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黑色素培植过程黑色素培植是一种自然界常见且被多余物种利用的分子进化策略。
它可以用来培养多种细菌、酵母和真菌，有助于揭示系统中未知的分子机制。
因此，了解黑色素培植的工艺是必要的。
一、黑色素培植的基础1. 背景：黑色素培植，也称为“色素细胞培养”，意味着将高度色素密度的细胞从源培养基中分离，再重新培养在新培养基上。
2. 优点：黑色素培植不仅具有高度可重复性，而且可以用于大规模培养细胞。
此外，由于不需要任何添加剂，它可以简化分离工序。
二、黑色素培植的步骤：1. 准备培养环境：首先将酿酒酵母的源培养基及培养皿中的细胞，加入检测培养基中。
2. 活化：将细胞加入培养基中并搅拌，使其活化，然后2回合循环，每回合搅拌1min后，培养基搅拌旋转速度减半。
3. 加入诱导剂：黑色素培植中使用的诱导剂通常为10％乙醇。
4. 保温培养：将培养皿转移到水浴中，并用恒温器加热并保温30min，保温结束后，将培养皿取出，摇晃，使细胞及全培养液均匀浸温。
5. 加入抑制剂：将常用的抑制剂（如吡哆醛）加入冷却的培养液中，使其以室温常温培养1-2小时以得到更好的结果。
6. 过滤：将培养液过滤到新的培养基。
三、黑色素培植的注意事项：1. 在培养液中加入足够的乙醇，以使细胞可以重复激活。
2. 避免细胞在水浴中受过热，以防止过热反应。
3. 使用均质搅拌器加热和搏动细胞，使其有效地从源培养基中分离出来。
4. 加入抑制剂以抑制黑色素增生，以获得最佳效果。
5. 将培养液存放在干燥和温暖的条件，以保持黑色素培养质量。
四、总结以上所述就是黑色素培植的过程，它有助于揭示系统中未知的分子机制，也是一种被多种物种利用的分子进化策略。
但是在进行这项工作时，应该小心地来操作，以免出现意外情况。
黑色素细胞体外培养技术的研究及应用维普资讯 ////0>.堑堡匿堂生箜墨鲞黑色素细胞体外培养技术的研究及应用新疆维吾尔自治区人民医院刘熔李红健综述一、体外培养技术的建立表皮培养而设计的培养液,钙离子浓度为.。
.概述:黑素细胞起源于外胚层的神经嵴,其数量与部但对一些要求较高的基础性研究来说,由于血清位、年龄有关与肤色、人种、性别等无关。
几乎所成分非常复杂,常使研究结果影响较大,同时血清中有组织内均有黑素细胞,但以表皮、毛囊、黏膜、视网也含有一定的细胞:莓性物质和抑制剂,对细胞有去分膜色素上皮等处为多。
位于表皮的基底层,与化作用,影响某些细胞功能的表达。
因此现在的研究者都在寻找不含血清或其他天然培养基成分的培养表皮细胞共同组成表皮黑素单位,其主要功能是产生液。
黑素小体保护皮肤免受损害。
最近研究表明,在某些不良条件刺激下,黑色素细胞可发生分裂、增殖、黑素无血清培养基一般包括基础培养液及辅加成分形成、移行等一系列行为参与机体代谢。
两部分。
无血清培养基的基础培养液一般采用人工应用细胞培养技术建立的体外纯培养,是研合成培养基,常用 /、培养液等。
究皮肤色素障碍性疾病的重要手段。
因此体外培养 .影响黑色素细胞生长的因子:人是人们十分关注的一项研究课题。
黑色素细年等在培养基中加入和胞的培养可以追溯到年代,但是直到年代才真首次成功地培养出了黑素细胞。
其机理是除正建立了可靠的黑色素细胞培养方法。
年了可以刺激黑素细胞自分泌特定的生长因子外,在化学结构上与二酯酰甘油类似,可以取代首先报告体外培养人黑色素细胞以来,由于培养技术没有突破,而未能培养出大量纯化的人活化蛋白激酶,是以为代表黑素细胞。
随着细胞生物技术的迅速发展,年的佛波酯类化合物的主要受体和靶点,通过信号转导美国和在含有辅助致癌因子途径/刺激黑素细胞增殖。
也有人认为培一一一一,或 ? 养成功的关键是对角质形成细胞有毒性作用,一一一 , 、霍舌毒可以抑制成纤维细胞生长,从而避免角质形成细素 ,和 %胎牛血清的培养液中, 胞和成纤维细胞污染,使黑素细胞快速生长。
原代培养第1 天1. 用70 % 乙醇浸洗皮肤标本，然后用D-PBSA 浸洗2 次。
2. 将组织移入无菌100 mm 培养皿，表皮面朝下。
3. 用解剖剪除去皮下脂肪和深部真皮。
4. 将剩余的组织用手术刀切成2 mm ×2 mm 小块。
刀片在组织上摇动，但不要采用锯切。
5. 将组织块移入盛有冷的0.25 % 胰蛋内酶的15ml 离心管。
6. 在室温条件下，将组织块孵育60~90 min 。
对于某些供体的皮肤，先在4°C 条件下孵育18~24 h，然后在37°C 条件下孵育1~2 h，这样可获得较多的黑素细胞。
第2 天7. 轻拍离心管，使沉于底部的组织块移动。
然后，将离心管内的内容物快速倒入60 mm 培养皿。
8. 用手术镊将组织块逐一地移入100 mm 干培养皿，上皮面朝下。
轻轻摇动组织块，使其接触培养皿底壁。
应使表皮层附着在培养皿上，以便用手术镊彻底分离真皮。
除去真皮片。
9. 将表皮片移入盛有5 ml 0.02% EDTA （0.7 mmol/L）的15 ml 离心管。
注意将表皮片放入EDTA 液，不要贴在离心管壁上。
10. 轻轻摇晃离心管，使表皮片分散成单细胞。
11. 离心（350 g，5 min），然后吸去上清液。
12. 用MHSM 混悬细胞。
13. 用血细胞计数板计数细胞，然后在35 mm 培养皿用2 ml 含有5 % FBS 的MHSM 孵育细胞，细胞密度为1×106个（约2×104~4×104 个黑素细胞）。
FBS 促进细胞贴壁。
14. 用含有生长因子和牛垂体提取物的MHSM 换液，每周2 次。
第3~30 天15. 培养24 h 后，培养的细胞中含有原代角质形成细胞和散在的黑素细胞。
角质形成细胞在几天后停止增殖，角质形成细胞克隆在第2 周浮起。
第2 周末，只剩有黑素细胞。
在大多数情况下，细胞在2~4 周内生长接近汇合，此时准备传代。
黑色素细胞培养方法黑色素细胞是一类具有黑色素合成能力的细胞，主要存在于皮肤、眼睛和内耳等组织中。
研究黑色素细胞在生理和病理过程中的作用对于了解皮肤色素变化、黑色素瘤的发生机制以及开发相关药物具有重要意义。
因此，黑色素细胞的培养方法成为研究人员关注的焦点之一。
一、黑色素细胞的来源黑色素细胞可以来源于多个渠道，主要包括：1. 人体组织中的黑色素细胞：从人体皮肤、眼睛以及其他含有黑色素细胞的组织中获取。
2. 原代培养：从新鲜组织中分离黑色素细胞，进行原代培养，获得纯化的黑色素细胞。
3. 细胞系：已建立的黑色素细胞细胞系，如SK-MEL-28、A375等。
二、黑色素细胞的培养基选择黑色素细胞的培养基应当提供适宜的营养物质和环境条件，以维持细胞的正常生长和功能表达。
常用的黑色素细胞培养基成分包括：1. 基础培养基：如DMEM、MEM等，提供细胞生长所需的营养物质和能量。
2. 补充物质：如胎牛血清、细胞生长因子等，可以促进细胞增殖和分化。
3. 抗生素：如青霉素、链霉素等，用于防止细菌和真菌污染。
三、黑色素细胞的分离与培养1. 组织分离：从人体组织中分离黑色素细胞的方法有多种，如酶消化法、机械分离法等。
其中，酶消化法是常用的黑色素细胞分离方法，通过酶的作用，将组织中的细胞分散为单细胞悬浮液。
2. 细胞培养：将分离得到的黑色素细胞接种于预先制备好的培养基中，放置于恒温培养箱中，提供适宜的温度、湿度和CO2浓度等条件进行培养。
初始培养过程中，可以添加生长因子和血清等促进细胞增殖和分化。
四、黑色素细胞的鉴定与纯化1. 形态学鉴定：利用显微镜观察黑色素细胞的形态特征，如细胞形状、大小、色素颗粒分布等。
2. 免疫细胞化学鉴定：通过染色技术检测黑色素细胞特异性标记物，如Melan-A、TYR等。
3. 流式细胞术：利用流式细胞仪检测黑色素细胞表面标记物的表达情况，如CD117、CD166等。
4. 纯化方法：通过细胞培养和细胞分选技术，如细胞贴壁法、免疫磁珠法等，可获得纯化的黑色素细胞。
不同纯度高良姜素对A375—HaCaT共培养模型中黑素细胞增殖及黑素合成的影响作者：彭晓明霍仕霞赵萍萍等来源：《中国中医药信息》2014年第01期摘要：目的研究不同纯度高良姜素对人黑色素瘤细胞-人永生化角质形成细胞（A375-HaCaT）共培养模型中黑素细胞增殖及黑素合成的影响。
方法利用Transwell技术建立A375-HaCaT共培养体系，以0.1、0.5、1.0、5.0、10 μg/mL纯度为70%和90%的高良姜素作用于共培养模型。
采用MTT比色法检测细胞增殖，NaOH裂解法测定黑素含量，多巴氧化法测定酪氨酸酶活性，ELISA法检测HaCaT细胞因子干细胞生长因子（SCF）、内皮素（ET）-1的表达。
结果 A375-HaCaT共培养模型中的A375细胞生长良好，0.1、0.5、1.0、5.0、10 μg/mL纯度为70%和90%的高良姜素对共培养体系中的A375细胞增殖、酪氨酸酶活性及黑素合成均具有上调作用。
各纯度高良姜素浓度≥0.5 μg/mL时，能够提高HaCaT细胞中的ET-1和SCF等细胞因子的表达水平，且纯度70%的高良姜素作用强度优于90%的高良姜素。
结论高良姜素能显著促进A375-HaCaT共培养模型中A375的细胞增殖及黑素合成，其作用机制可能与高良姜素上调HaCaT细胞中的ET-1和SCF等细胞因子的表达水平有关。
关键词：高良姜素；黑色素瘤细胞；角质形成细胞；共培养模型；细胞增殖；黑素；内皮素白癜风是一种色素障碍性疾病，表现为皮肤脱色而影响美容。
由于该病多发于皮肤暴露部位，常给患者带来巨大的心理压力，故一直是皮肤科领域的研究热点。
维吾尔医在治疗白癜风方面拥有丰富的诊疗经验。
高良姜是维医治疗白癜风常用药驱白巴布期片中的一味主药，以往药理学研究表明，该药具有胃肠道调节作用、平滑肌解痉挛作用、免疫调节作用、抗炎、抗病毒、抗氧化、抗癌等多种药理活性[1]。
近年来，本课题组通过体内外药效筛选模型确定高良姜总黄酮对白癜风具有良好治疗作用[2]。
黑色素细胞培植术原理一、黑色素细胞到底是什么？说到黑色素细胞，大家第一反应可能是，“嗯，那不就是皮肤上那些让我们看起来更有色彩的东西吗？”对的没错！黑色素细胞，简单来说，就是负责生产黑色素的“工厂”。
咱们的皮肤、眼睛、头发颜色，多少都是它们的“杰作”呀。
它们可不是随便产生的，黑色素其实是为了保护咱们免受紫外线的伤害。
如果没有这些细胞，暴晒太阳的时候，我们的皮肤就直接变成“红烧”状态了。
而黑色素细胞培植术嘛，就是从“黑色素工厂”出发，试图通过一种科学方法，重新培养出新的黑色素细胞，弥补因疾病或其他原因导致黑色素细胞缺失的情况。
就像补充油漆一样，刷上去不就能恢复原来的颜色了吗？不过呢，这个过程可不是“轻轻松松、拍拍手”的事，涉及的技术和原理还是挺复杂的。
现在，让我们来一起聊聊这个话题。
二、黑色素细胞培植术到底是怎么回事？其实黑色素细胞培植术简单来说，就是通过外科手术，将患者皮肤中健全的黑色素细胞提取出来，放到一些合适的培养环境中，再培养一定的时间，等到黑色素细胞长得足够多，医生就会把这些细胞重新植入到患者需要恢复的区域。
这就像“种树”一样，先挑选合适的土壤，再种上有活力的“树苗”，然后等它们慢慢长大、扎根，最后为整个“花园”增添颜色。
说起来容易，做起来就不简单了。
医生需要从患者的某个部位提取一小块皮肤组织。
这块皮肤组织里含有黑色素细胞，它们是培养“母体”。
拿到这块皮肤后，医生就会在显微镜下进行处理，提取出里面的黑色素细胞。
黑色素细胞被放在专门的培养液中，经过一段时间的培养，这些细胞就会在实验室里逐渐增殖，最终达到足够的数量。
听起来有点像是“细胞的培训班”，它们在这里努力工作，等待“毕业”后再回到患者体内。
等这些小小的细胞准备好之后，医生就会小心翼翼地将它们重新植入患者皮肤缺少黑色素的地方。
你要知道，培养细胞不是随便一弄就行的，这可是一项需要耐心和精准的工作。
只要黑色素细胞在新的环境中扎根，它们就会重新开始分泌黑色素，渐渐恢复皮肤原本的颜色。
论高中生物色素的提取和分离实验教学改进策略摘要以“色素的提取和分离”实验为研究对象，就该实验的改进策略进行研究。
关键词高中生物；色素提取；色素分离；实验中图分类号：G633.91 文献标识码：B文章编号：1671-489X（2016）09-0149-021 前言“色素的提取和分离”是高中生物实验教学的一个内容，其旨在使学生通过观察和实验操作来初步了解和掌握叶绿体中色素的提取与分离方法，引导学生将高中生物教材与实践现象二者有效地联系起来，以充分培养学生的分析、探究和概括能力。
但是教材中该部分的方法比较烦琐，操作起来麻烦，学生实际的学习效果不是非常理想，因此有必要对该实验的过程、方法、实施策略进行研究，加以改进。
2 生物教材中实验存在的不足研磨物量不合理在色素提取的过程中，如果学生所加入的研磨二氧化硅和碳酸钙含量不合理，那么就会影响色素提取量。
比如，过多的研磨量会致使菜叶被过度磨损而降低过滤后的滤液量，或者沾在试管上的色素提取液比较多，实际毛细吸管实际吸取的量却非常有限。
提取液二次加入问题在色素提取的时候，部分学生在运用二氧化硅和碳酸钙研磨绿叶过程中再次加入提取液时相应会得到更多的提取液，但同时制取到的色素提取液浓度亦会比较低，进而会影响色素层析的效果。
毛细吸管画滤线问题实验研究表明，学生在用毛细吸管画滤线的过程中很难做到教材中所要求的又细又平。
一节生物实验课开展下来，有大量的毛细吸管会出现损坏的问题，如果没有大量的毛细吸管来替换，那么就无法继续进行开展画滤线操作，同时滤纸也很容易被毛细吸管所划破，学生很难绘出又细又平的绿线，学生绘出的铝箱可能相互交叠或者宽窄不均匀，进而影响后续色素分离实验的效果。
滤纸长度不够实验过程中常因所用的滤纸长度不够，加之试管中层析液比较少，使滤纸无法有效地触碰到层析液。
如果通过增加层析液的量来使滤纸触碰层析液，却也同样可能使滤液细线触碰到层析液，进而影响实验的效果。
3 生物教材中实验改进的主要步骤绿叶中色素的提取首先，相关实验人员需要称取重量为3 g的菠菜叶片，将其剪碎并放入到研钵中；然后在研钵中加入约五分之一匙的碳酸钙和二氧化硅研磨剂以及5 ml 的无水乙醇，并进行快速、充分的研磨操作。
生物黑色素的制备及其应用研究自从黑色素被人们发现以来，就引起了广泛关注。
作为一种天然的色素，黑色素在医学、化妆品、食品等领域都有着广泛的应用。
然而，传统的人工制备方法无法满足高质量和高产量的要求。
因此，越来越多的研究者开始从生物神经过程中获得黑色素，并应用于各个领域。
一、黑色素的生物合成黑色素的生物合成是复杂的生物神经过程。
在体内，黑色素是由酪氨酸通过多个酶的催化作用合成而来。
首先，酪氨酸酶将酪氨酸转化为多巴醌。
随后，多巴醌蛋白质(Tyrp1)和酪氨酸酶Tyr将多巴醌转化为黑色素前体分子DHI(Dopachrome)。
最后，DHI酶将DHI转化为黑色素。
其中，酪氨酸酶、Tyrp1和DHI酶都是黑色素合成的关键酶，它们的调节能够影响黑色素的产生和质量。
二、生物黑色素的制备目前，生物黑色素的制备主要分为两类，一种是从动物、植物和微生物中提取黑色素，另一种是利用细胞培养技术进行黑色素生产。
1. 从生物中提取黑色素从生物中提取黑色素是传统的黑色素制备方法之一。
动物如章鱼、虾、蝎子等都能够产生黑色素，而黑豆、苦瓜等植物也含有相应的黑色素。
微生物如真菌、酵母等也能够生产黑色素。
通过对这些生物进行提取和纯化，可以获得高质量的黑色素。
2. 利用细胞培养技术生产黑色素利用细胞培养技术生产黑色素是近年来新兴的黑色素制备方法之一。
利用基因工程技术，将黑色素合成关键酶（酪氨酸酶、Tyrp1和DHI酶）导入细胞中，通过代谢调节和优化培养条件，实现黑色素的高产。
三、生物黑色素的应用生物黑色素在医学、化妆品、食品等领域都有着广泛的应用。
1. 医学领域黑色素在医学中具有重要的临床价值。
它能够吸收紫外线，起到光防护的作用，防止光损伤造成的DNA变异和细胞死亡。
此外，黑色素还能够促进伤口愈合、保持皮肤弹性、防止色素沉着等。
2. 化妆品领域黑色素已经成为化妆品中的关键成分之一。
它能够抑制黑色素的形成和沉淀，调节新陈代谢，助力皮肤抵御外界压力和环境污染，让肌肤更加健康、年轻和光彩。
一种高效分离和培养人原代黑色素细胞的方法与流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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高纯度黑色素细胞培养方法的改进刘源;金岩;王新文;赵宇【期刊名称】《牙体牙髓牙周病学杂志》【年(卷),期】2003(013)001【摘要】目的:探讨如何以简便快捷的方法获得大量生长状态良好的高纯度黑色素细胞.方法:以包皮组织作为细胞来源,用消化法获得表皮细胞悬液,用本实验室设计的方法对细胞进行纯化,然后用两种不同培养基MC1、MC2培养细胞,Dopa染色和透射电镜鉴定细胞来源,通过MTT和流式细胞仪分析观察细胞的生长状态.结果:用本实验室的纯化方法获得的黑色素细胞中未见角朊细胞和成纤维细胞污染,MTT和流式细胞仪检测结果显示用MC2培养的黑色素细胞处于旺盛的增殖状态,明显高于MC1培养的黑色素细胞.结论:结果表明本实验方法可以获得大量处于良好生长状态的高纯度黑色素细胞.【总页数】3页(P21-23)【作者】刘源;金岩;王新文;赵宇【作者单位】第四军医大学口腔医学院,陕西,西安,710032;第四军医大学口腔医学院,陕西,西安,710032;第四军医大学口腔医学院,陕西,西安,710032;第四军医大学口腔医学院,陕西,西安,710032【正文语种】中文【中图分类】R780.2【相关文献】1.一种高纯度和高活力的大鼠脑微血管内皮细胞的提取及原代培养方法 [J], 查雨锋;张顺;苏航;刘亭;傅晓钟;董永喜;王爱民;王永林2.高纯度少突胶质前体细胞改良培养方法的建立 [J], 王兴启;刘轩;杨丽华;戚大石;刘静;姚瑞芹3.一种高纯度小鼠原代脑微血管内皮细胞的分离培养方法 [J], 张作慧;陈晨;陈浩;崔桂云;花放4.一种高纯度小鼠原代脑微血管内皮细胞的分离培养方法 [J], 张作慧;陈晨;陈浩;崔桂云;花放;5.改良的高纯度人早孕绒毛膜滋养层细胞培养方法 [J], 陈莉娟;周浩;朱剑文;邹丽因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
收稿日期:2002-07-23;修回日期:2002-10-26作者简介:刘源(1974-),男,山东济南人。
博士生(导师:金岩),助教高纯度黑色素细胞培养方法的改进刘 源,金 岩,王新文,赵 宇(第四军医大学口腔医学院,陕西西安710032)[摘 要] 目的:探讨如何以简便快捷的方法获得大量生长状态良好的高纯度黑色素细胞。
方法:以包皮组织作为细胞来源,用消化法获得表皮细胞悬液,用本实验室设计的方法对细胞进行纯化,然后用两种不同培养基M C1、M C2培养细胞,Dopa 染色和透射电镜鉴定细胞来源,通过M T T 和流式细胞仪分析观察细胞的生长状态。
结果:用本实验室的纯化方法获得的黑色素细胞中未见角朊细胞和成纤维细胞污染,M T T 和流式细胞仪检测结果显示用M C2培养的黑色素细胞处于旺盛的增殖状态,明显高于M C1培养的黑色素细胞。
结论:结果表明本实验方法可以获得大量处于良好生长状态的高纯度黑色素细胞。
[关键词]皮肤;黑色素细胞;培养[中图号]R780.2 [文献标识码]A [文章编号]1005-2593(2003)01-0021-03[牙体牙髓牙周病学杂志,2003,13(1):21]Improvements in culturing skin melanocytesLIU Yuan ,JIN Yan ,WANG Xin -wen ,et al(College of S tomatology ,The Fourth Military Medical University ,X i ′an 710032,China )[A bstract ] AIM :To develop a rapid and reproducible method for the isolation of pure melanocy tes in good condi -tions from foreskin .METH ODS :T he melanocytes were isolated and purified by a method employed in our lab .Two different media MC1and M C2were used to culture the cells .T he biological conditions of the cells were examined by M T T detection and flowcy tometry (FCM )analysis .RESULTS :T he melanocy tes obtained by this method were free of keratinocytes and fi -broblasts contamination .And the cells maintained in M C2showed better proliferation abil ity than those cultured in MC1.C ONC LUSION :The pure melanocytes in good conditions can be attained rapidly by our method .[Key words ]skin ;melanocy te ;tissue culture[Chinese Journal of Conservative Dentistry ,2003,13(1):21] 黑色素细胞(melanocy te ,M C )位于表皮的基底层,与表皮细胞共同组成表皮黑素单位,其主要功能是产生黑素小体保护皮肤免受损害[1]。
关于黑色素细胞培养技术的探讨最早始于1957年,迄今为止已经建立了许多黑色素细胞的培养方法[2-4]。
但是如何在短时间内获得大量生长状态良好的高纯度黑色素细胞一直是众多学者关注的焦点。
本实验拟在细胞的培养方法上做一定的改进,从而以快捷的方法获得大量生长状态良好的高纯度黑色素细胞。
1 材料和方法1.1 材料青少年包皮环切术后包皮组织;DM EM 培养基(低糖型,GIBCO ),F12培养基(GIBCO ),谷氨酰胺(GIBCO ),K -SFM 角朊细胞培养基(GIBCO ),胎牛血清(GIBCO ),胰酶(Sigma ),Dispase (Sigma ),TPA (Sig ma ),IBMX (Sigma ),霍乱毒素(Sigma )。
1.2 方法1.2.1 培养液的配制M C1:参照司徒镇强等方法配制[5],DMEM 和F12各一份混合,加入100m L /L 胎牛血清,TPA·21·牙体牙髓牙周病学杂志(Chin J Conserv Dent )2003,13(1)DOI :10.15956/j .cn ki .chin .j .conserv .dent .2003.01.01185nmol/L,霍乱毒素2.5nmol/L,IBMX0.1 nmol/L,谷氨酰胺6nmol/L。
M C2:本实验室设计配制,以K-SFM为基础培养基,加入TPA10ng/mL,50mL/L胎牛血清。
1.2.2 黑色素细胞的分离纯化①取新生儿或青少年包皮环切术后包皮组织,处理前在750m L/L乙醇中浸泡1min;将包皮组织转入培养皿中,用加入抗生素的PBS清洗,用眼科剪和眼科镊去除皮下组织,将组织分切为2mm ×10mm,用1.2U/m L的Dispase4℃消化过夜。
②将表皮与真皮分离,收集表皮,2.5g/L胰酶消化10min,反复吹打以获得单细胞悬液,将细胞分为两份,用含100mL/L血清的DMEM培养基接种细胞,在37℃孵箱中放置1h,倾弃上清,加入角朊细胞培养液K-SFM培养3d,以抑制成纤维细胞的生长,然后将培养液分别更换为黑色素细胞培养液MC1和MC2,继续培养7d即可获得纯净的黑色素细胞。
③原代细胞长满70%～80%时,用2.5g/L 胰酶消化传代。
1.2.3 黑色素细胞的鉴定取第三代细胞做Dopa染色、透射电镜观察,同时结合细胞形态鉴定细胞来源。
1.2.4 M TT检测取第四代细胞,以4×103/m2的密度接种于96孔板。
培养3d后,每孔加入M TT(5g·L-1) 20μL,继续培养4h,吸弃上清,加入150μL DMSO振荡15min,用酶联免疫检测仪测定490nm 的A值。
组间进行统计学分析。
1.2.5 流式细胞仪分析取第四代细胞5×106,800r/min,离心5min,弃上清,用PBS洗两次,700m L/L乙醇固定,4℃过夜。
上机前离心去除乙醇,PBS洗两次,加入PI (溴化丙锭)染液1mL,4℃闭光染色30min,上机检测分析。
组间进行统计学分析。
2 结果2.1 黑色素细胞的生长和鉴定细胞接种4h后,即可见细胞贴壁伸展,第二天细胞呈典型的树突状,随培养时间的延长突起更加明显。
原代细胞培养10d后即可传代,此时细胞密集,形态呈长梭型,类似雪旺氏细胞,未见角朊细胞和成纤维细胞污染(图1,见彩插);Dopa染色可见细胞浆内阳性着色(黑色或灰色颗粒)(图2,见彩插),苏木精衬染未见阴性细胞;透射电镜显示细胞浆内有黑色素颗粒(图3,见彩插),此外在M C2组细胞中可见核分裂(图4,见彩插),显示细胞增殖旺盛,而在M C1组细胞中未见核分裂。
2.2 M T T检测如表1所示,MC2组细胞活力高于M C1组。
组间比较有统计学差异,P<0.05。
表1 M T T检测结果组别n A值M C1100.412±0.022M C2100.604±0.0242.3 流式细胞仪分析结果结果(表2)与M TT检测相符合,M C2组细胞增殖能力明显高于MC1组。
表2 流式细胞仪分析结果组别G1S G2MPrI(S+G2M) M C180.811.87.4M C270.717.411.93 讨论黑素的合成代谢被认为与皮肤色素沉着病、恶性黑色素瘤和Parkinson′s病等密切相关[6]。
而黑色素细胞的培养在研究正常及病变组织中黑素合成代谢的作用具有重要意义。
虽然黑色素细胞的培养可以追溯到50年代,但是直到80年代才真正建立了可靠的黑色素细胞培养方法[7]。
由于黑色素细胞仅占表皮细胞数量的3～7%,因此,如何在培养过程中去除角朊细胞是黑色素细胞培养的重点。
采用既能促进黑色素细胞生长又能抑制角朊细胞的TPA (12-o-tetradecanoyl phorbol-13-ac etate)和霍乱毒素基本上解决了上述问题[8]。
为了促进细胞增殖,大多数黑色素细胞培养液中都加入了一定量的血清,所以即使在培养过程中混入了极少量的成纤维细胞也会导致培养的失败。
而即使是最有经验的细胞培养者也很难保证无成纤维细胞的混杂[9]。
一旦发生了成纤维细胞的混杂,大多数学者采用加入G418等有丝分裂细胞抑制剂的方法以去除成纤维细胞[10]。
此外也有学者用降低钙离子浓度或机械刮除等方法,但是大多数方法在抑制成纤维细胞的同时也影响了黑色素细胞的生长。
本实验室在前期培养角朊细胞的时候发现,黑色素细胞可以在角朊细胞培养液中短期存活并且状态良好,于是根据文献资料[8]以及预实验结果设计了前面所述黑色素细胞培养液,在促进黑色素细胞保持高增殖活力的同时大大减少了TPA的用量。
传统方法所培养的原代黑色素细胞大约需要3～4周的时间才可以长满传代[5],而本实验室所培养的原代细胞一般在培养8～10d后即可传代,同时透射电镜、M TT和流式细胞仪分析均显示细胞生长状态良好。
角朊细胞培养液可以抑制成纤维细胞的增长而在短期内对黑色素细胞无显著影响,而本实验室所配制的黑色素细胞培养液可以抑制角朊细胞的生长,所以将两种培养液的优点结合,设计了前面所述的纯化方法。
同时根据黑色素细胞在有血清培养基中贴壁快的特点,先用普通含血清DM EM 培养基接种细胞,待大多数黑色素细胞贴壁后,再更换培养液,而此时大部分角朊细胞尚未贴壁。
实验结果显示,用上述方法可以获得100%纯度的黑色素细胞。
黑色素细胞的培养在皮肤色素疾病、恶性黑色素瘤等的研究和治疗中具有重要意义,本实验的研究结果为简便快捷获得大量生长状态良好的高纯度黑色素细胞提供了重要的实验依据。
参考文献:[1]Battyani Z,Xerri L,Hassoun J,et al.Ty rosinase gene expres-s ion in human tiss ues[J].Pig ment Cell Res,1993,6(6):400 [2]Hu F,Staricco RJ,Pinkus H,et a l.Human melanocytes in tis-s ue culture[J].J In vest Der matol,1957,28:15[3]Wilkins LM,Szabo G.The establ ishment of pure mammalianepidermal melanocyte cultures th rough grow th in high levels ofmycostatin[J].Arch Der matol Res,1981,270(4):483[4]M ayer TC.T he control of emb ryonic pigment cell prol iferationin culture by cyclic AM P[J].Dev B iol,1982,94(2):509 [5]司徒镇强,吴军正,主编.细胞培养[M].西安:世界图书出版西安公司,1996.124[6]Berstein LM.The effect of phys iological doses of thyroxine onthe level of cyclic adenosine-3′,5′-monophos phate in pitu-itary and anterior hypothalamus of male rats of different age[J].En dokrinologie,1980,75(1):29[7]Navarro FA,S toner M L,Lee HB,et a l.M elanocyte repopula-tion in full-thicknes s w ounds using a cell spray apparatus[J].JB urn Care Rehabil,2001,22(1):41[8]Deveci M,Gilmont RR,Terashi H,et al.M elanocyte-condi-tioned medium stimulates w hile melanocyte/keratinocyte con-tact inhibits keratinocy te proliferation[J].J Bur n Care Reha-bil,2001,22(1):9[9]Graeven U,Herlyn M.In vitro grow th patterns of normal hu-man melanocytes and melanocytes from different stages ofmelanoma progression[J].J Im munother,1992,12(3):199 [10]Hs u M Y,W heelock M J,Johnson KR,et al.Shifts in cadherinprofiles between human normal melanocytes and mel anomas[J].J I nvestig Dermatol S ym p Proc,1996,1(2):188掌跖角化—牙周破坏综合征1例尹晓敏,刘 虹,彭解英(中南大学湘雅医院,湖南长沙410008)掌跖角化—牙周破坏综合征又名Papillon-Lefevre综合征。
