大鼠肺成纤维细胞的原代培养和鉴定

大鼠肺成纤维细胞编号名称规格北京派瑞金GK1006大鼠肺成纤维细胞5×105cells/瓶为能尽快开展实验，派瑞金发货的原代细胞均处于对数生长期，且每次发货为汇合率达到70%的细胞，收到细胞后即可开展实验。

派瑞金提供的大鼠肺成纤维细胞取自新鲜的组织，按照标准操作流程分离培养。

研发的大鼠肺成纤维细胞完全培养基能提供细胞最佳的生长条件，降低杂细胞污染，保证不同批次间细胞质量的稳定。

同时，派瑞金还建立了严格的细胞鉴定流程，所提供的原代细胞均需经过细胞类型特异性标记物、细胞形态学等检测，保证细胞纯度在90%以上；同时也需经过微生物检测，保证不含有HIV、HBV、HCV、支原体、真菌及其他类型的细菌。

大鼠肺成纤维细胞简介:1、名称：大鼠肺成纤维细胞（Rat Lung Fibroblasts Cells）2、组织来源：SD大鼠肺组织3、规格：5×105cells/25cm2培养瓶4、细胞简介：大鼠肺成纤维细胞分离自SD大鼠肺组织，多呈长梭形，具有突起，细胞胞体较大，胞质弱嗜碱性，胞核较大呈椭圆形，染色质疏松色浅，核仁明显。

刚分离的肺成纤维细胞呈圆形，较亮，培养40min左右贴壁，12～24h左右伸展，36～48h进入对数生长期，分离纯化3d后接近融合，并彼此连接成网状。

肺成纤维细胞在生理条件下的主要功能包括：构造和维持肺器官的正常形态，合成和释放细胞外基质，以及组织损伤后及时大量聚集修复损伤组织。

本公司生产的大鼠肺成纤维细胞采用混合酶消化而来，细胞总量约为5×105cells/瓶，Fibronectin免疫荧光鉴定细胞纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

5、培养基信息：1）培养基类型：DMEM高糖2）添加因子：10%FBS、Penicillin、Streptomycin等大鼠肺成纤维细胞使用方法:收到细胞后，请按照以下方法进行操作。

*基金项目:内蒙古医学院科技研究重大项目资助(NY2005ZD007)收稿日期:2008 01 28;修回日期:2009 04 13作者简介:杨敬平(1964 ),男,河南唐河人,医学硕士,主要从事呼吸与危重症医学研究。

通讯作者,E mai l:yangron@.c n原代培养鼠肺成纤维细胞中 平滑肌肌动蛋白的表达*杨敬平,孙德俊 ,李姝楠,高 丽(内蒙古医学院第三附属医院呼吸与危重症科,内蒙古包头014010)摘要 目的:观察原代培养大鼠肺成纤维细胞(FB)中 平滑肌肌动蛋白( SMA )的表达情况。

方法:24只雌性Wistar 大鼠,随机分为正常组和模型组,气管内注入博莱霉素A2(B LM A2)(5mg/kg)建立大鼠肺间质纤维化(PF)模型,正常组气管内注入等量生理盐水。

实验周期第28d 腹主动脉放血法处死,肺组织HE 染色和透射电镜检查。

体外原代培养FB,传3~5代后流式细胞术检测 S MA 表达的细胞阳性率。

结果:HE 染色28d 模型组大片肺泡结构破坏,肺泡腔消失,有成纤维细胞灶形成,电镜观察肺组织超微结构发生改变,肺间质中可见胞浆内有微丝样结构的MF 。

流式细胞分析结果:正常组 SMA 表达的细胞阳性率为95.5% 4.68%,模型组 S MA 表达的细胞阳性率为96.2% 2.14%,与正常组相比P >0.05。

结论:原代培养的大鼠肺FB 中 SMA 的阳性表达率正常组和模型组均显著增高,体外培养的大鼠肺FB 传3~5代后可能有部分已经转化为肌纤维母细胞(MF)。

关键词: S MA;成纤维细胞;原代培养;表型转化中图分类号:R563 文献标识码:A 文章编号:1000 6834(2009)03 339 05成纤维细胞(fibroblasts,FB),尤其是肌纤维母细胞(myofibroblasts,MF)的增殖和转化在肺纤维化中的致病作用是目前肺纤维化的研究热点之一,但是MF 具体如何转化以及转化的量的多少仍然是有争议的。

胎鼠肺成纤维细胞原代培养摘要：目的改良胎鼠肺成纤维细胞的培养方法方法：取19 d胎龄129孕鼠,开胸取出胎肺,用胰酶稍微消化,再进行组织悬液贴壁培养。

传代的肺成纤维细胞用免疫组化检测其vimentin和laminin的表达.结果24 h后镜下可见组织块周边有长梭型细胞爬出，48 h后生长迅速，3 d接近融合。

传代后杂细胞基本去除，5代后细胞的增殖能力逐渐下降。

结论：胰酶轻度消化后组织悬液贴壁法是一种可靠快速的肺成纤维细胞分离纯化培养方法.肺成纤维细胞的体外培养（Lung fibroblasti，LF）的体外培养为研究肺的发育，肺纤维化的发病机制以及其他肺部疾病的研究提供了重要的细胞模型。

而胎肺成纤维细胞的培养，对于早产儿肺部疾病、肺发育以及成纤维细胞的异质性研究均有重要意义。

为此，本文改良了以前我们所学过的小鼠肺原代培养技术，建立了一种胎鼠肺成纤维细胞分离纯化、培养的可靠简便方法。

一、材料与方法用超纯水溶解的H-DMEM的培养基（Gibo），补加NaHCO3 2g/L 及HEPES 2g/L,过滤除菌。

在-20℃以下保存备用，使用前添加15％新生牛血清（NBS）、青霉素100IU/ml、链霉素100ug/ml。

消化液：0.25％胰蛋白酶，抗vimentin(波形但蛋白)和laminin(层粘蛋白)。

二、实验动物年龄为7-8周的性成熟129小鼠，雌雄鼠按3:1同笼过夜，次日晨检查见雌鼠阴道阴栓针为孕0.5d。

孕期满18d(足月为22天)时，进行剖宫产术取出胎鼠。

三、肺成纤维细胞分离培养方法孕鼠断头处死小鼠，无菌术开胸，取出胎鼠，置于放有PBS的无菌培养皿中，取出胎肺，反复用PBS冲洗至肺组织发白，用手术剪将肺组织剪碎（小于1mm3）,移至10mL离心管中，静置5分钟后，尽量把PBS吸出，然后按1:1比例加入0.25％胰蛋白酶（37℃预温），用吸管反复吹打1分钟，加入含15％新生牛血清（NBS）的H-DMEM 的培养液终止消化，用吸管吹打均匀，1000r/min离心3min,弃上清，再加入少量15％新生牛血清（NBS）的H-DMEM的培养液悬浮组织块，加入培养液不飘起组织块为宜。

大鼠肺成纤维细胞原代提取及培养实验具体步骤及方法大鼠肺成纤维细胞原代提取及培养实验具体步骤及方法将大鼠的肺成纤维细胞从机体中取出，经胰酶、螯合剂（常用EDTA）处理，分散成单细胞，置合适的生长培养基培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖。

一、实验材料准备1. 动物出生后1-4天的Wistar乳鼠1只。

2. 试剂PBS、培养液(Hyclone的低糖DMEM，含Hyclone的10%新生牛血清、100 U/ml 青链霉素、1%明胶PBS、0.25%胰酶(含EDTA，GIBCO)，碘酒和酒精绵球。

3. 器械眼科直剪2把、眼科弯剪2把、眼科直镊2把、眼科弯镊2把、玻璃平皿3套，25 cm2塑料培养瓶(Costar)。

二、具体操作1. 明胶包被培养瓶过夜(准备2-3个)，取出明胶，用2 ml培养液冲洗培养瓶一遍，置于超净台中。

2. 解剖取肺：将乳鼠在酒精中浸泡后取出，转移至超净台上的玻璃培养皿中，用碘酒消毒胸部皮肤，再用酒精棉球脱碘。

左手捏紧乳鼠颈背部皮肤以充分展露胸部，右手以眼科直剪剪开皮肤，充分撕拉开，再用酒精棉球消毒，继而以另一把眼科弯剪沿胸骨柄左下缘向上剪开肋骨，然后在切口中间横剪胸骨。

用眼科镊取出肺，置于盛有PBS(含有200U/ml青链霉素)的玻璃平皿中，冲洗去血。

3. 用眼科剪将肺分成几个肺叶，用镊子去除周边的血凝块及纤维组织，用眼科剪剪去肺门处的支气管和血管，再用含有双抗的PBS冲洗1遍。

4. 用眼科弯剪将肺组织剪碎成1 mm3大小，加入含有双抗的PBS，将肺组织块吹打开，静置15 min后，更换新的PBS。

5. 用200 ul微量加样器(最好是超净台中专用的，临用时用酒精绵球好好擦拭枪柄)取200 ul加样枪头一个，剪去尖，在酒精灯上用火焰烧弯。

用枪头吸取组织块接种于培养瓶中，每瓶20-25块左右，每小块间距0.5 cm左右。

组织块放置好后，轻轻将培养瓶翻转，让瓶底朝上，向瓶内加入2 ml左右的培养液，盖好瓶盖，将培养瓶倾斜放置在温箱中，干贴壁2-4 h后，将培养瓶慢慢翻转平放，继续静置培养。

原代成纤维细胞鉴定原代成纤维细胞的鉴定是一个关键步骤，用于确保细胞的质量和纯度，并确认其是否适合进行后续的实验研究。

以下是关于原代成纤维细胞鉴定的详细介绍。

首先，对原代成纤维细胞的形态学观察是鉴定的基础。

成纤维细胞具有典型的形态特征，如梭形或不规则形，胞质突起，核大且深染。

在显微镜下观察细胞的形态，可以初步判断是否为成纤维细胞。

其次，通过免疫荧光技术进行鉴定。

成纤维细胞通常表达某些特定的细胞表面抗原，如纤维连接蛋白（Fn）和波形蛋白（Vimentin）。

利用这些抗原的特异性抗体进行荧光染色，如果细胞呈现绿色荧光，说明它们是成纤维细胞。

此外，利用流式细胞术进行鉴定。

通过流式细胞仪分析细胞表面的抗原标记，可以准确地鉴定细胞的类型。

例如，通过检测Fn和Vimentin的表达，可以确认细胞的成纤维细胞特性。

在进行原代成纤维细胞鉴定时，了解细胞的来源和背景信息也非常重要。

例如，取自哪种组织、在何种条件下培养等，这些信息有助于更准确地判断细胞的性质。

综上所述，原代成纤维细胞的鉴定需要综合考虑多种方法和技术手段，以确保鉴定的准确性和可靠性。

通过形态学观察、免疫荧光技术和流式细胞术等方法，可以有效地鉴定原代成纤维细胞，并确保其质量和纯度。

最后，值得一提的是，随着生物技术的不断发展，对于原代成纤维细胞的鉴定也在不断更新和完善。

新的鉴定方法和技术不断涌现，使得对原代成纤维细胞的鉴定更加准确和可靠。

因此，在进行原代成纤维细胞鉴定时，建议查阅最新的文献资料和实验指南，以获取最新的鉴定方法和标准。

综上所述，原代成纤维细胞的鉴定是一个重要的步骤，需要综合考虑多种方法和技术手段。

通过准确的鉴定，可以确保原代成纤维细胞的质量和纯度，为后续的实验研究提供可靠的细胞来源。

同时，随着技术的不断发展，对于原代成纤维细胞的鉴定也在不断更新和完善，建议查阅最新的文献资料和实验指南，以获取最新的鉴定方法和标准。

成年小鼠肺成纤维细胞分离纯化及原代培养
邓佳慧;肖军花;王嘉陵
【期刊名称】《基础医学与临床》
【年(卷),期】2012(032)006
【总页数】2页(P713-714)
【作者】邓佳慧;肖军花;王嘉陵
【作者单位】华中科技大学同济医学院基础医学院药理学系,武汉430030;华中科技大学同济医学院基础医学院药理学系,武汉430030;华中科技大学同济医学院基础医学院药理学系,武汉430030
【正文语种】中文
【中图分类】R329.2;R322.35
【相关文献】
1.SD大鼠肺成纤维细胞的原代培养及分离纯化 [J], 何爱明;李晓晖;李岱
2.Blebbistatin在成年小鼠心肌细胞原代培养以及GFP基因转导中的作用及其机制 [J], 赵玫;戚其学;何蓉;张大庆;傅鹏;杨川;孙英贤;赵传胜;白小涓
3.成年小鼠原代皮肤成纤维细胞的分离培养及其生物学特性 [J], 陈雪梅;薛斯亮;吴思思
4.成年小鼠背部皮肤角质形成细胞的原代培养及其与乳鼠角质形成细胞的对比性研究 [J], 邓颖; 王雪儿; 张琳
5.小鼠胎肺Ⅲ型上皮细胞的分离纯化及原代培养 [J], 张明凤;张彦定;王昕;王虹;张龙斌
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1、大鼠骨髓来源肥大细胞原代培养并鉴定：脱颈法处死SD大鼠（体重约200g），75%酒精浸泡消毒3min。

转入超净工作台内操作，剪开后肢皮肤，去除腿部肌肉，暴露出股骨，尽可能将股骨外部肌肉剥离干净，剪下股骨。

剪去股骨两端的股骨头，使用5ml注射器吸取RPMI 1640基础培养基后将骨髓吹打出来，吹打过程中尽可能将骨髓冲洗干净。

使用巴氏吸管将骨髓吹打成单细胞悬液，1000rmp/min离心5min收集细胞如发现收集的细胞中有大量红细胞时需使用红细胞裂解液处理。

使用肥大细胞专用培养基重悬细胞，接种至T25瓶内培养。

培养过程中每2-3天换液一次，当发现有细胞变圆脱落时，收集脱落细胞至新的T25瓶内诱导培养，培养四周时肥大细胞诱导成熟，取成熟的肥大细胞进行甲苯胺蓝染色鉴定；取脱落细胞培养一周、二周、三周、四周的细胞培养上清进行组胺含量检测。

2、小鼠骨髓来源肥大细胞原代培养与鉴定：小鼠经脱颈椎处死，75%酒精消毒后，取完整股骨，用1mL注射器吸取无菌PBS从股骨一端刺入，将骨髓细胞洗出，直到骨髓腔变白。

离心收集细胞，加入3mL红细胞裂解液，室温裂解3min之后，用PBS漂洗2次。

采用现配的原代细胞培养工作液（含青、链霉素各1000U/mL，10% FBS，IL-3 10 ng/mL，SCF 10ng/mL的RPMI-1640培养基培养液）将细胞重悬，按照106个/mL接种于六孔板中，每孔加3mL培养液，置于37℃，5% CO2的培养箱中培养，每7d 将悬浮细胞按照106个/mL转移到新的培养板中，继续培养，4-6周细胞分化成熟。

四周后收集悬浮细胞，部分细胞用于流式检测纯度，部分用含10% FBS的RPMI-1640培养基重新接板。

纯度检测：向诱导分化细胞中按1：200加入肥大细胞表面标志物APC-CD117 ，FITC- FcεRIα，4℃孵育60min ，无菌PBS 漂洗3次，流式检测肥大细胞纯度。

（SCF：Stem cell factor，干细胞因子；又称肥大细胞生长因子MGF）3、大鼠腹腔肥大细胞的分离与培养：选用体重220-250g的SD大鼠。