【CN109627322A】一种从Cohn组分上清中分离纯化人血清白蛋白的方法【专利】

专利名称：一种从水稻种子中分离纯化重组人血清白蛋白的方法
专利类型：发明专利
发明人：杨代常,何洋,李光飞
申请号：CN201010606635.8
申请日：20101224
公开号：CN102532254A
公开日：
20120704
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明提供了一种从转基因水稻中分离纯化重组人血清白蛋白的方法，依次包括步骤：1)将重组人血清白蛋白粗提取物进行阳离子交换层析，得到初级产物I；2)将初级产物I进行阴离子交换层析，得到中级产物II；3)将中级产物II进行疏水层析，得到纯化的重组人血清白蛋白。

该方法成本低，易于操作，并且获得的rHSA达到99％以上的HPLC纯度。

申请人：武汉禾元生物科技有限公司
地址：430079 湖北省武汉市东湖开发区高新大道666号
国籍：CN
代理机构：北京律诚同业知识产权代理有限公司
代理人：黄韧敏
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(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910164725.7(22)申请日 2019.03.05(71)申请人 上海医药工业研究院地址 200040 上海市静安区北京西路1320号申请人 中国医药工业研究总院(72)发明人 谢丽萍　胡又佳　朱文　吴珺艺　阮江雄　韩姝　徐磊　(74)专利代理机构 上海弼兴律师事务所 31283代理人 薛琦　王卫彬(51)Int.Cl.C12P 21/02(2006.01)C12N 15/81(2006.01)C07K 14/765(2006.01)C07K 1/22(2006.01)C12R 1/84(2006.01) (54)发明名称一种人血清白蛋白的制备方法及其纯化方法(57)摘要本发明提供了一种人血清白蛋白的制备方法，其包括将产人血清白蛋白的巴斯德毕赤酵母菌接种于培养基中发酵，从发酵液中获得人血清白蛋白即可；所述培养基为除了甘油和毕赤酵母微量元素1两种组分外，其余组分浓度均至多降低为1/4的BSM培养基，优选降低为1/4～1/2的BSM培养基。

本发明还提供了一种人血清白蛋白的纯化方法。

利用本发明的制备方法制得的人血清白蛋白的产量及其占总蛋白的比例均显著高于现有技术，且该制备方法中所使用的培养基成本显著降低，且无动物源性病毒污染的风险，从而显著降低制备方法的成本。

利用本发明所述的纯化方法纯化的回收率显著提升，并且最终产品的纯度也显著进一步提升。

权利要求书2页 说明书11页序列表2页 附图11页CN 111662944 A 2020.09.15C N 111662944A1.一种人血清白蛋白的制备方法，其特征在于，其包括将产人血清白蛋白的巴斯德毕赤酵母菌(Pichia pastoris)接种于培养基中发酵，从发酵液中获得人血清白蛋白即可；其中，所述培养基为除了甘油和毕赤酵母微量元素1两种组分外，其余组分浓度均至多降低为1/4的BSM培养基，优选降低为1/4～1/2的BSM培养基。

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710317433.3(22)申请日 2017.05.05(71)申请人 浙江大学地址 310058 浙江省杭州市西湖区余杭塘路866号(72)发明人 林东强　褚文宁　吴启赐　姚善泾　(74)专利代理机构 杭州求是专利事务所有限公司 33200代理人 郑海峰(51)Int.Cl.C07K 14/765(2006.01)C07K 1/16(2006.01)(54)发明名称一种从酵母发酵液中分离人血白蛋白的混合模式层析方法(57)摘要本发明公开了一种从酵母发酵液中分离人血白蛋白的混合模式层析方法，属于生物化工领域中的蛋白质层析分离技术。

具体步骤如下：1)发酵液预处理，取含有人血白蛋白的酵母发酵液，离心去除酵母细胞，加入辛酸钠，加热，去除杂蛋白和灭活蛋白酶，离心分离，取上清液；2)柱层析，采用色氨酸为配基的混合模式介质，固定床层析分离上清液，上样pH值4.0～4.5，洗脱pH值7.0～9.0，收集洗脱峰。

3)脱盐和干燥，将收集液脱盐，冷冻干燥，得到纯度大于95％的人血白蛋白。

本发明的特色在于开发了一种新的分离工艺，可以从酵母发酵液中直接分离得到高纯度的人血白蛋白。

方法的关键在于采用了以色氨酸为配基的混合模式介质，酵母发酵液无需调整离子强度，酸性条件下吸附，中性和弱碱性洗脱，具有洗脱条件温和、工艺简单、分离效率高、收率高的特点。

权利要求书1页 说明书5页 附图2页CN 107033236 A 2017.08.11C N 107033236A1.一种从酵母发酵液中分离人血白蛋白的混合模式层析方法，其特征在于包括如下步骤：1)取含有人血白蛋白的酵母发酵液，通过离心去除酵母细胞，调节pH至6.0，加入辛酸钠至5～20mM，68℃加热30min，用离心机以8000～10000rpm转速离心10～20min，取上清液，得到人血白蛋白粗品溶液；2)调节人血白蛋白粗品溶液的pH至4.0～4.5，用0.45μm滤膜过滤后，上样到填充有以色氨酸为配基的混合模式介质的层析柱中，平衡缓冲液冲洗，洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱峰对应的洗脱缓冲液，得到人血白蛋白溶液；3)将人血白蛋白溶液脱盐，冷冻干燥，得到纯度大于95％的人血白蛋白；所述的混合模式介质为MX-Trp-650M，或者以酰胺键偶联色氨酸氨基作为配基的层析介质；所述的平衡缓冲液pH值为4.0～4.5；所述的洗脱缓冲液pH值为7.0～9.0。

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202011544901.9(22)申请日 2020.12.24(71)申请人 河北医科大学第二医院地址 050000 河北省石家庄市和平西路215号(72)发明人 安雯婷　郭丽娜　(74)专利代理机构 石家庄知住优创知识产权代理事务所(普通合伙) 13131代理人 王丽巧(51)Int.Cl.C07K 14/765(2006.01)C07K 1/14(2006.01)C07K 1/16(2006.01)(54)发明名称一种重组人血清白蛋白的分离纯化方法(57)摘要本发明公开了一种重组人血清白蛋白的分离纯化方法，包括分离方法和纯化方法，分离的具体步骤如下：第一步：将人血清白蛋白溶液和盐按照比例进行混合，使白蛋白从溶液中分离出来，所述人血清白蛋白溶液和盐的比例为40‑50:1，初步得到粗提取液；第二步：将得到的粗提取液进行沉淀，使白蛋白上浮、球蛋白沉淀，得到白蛋白样品以及球蛋白样品；第三步：将得到的白蛋白、球蛋白样品溶液提取至容器中，用醋酸铵缓冲液对样品进行洗涤，洗涤次数为2‑4次。

本发明中提出的一种重组人血清白蛋白的纯化方法，提纯后的人血清白蛋白质量较高，可以满足使用者的使用需求。

权利要求书1页 说明书4页CN 112480240 A 2021.03.12C N 112480240A1.一种重组人血清白蛋白的分离纯化方法，包括分离方法和纯化方法，其特征在于，分离的具体步骤如下：第一步：将血清白蛋白溶液和盐按照比例进行混合，使白蛋白从溶液中分离出来，所述人血清白蛋白溶液和盐的比例为40‑50:1，初步得到粗提取液；第二步：将得到的粗提取液进行沉淀，使白蛋白上浮、球蛋白沉淀，得到白蛋白样品以及球蛋白样品；第三步：将得到的白蛋白、球蛋白样品溶液提取至容器中，用醋酸铵缓冲液对样品进行洗涤，洗涤次数为2‑4次；第四步：将洗涤后的样品血浆冷冻至‑10到‑20度之间，再将样品进行解冻，解冻后使用离心法，得到蛋白质液体，并收集；第五步：将收集后的蛋白质液体进行凝胶层析，用醋酸铵缓冲液进行洗流，再检查流出液，检查合格后即可再生平衡；纯化的具体步骤如下：第一步：将脱盐后的蛋白样品进行上柱，用醋酸铵缓冲液进行洗涤，使样品流出25‑35ML后，再将液面与床面齐平；第二步：再用醋酸铵缓冲液进行洗脱，检查流出液是否合格；第三步：将流出的蛋白进行收集，收集3管，每管15滴，得到纯化后的人血清白蛋白样品。

专利名称：纯化血清白蛋白及免疫学测定方法专利类型：发明专利
发明人：原康之,赤峰隆之,吉川胜己,川本道子申请号：CN200980109240.2
申请日：20090327
公开号：CN101978268A
公开日：
20110216
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明的目的在于提供批次差少的纯化血清白蛋白、及使用该纯化血清白蛋白的反应性高、非特异性反应少的免疫学测定方法。

本发明为一种纯化血清白蛋白，在免疫学测定方法中用于封闭剂和/或不溶性载体的悬浮液，其中，以制成1％水溶液时使用光程长为1.0cm的石英池在463nm的波长下测定的吸光度为9.0mAbs以下的组分为主成分。

申请人：积水医疗株式会社
地址：日本国东京都
国籍：JP
代理机构：中科专利商标代理有限责任公司
代理人：朱丹
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第21卷第丨期2021年1月过程工程学报The Chinese Journal of Process Engineering Vol.21 No.lJan.2021D O I : 10.12034/j .i s s n . 1009-606X.220073Direct separation of human serum albumin from Cohn fraction Vsupernatant by one-step ion exchange chromatographyJie X IA N G 1, Songping ZHANG 2, Guifeng ZHANG 2, Jian LUO 2*, Rong Y U 1*1. Department of Biopharmaceutics, West China School of Pharmacy, Key Laboratory of Drug-Targeting and Drug Delivery System ofthe Education Ministry, Sichuan Engineering Laboratory for Plant-Sourced Drug and Sichuan Research Center f o r Drug PrecisionI n d u s t r i a l Technology, West China School of Pharmacy Sichuan University, Chengdu, Sichuan 610041, China2. State Key Laboratory of Biochemical Engineering, I n s t i t u t e of Process Engineering, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100190,ChinaAbstract: Fraction V supernatant is an effluent o f Cohnfractionation in plasma protein industry . Due to its high ethanol 0 O Cold ethanol p r e c i p i t a t i o nconcentration , further recovery of the residual protein has been •i , ii +iii ,medium to BSA in ethanol-aqueous solution was very weak , and the increase o f ethanol concentration led to the adsorption capacity approaching to 0. The cation exchange medium had a high adsorption capacity at low ethanol concentration , but decreased quickly with the increase o f the ethanol concentration . In contrast , the anion exchange medium showed the best adsorption performance , and the adsorption capacity in 40% ethanol-aqueous solution still reached 34.66 mg /mL . Further experiments showed that the adsorption of BSA on the anion exchange medium in the presence o f ethanol could be described by Langmuir isothermal adsorption equation . The anion exchange medium DEAE Sepharose Fast Flow was packed into a chromatographic column . Real purification of Cohn fraction V supernatant was performed . The Cohn fraction V supernatant , containing about 40% ethanol , was directly loaded to the anion exchange column . A two-step elution strategy was used . The first elution was pH change from 7.0 to 4.5 to obtain the target product human serum albumin , and the second elution was to increase the concentration of sodium chloride from 0 to 1 mol/L to elute glycoproteins . The purity of HSA was 96.35% by electrophoresis , and the activity of binding to the ligand warfarin was comparable to that of commercial HSA product by Cohn fractionation . The total recovery was 43 mg/L Cohn fraction V supernatant .Key words: human serum albumin ; fraction V supernatant ; ion exchange chromatography ; low-temperature ethanolprecipitation ; protein structure收稿：2020-03-05，修回：202(MM~02，网络发表：2020-05-09，Receive 山 2020-03-05, Revised: 2020~04~02, Published o n l i n e : 2020-05-09 基金项目：国家重点研发计划资助项目(编圩：2016YFD0500800;2016YFD0500809);国家自然科学基金资助项目(编号：2182丨005)作者简介：向杰(1994-)，男，重庆市云阳县人，硕士研究生，研宄方向：蛋白质分离纯化：通讯联系人，罗坚，E-man:j l U 〇@ipe.a c .c n ;余蓉，E-mail:**************.cn.引用格式：向杰，张松平，张贵锋，等•一步离子交换层析从Cohn 组分V 上清液中分离人血清白蛋白.过程工程学报，2021，21(1): 92-99.Xiang J , Zhang S P , Zhang G F , e t a l . Direct separation of human serum albumin from Cohn f r a c t i o n V supernatant by one-step ion exchangechromatography (i n Chinese). Chin. J . Process Eng., 2021, 21(1): 92-99, DOI: 10.12034/j.issn.l009-606X.220073.regarded as non -economical . In this work , a recovery o f human serum albumin (HSA ) from fraction V supernatant by ion exchange chromatography was reported , which had not been reported in the literature to our knowledge . Firstly , bovine serum albumin (BSA ) was used as model protein to compare the adsorption capacity of IV-1,IV-4, v^ Media s c r e e n i n g : BSA(0%~40% e t h a n o l )three different types of chromatographic media in different ethanol - h s aaqueous solutions . The adsorption capacity of the hydrophobicDEAE C M Octylv第1期向杰等：一步离子交换层析从Cohn组分V上清液中分离人血清白蛋白93一步离子交换层析从Cohn组分V上清液中分离人血清白蛋白向杰、张松平2，张贵锋2，罗坚2%余蓉卜1.四川大学华西药学院生物技术药物学系，靶向药物与释药系统教育部重点实验室，四川省植物来源工程实验室和四川省小分子药物精准化工程技术研宄中心，四川成都6100412.中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室，北京丨00190摘要：传统的血浆低温乙醇沉淀工艺中C o h n组分V上清液由于其乙醇浓度高(体积浓度40%),进一步回收残余蛋白困难而 被作为废弃组分。

(10)申请公布号 CN 102070714 A(43)申请公布日 2011.05.25C N 102070714 A*CN102070714A*(21)申请号 201010561294.7(22)申请日 2010.11.26C07K 14/765(2006.01)C07K 1/36(2006.01)(71)申请人大连理工大学地址116023 辽宁省大连市甘井子区凌工路2号(72)发明人董悦生 张帆 修志龙(74)专利代理机构大连理工大学专利中心21200代理人梅洪玉(54)发明名称一种重组人血清白蛋白的分离纯化方法(57)摘要本发明提供一种操作简单、快速、有效的重组人血清白蛋白的纯化方法，重组人血清白蛋白溶液经过亲水性有机溶剂/无机盐双水相萃取、回收有机溶剂、加热除色素、结合方式的疏水层析和硼酸盐处理等步骤纯化后，可以得到电泳纯度大于99.9％，多糖含量不高于1.89μg/ml ，色素比值A350/A280低的重组人血清白蛋白，同时经亲水性有机溶剂/无机盐双水相萃取的重组人血清白蛋白溶液具有不易降解、稳定性高的特点。

本发明解决了人血清白蛋白分离纯化中分离步骤繁琐、多糖等杂质含量低的问题，具有很好的应用前景。

(51)Int.Cl.(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书 1 页 说明书 8 页 附图 1 页1.一种重组人血清白蛋白的分离纯化方法，其特征在于包括以下步骤：(1)双水相萃取：向获得的重组人血清白蛋白溶液中添加可溶性无机盐和亲水性有机溶剂并充分搅拌，通过调节可溶性无机盐、亲水性有机溶剂和含重组人血清白蛋白溶液比例形成双水相，上相即为富含重组人血清白蛋白的萃取相；加入的可溶性无机盐占双水相体系的质量百分数为5％～35％；加入亲水性有机溶剂占双水相体系的质量百分数为5％～40％；可溶性无机盐为磷酸盐、硫酸盐、碳酸盐、卤化物或其中二种以上的混合物；亲水性有机溶剂为碳数不高于8的醇类、碳数不高于8的酮类或其二种以上的混合物；(2)回收有机溶剂：对双水相萃余相采用蒸馏和/或精馏的方法回收有机溶剂，蒸馏前需用酸或碱调节pH为5.5～9.0，蒸馏和/或精馏处理的温度为20～45℃，时间为15～60min，蒸馏和/或精馏时重组人血清白蛋白溶液中添加终浓度为5～20mmol/L的辛酸钠、1～10mmol/L的半胱氨酸和1～10mmol/L的EDTA；回收有机溶剂后，重组人血清白蛋白溶液中有机溶剂含量低于20％；(3)加热除色素：将回收有机溶剂后的重组人血清白蛋白溶液加热处理，加热温度为60～80℃，加热时间为30min至5h，pH为5.0～8.0；(4)疏水层析：加热处理后的重组人血清白蛋白溶液超滤、加无机盐并调节pH值后，使之流入装有疏水介质的色谱柱；使用含5～20mmol/L辛酸钠的无机盐溶液洗脱，得到纯化的重组人血清白蛋白；上样液pH为5.5～9.0，无机盐溶液浓度为0.6～4.0mol/L，洗脱液pH为5.5～9.0，无机盐溶液浓度为0.01～0.5mol/L；疏水层析介质的配基含有苯基、丁基或辛基基团；纯化的重组人血清白蛋白只能从与疏水介质结合部分得到；(5)硼酸盐处理：在经疏水层析纯化的重组人血清白蛋白溶液中加入四硼酸钠和氯化钙、调节pH值、并搅拌，离心或过滤去除沉淀，从上清液中回收重组人血清白蛋白：四硼酸钠的浓度为0.01～1.0mol/L，氯化钙的浓度为0.01～1.0mol/L，pH为pH 8.0～11.0，搅拌时间为15min～10h。