年血清清蛋白γ球蛋白的分离纯化与鉴定实验报告

2021年血清清蛋白γ球蛋白的分离纯化与鉴定实验报告

生物化学试验汇报姓名:学号:专业年级:组别:生物化学与分子生物学试验教学中心格式要求: 正文请统一用: 小四号, 宋体, 1.5倍行距; 数字、英文用Times New Roman; 标题用: 四号, 黑体, 加粗。

需强调地方请用蓝颜色标出。

不得出现多行、多页空白现象。

一、试验目1、掌握盐析法、凝胶层析法、离子交换层析法分离蛋白质原理和基础方法。

2、掌握醋酸纤维素薄膜电泳法原理和基础方法。

3、了解柱层析技术。

二、试验原理1、粗提（盐析法）:蛋白质分子能稳定存在于水溶液中是因为有两个稳定原因: 表面电荷和水化膜。

当维持蛋白质稳定原因破坏时, 蛋白质分子可相互聚集沉淀而析出。

盐在水溶液中电离所形成正负离子可吸引水分子, 从而夺取蛋白质分子上水化膜, 还可中和部分电荷使蛋白质分子聚集而沉淀, 从而达成盐析沉淀蛋白质目。

因为血清中多种蛋白质颗粒大小、所带电荷多少及亲水程度不一样, 所以, 利用不一样浓度硫酸铵溶液分段盐析, 便可将血清中清蛋白和球蛋白从溶液中沉淀出来, 达成初步分离清蛋白、球蛋白目。

2、脱盐（凝胶层析法）凝胶层析法利用蛋白质与无机盐类之间分子量差异。

当溶液经过凝胶柱时, 溶液中分子量较大蛋白质因为不能经过网孔进入凝胶颗粒, 沿着凝胶颗粒间间隙流动, 所以步骤较短, 向前移动速度较快, 最先流出层析柱。

而盐分子量较小, 可经过网孔进入凝胶颗粒, 所以步骤长, 向前移动速度较慢, 较晚流出层析柱。

从而可达成去盐目。

3、纯化（离子交换层析法）离子交换是溶液中离子和交换剂上离子进行可逆交换过程。

带正电荷交换剂称为阴离子交换剂; 带负电荷交换剂称为阳离子交换剂。

本试验采取DEAE纤维素是一个阴离子交换剂, 溶液中带负电荷离子可与其进行交换结合, 带正电荷离子则不能, 这么便可达成分离纯化目。

脱盐后蛋白质溶液尚含有多种球蛋白, 利用它们等电点不一样可进行分离。

血清中多种蛋白质pI各不相同, 所以, 在同一醋酸铵缓冲液中, 各蛋白质所带电荷不一样, 能够经过DEAE离子交换层析将血清清蛋白和γ-球蛋白分离出来。

血清白蛋白的分离纯化-18

血清白蛋白的分离纯化-18
上样顺序：（1）标准蛋白；（2）样品准备步骤 （3）收集的蛋白质溶液；（3）样品准备步骤（6） 收集的蛋白质溶液；（4）－（X）：柱层析出现 高峰的管号蛋白质；
加样量：20μl.
（3） 电泳：点样端负极，恒压：开始80V，待样 品进入分离胶后100V。
电极缓冲液：pH 8.3 Tris –Gly
SDS 可以解决这个问题
SDS的作用：1.能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质 的二级和三级结构，2.能与变性的蛋白质按比例结合，形 成SDS-蛋白质复合物。
SDS-蛋白质复合物的特点：1. 由于结合大量的SDS，使 蛋白质丧失了原有的电荷状态，从而降低或消除了各种 蛋白质分子之间天然的电荷差异；2.复合物都是椭圆棒状， 从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的形状差异。
（3）4 ℃，3,000 rpm离心15 min，收集上清，留0.5 ml至1.5 ml （样 2）离心管，用于电泳；
（4）用5%的柠檬酸缓冲液调节pH至4.9（7-9滴，白蛋白的等电点）， 用量筒确定上清液的体积，计算加入饱和硫酸铵（pH＝4.9）的体积 （0.11×V）；
（5）逐滴加入饱和硫酸铵（pH＝4.9），边加边振 荡，4 ℃静置0.5 h；
纤维素- DEAE+- Cl-
基质 功能基团 反离子
可交换离子带正电荷的为阳离子交换剂；可交换离子带负 电荷的为阴离子交换剂。
RA+B+ RB+A +
在离子交换层析中，蛋白质对离子交换剂 的结合力取决于彼此之间相反电荷基团的 静电吸引，而这又和溶液的pH与盐离子浓 度有关。
因此，蛋白质混合物的分离可以由改变溶 液中盐离子浓度和pH来完成，对离子交换 剂结合力最小的蛋白质首先从层析柱中洗 脱出来。

血清清蛋白、γ-球蛋白的分离、提纯与鉴定-2012医学-第六实验室

血清清蛋白、γ-球蛋白的分离、提纯与鉴定-2012医学-第六实验室

生物化学实验报告姓名：学号：专业年级：组别：第六实验室生物化学与分子生物学实验教学中心一、实验室规则1．实验前应认真预习实验指导，明确实验目的和要求，写出预实验报告。

2．进入实验室必须穿白大衣。

严格遵守实验课纪律，不得无故迟到或早退。

不得高声说话。

严禁拿实验器具开玩笑。

实验室内禁止吸烟、用餐。

3．严格按操作规程进行实验。

实验过程中自己不能解决或决定的问题，切勿盲目处理，应及时请教指导老师。

4．严格按操作规程使用仪器，凡不熟悉操作方法的仪器不得随意动用，对贵重的精密仪器必须先熟知使用方法，才能开始使用；仪器发生故障，应立即关闭电源并报告老师，不得擅自拆修。

5．取用试剂时必须“随开随盖”，“盖随瓶走”，即用毕立即盖好放回原处，切忌“张冠李戴”，避免污染。

6．爱护公物，节约水、电、试剂，遵守损坏仪器报告、登记、赔偿制度。

7．注意水、电、试剂的使用安全。

使用易燃易爆物品时应远离火源。

用试管加热时，管口不准对人。

严防强酸强碱及有毒物质吸入口内或溅到别人身上。

任何时候不得将强酸、强碱、高温、有毒物质抛洒在实验台上。

8．废纸及其它固体废物严禁倒入水槽，应倒到垃圾桶内。

废弃液体如为强酸强碱，必须事先用水稀释，方可倒入水槽内，并放水冲走。

9．以实事求是的科学态度如实记录实验结果，仔细分析，做出客观结论。

实验失败，须认真查找原因，而不能任意涂改实验结果。

实验完毕，认真书写实验报告，按时上交。

10．实验完毕，个人应将试剂、仪器器材摆放整齐，用过的玻璃器皿应刷洗干净归置好，方可离开实验室。

值日生则要认真负责整个实验室的清洁和整理，保持实验整洁卫生。

离开实验室前检查电源、水源和门窗的安全等，并严格执行值日生登记制度。

二、实验报告的基本要求实验报告通过分析总结实验的结果和问题，加深对有关理论和技术的理解与掌握，提高分析、综合、概括问题的能力，同时也是学习撰写研究论文的过程。

1．实验报告应该在专用的生化实验报告本上、按上述格式要求书写。

血清白蛋白的分离与纯化、蛋白定量测定

血清白蛋白的分离与纯化、蛋白定量测定
血清白蛋白的分离与纯化、 蛋白定量测定
实验ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ的

掌握DEAE纤维素层析法分离纯化蛋白的方 法

掌握考马斯亮兰法测定蛋白质的原理
DEAE纤维素层析法分离纯化 白蛋白
离子交换层析基本原理

根据待分离物质带电性质不同的分离纯化 方法 以离子交换剂为固定相，特定的离子溶液 为流动相，依据各种离子或离子化合物与 离子交换剂的结合力不同进行分离纯化的 层析方式

β-球蛋白 γ-球蛋白
5.06
5.12 6.85-7.50
300000
9000-150000 156000-300000
实验原理

除去硫酸铵后的白蛋白在0.02mol/L醋酸铵缓冲液（pH 6.5）条件下，加 到DEAE纤维素柱上，此pH时， DEAE纤维素带正电荷。 改用0.06mol/L醋酸铵缓冲液（pH 6.5）后。在此pH与离子强度时， DEAE-纤维素带有正电荷，能吸附带负电荷的蛋白质如白蛋白（pI 4.9）。 带正电荷蛋白质如γ-球蛋白（pI约7.3），不被吸附故直接流出。用 0.06mol/L醋酸铵缓冲液洗脱吸附在离子交换柱上的少量β-球蛋白及α-球 蛋白。 将醋酸铵浓度提高至0.3mol/L，白蛋白被洗脱下来（尚混有少量α-球蛋 白）。 整个层析过程用紫外检测仪监测流出蛋白组分，用自动部分收集器收集， 用记录仪记录整个洗脱过程。
1标准方法1具体测定按下表操作待测样品的加样量见下表的第8910管加入物ml001002004006008010002004006蒸馏水01009008006004002008006004考马斯亮蓝试剂50505050505050505050边加边混匀23分钟后以1号管为空白对照测定各样品在595nm处的光吸收值a595最好在试剂加入后的520min内测定吸光值因为这段时间内颜色最稳定测定中蛋白染料复合物会有少部分吸附在比色杯壁中不可使用石英比色皿因不易洗去染色可用塑料或用玻璃比色皿使用后用95的乙醇荡洗以洗去染色
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1、层析过快，接取样品纯 度不够高； 2、上样量要适当，不要超 过柱的负荷能力。柱的负荷 能力可用交换容量来推算， 通常上样量为交换剂交换总 量的1%-5%； 3、洗脱液体积不足，导致 分离的各峰太过拥挤。
1、制胶不理想：浓缩胶长 度不够，可能导致条带过粗， 分离胶浓度过大会有拖尾现 象； 2、两板之间有气泡：条带 两边向下，中间鼓起； 3、电极不平衡：条带偏斜； 4、加样过多：条带两边扩 散。
编号 溶液名称 12%分离胶
1
2 3 4 5 6 总体积
30% Acr –0.8% Bis
pH 8.9 Tris -HCI 10%SDS TEMED 10%AP H2O
2.0ml
1.25ml 100ul 2.5ul 50ul 1.65ml 约5 mL
血清白蛋白相对分子量的测定
b. 浓缩胶的制备
在另一个干净的小烧杯中。 4.5％分离胶浓度，2.5 ml体积配制用量表：
②4℃，3000rpm离心15min，收集上清液。 ③用5%的柠檬酸缓冲液调节pH至4.5（即白蛋白的等电点），用量筒确定上清液的
体积，确定上清液的体积，计算加入饱和硫酸铵（pH＝4.5）的体积（0.11×V）。
④逐滴加入饱和硫酸铵（pH＝4.5），边加边振荡，4 ℃静置2 h。 ⑤4 ℃，3,000 rpm离心20 min，弃上清，沉淀用0.5 ml pH 7.4的柠檬酸Na2HPO4缓冲液溶解。
编号
1 2 3 4 5 6 总体积
溶液名称
30% Acr –0.8% Bis pH 6.7 Tris- HCI 10%SDS TEMED 10%AP H2O
4%浓缩胶
0.33ml 0.63ml 25ul 2.5ul 12.5ul 1.5ml 约2.5 mL
血清白蛋白相对分子量的测定
c. 样品的处理： 向标准蛋白质或待测样品中按比例加入上样缓冲液（Loading dye），充分溶解后，加盖（不要密闭），置沸水浴3 min， 取出冷至室温。 加样示意图：
04
预计实验结果
The expected experimental results
确定电泳取样的试管编号
标准蛋白质相对分子质 量（kda） 染料迁移距离（cm） 样品迁移距离（cm） 相对迁移率（mr）
标准蛋白质相对分子质 量对数（kda）
可以根据标准蛋白相对分子质量对数及相对迁移率做出标准曲线，以相对迁移率为横 轴，以标准蛋白相对分子质量对数为纵轴，预测应为一条直线。
Ⅲ.血清白蛋白相对分子量的测定：SDS－PAGE法
SDS－PAGE是最常用的定性分析蛋白质的电泳方法，特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋 白质分子量。 电泳迁移率与颗粒的电荷、形状、大小（分子量）有关，如电荷、形状都一 样，则电泳迁移率只与分子量有关。 SDS的作用： 1.能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂（巯基乙醇）能 使二硫键断裂，使蛋白质完全变性； 2.能与变性的蛋白质按比例结合，形成SDS-蛋白质复合物。 SDS-蛋白质复合物的特点：1. 由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态，从 而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异； 2.复合物都是椭圆棒状，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的形状差异。 因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子量大小。
掌握血清白蛋白分离纯化的方法； 学会用盐析和离子交换柱层析法分离纯化蛋 白质的原理与操作； 掌握SDS-PAGE凝胶电泳测定蛋白质分子量的 原理和方法。
02
实验原理
The experimental principles
Ⅰ.血清白蛋白的初步分离
在半饱和硫酸铵溶液中，血清白蛋白不沉淀，球蛋白沉淀，离心后白蛋 白主要在上清液中。由于血清白蛋白的相对分子质量较硫酸铵大得多， 故盐析初步分离的白蛋白可用透析法或凝胶层析法除去硫酸铵。 奈氏试剂是络盐 K2[HgI4] 加 KOH 的溶液，在无机化学定性分析中，用 其检验氨或铵盐
盐析过程中温度和pH的 控制不当，可能使得所 得目标产物白蛋白量较 少，影响后续测定。
离子交 换层析
SDS-PAGE法
盐析
可能出现的问题！！！
盐析
广泛使用的分离蛋白质的方法，所谓的盐析就是用大量中性盐 使蛋白质从溶液中析出的过程。在高浓度的中性盐影响下，蛋 白质分子的水化膜被剥夺及所带的电荷被中和，因而破坏了蛋 白质溶胶的稳定因素，使蛋白质沉淀析出。但中性盐并不会使 蛋白质变性，因此，若除去中性盐或减低盐的浓度，蛋白质就 可以重新溶解。
电泳预期效果
标准蛋白相对分子质量对数及 相对迁移率做出的标准曲线
05
可能结果偏差及解释
Possible result bias and interpretation
测得的人血清白蛋白分子量偏大 测得的人血清白蛋白分子量偏小
为 什 么 结 果 会 偏 大 ？
蛋白质的磷酸化
凝胶浓度不合适，蛋白质跑不动
人血清白蛋白的提取纯化 与分子量的测定
Loading……
1 1 2 2
实验目的及意义
实验原理 实验步骤 预计实验结果呈现形式
目录
Contents
3 3 4 4 5 5 6 6
可能结果偏差及解释
实验重点与难点剖析
01
实验目的及意义
The experimental purpose and meaning
表达的蛋白质提前终止了或者降解
SDS变性目的蛋白质不完全，使得蛋白质的 空间结构没有成为线型，构成了空间位阻 离子交换柱分离效果不好，杂质导致电泳 条带过宽，影响结果分析
为 什 么 结 果 会 偏 小 ？
人血清白蛋白是由 3 个结构相似的 α - 螺旋结构域组成 的，它们在 SDS 等的作用下，可能解离成亚基或单条 肽链。因此，SDS-凝胶电泳测定的不是完整分子的分 子量。
The experimental steps
I. 血清白蛋白的初步分离 II. 血清白蛋白的纯化
III.血清白蛋白相对分子量的测定
血清白蛋白的初步分离
1. 取样
取2ml血液，4℃，3000rpm离心15min，移取上清液（血清）1ml至10ml离心管。 2. 盐析
①量取9ml50%的饱和硫酸铵溶液，以移液管逐滴加入，同时不断振荡，4℃静置2h。
样品2 样品2 标准蛋白样品1 （Marker） 样品2 样品2
以微量注射器或移液枪加入10-20ul至样品槽内。
血清白蛋白相对分子量的测定
d. 电泳：点样端负极，恒压：开始80V，待样品进入分离胶后改为100V进行电泳， 待蓝色染料迁移至下端约 1cm 时，停止电泳，约需 1 ～ 2 小时。（电极缓冲液： pH 8.3 Tris –Gly） e. 染色：剥胶后加入考马斯亮兰R-250，染色20min。 f. 脱色：染色完毕，倾出染色液，加入脱色液。20～30min换一次脱色液，2～3次 后可初步观察电泳条带，然后脱色过夜，直至背景清晰。
血清白蛋白的纯化——离子交换层析
①装柱：将层析柱固定，保持垂直位。将浸胀的 DEAE- 纤维素装入柱内，至 810cm高度，平衡过夜（装柱时应注意均匀，凝胶内不得有气泡，凝胶床要平整）。 ②准备50-100支试管，置于自动收集器上；洗脱液经核酸蛋白检测仪监视，调节
流速为 1mL/min，蛋白质检测器调零。
血清白蛋白的初步分离
3. 透析
①将剩余的0.4 ml蛋白质溶液将透析袋中，放入pH 7.4的柠檬酸Na2HPO4缓冲液中，搅拌透析过夜至蛋白质溶液中无NH4＋存 在。 ②NH4＋的检测（奈氏试剂检测）：取1 ml透析液，加入5滴奈 氏试剂，混匀，观察，如果出现砖红色沉淀，说明仍有NH4＋存 在，需继续透析。
该法测定蛋白质分子量的局限性：
1.蛋白质是由亚基（如血红蛋白）或两条以上肽链（如胰凝乳蛋白酶）组成的，测定时只 是它们的亚基或单条肽链的MW。 2. 电荷异常的蛋白质（如组蛋白，带大量正电荷）。 3.结构异常，不于分子量呈线性关系（如胶原蛋白）。 4.带有较大辅基的蛋白质（如糖蛋白）。
03
实验步骤
血清白蛋白相对分子量的测定
g. 计算
通常以相对迁移率(mr)来表示迁移率。相对迁移率的计算方法如下：用直尺分别量出样品区带 中心及染料与凝胶顶端的距离，按下式计算： 相对迁移率(mr) = 样品迁移距离(cm)／染料迁移距离(cm)。 以标准蛋白质相对分子质量的对数对相对迁移率作图，得到标准曲线。根据待测样品的相对迁 移率，从标准曲线上查出其相对分子质量
血清白蛋白
血清白蛋白约占血浆蛋白总量的 60% ，水溶性很强，结构稳定， 能结合多种小分子，如脂肪酸，胆红素，血红素等，起维持血 液的正常渗透压作用。此外白蛋白还有解毒、参与脂类代谢及 血浆中微溶物质的运输、维持血液酸碱平衡等作用，在医学临 床及生物领域应用广泛。可以根据不同蛋白质的相对分子质量、 溶解度以及在一定条件下带电的情况的不同来分离及提纯各种 蛋白质。
Ⅱ.血清白蛋白的纯化：DEAE－纤维素阴离子交换剂
离子交换层析是一种用离子交换树脂作支持剂的层析方法。 本实验采用的是DEAE－纤维素阴离子交换剂（中强碱型），可电离基团是二乙基氨 基乙基，适用于大分子的分离。在离子交换层析中，蛋白质对离子交换剂的结合力 取决于彼此之间相反电荷基团的静电吸引，而这又和溶液的pH与盐离子浓度有关。 因此，蛋白质混合物的分离可以由改变溶液中盐离子浓度和 pH来完成，对离子交换 剂结合力最小的蛋白质首先从层析柱中洗脱出来 。除硫酸铵后的白蛋白溶液在 0.02mol/L pH7.4 醋酸铵缓冲液的条件下，加到二乙氨乙基（DEAE ）一纤维素层 析柱上，在此pH 时，DEAE 一纤维素带有正电荷，它能吸附带负电荷的白蛋白、α 及β 球蛋白（血清白蛋白等电点为4.5，绝大多数，α 及β 球蛋白等电点均小于6 ）。 随着盐离子浓度的提高，离子交换柱上的β －球蛋白、α －球蛋白、白蛋白依次被洗 脱下来。