小鼠肾素Renin酶联免疫检测

BB 0×100%百分吸光度值（%）=酶联免疫吸附法（ELISA ）检测猪肉中盐酸克伦特罗薛金英（山东省诸城市畜牧兽医管理局山东诸城262200）盐酸克伦特罗（俗称瘦肉精）为一种人工合成的β-肾上腺素兴奋剂，具有扩张支气管的作用，常用来防治哮喘、肺气肿等肺部疾病。

当其应用量达到治疗量的5～10倍时，其有能量重分配作用，可使肌肉合成增加，脂肪沉积减少，因此俗称为“瘦肉精”。

在畜牧业生产中一些非法使用者将其作为一种和生长促进剂添加到动物饲料中，用以改善胴体的品质，同时也造成食品中盐酸克伦特罗（瘦肉精）的残留。

当人们食用盐酸克伦特罗残留的产品后会出现一系列的中毒症状。

动物源性食品药物残留问题逐渐引起人们的重视。

本法用于定量、定性检测猪肉中盐酸克伦特罗的残留。

1试验原理采用间接竞争ELISA 法，在微孔板上包被抗盐酸克伦特罗检测抗原，样品中的盐酸克伦特罗将和酶标板上的盐酸克伦特罗检测抗原竞争结合盐酸克伦特罗抗体，盐酸克伦特罗检测抗原结合的盐酸克伦特罗抗体再与同时加入的酶标二抗结合，洗涤后，用TMB 底物系统显色，微孔板吸光值与样品中盐酸克伦特罗含量成负相关，与标准曲线比较再乘以浓度比值即可得出盐酸克伦特罗在样品的实际含量。

2试验方法（稀释倍数为4倍）称取1.0g （±0.05g ）均质样品于50mL 聚苯乙烯离心管中，加入1mL 0.1M 盐酸，再加入2mL 提取工作液，充分振荡混匀5min ，4000rpm （20～25℃）离心10min 。

取1mL 上清液加入约25μL 1M 氢氧化钠调节pH 至6.5～7.5之间，充分振荡混匀，取50μL 用于分析。

如果上层中存在白色脂肪层，取样时应避开。

试剂准备：将10×浓缩洗涤液和蒸馏水（或去离子水）按1∶9充分混匀，即为1×洗涤液。

编号：将盐酸克伦特罗标准溶液和待测样品对应微孔按序编号，建议每个标准溶液和待测样品均做重复孔。

肾素（Renin）测定试剂盒
（化学发光法）
2. 性能指标
2.1外观
2.1.1试剂盒中各组分应齐全、完整、无泄漏，试剂盒（瓶）上包装标签应清晰、无磨损。

2.1.2试剂条中的磁微粒试剂摇匀后，应为均匀悬浊液，无明显凝集；其他液体试剂溶液组分应澄清，无悬浮物、无沉淀物、无絮状物。

2.1.3校准品、质控品为冻干品，呈块状固体，不起泡、不塌陷，复溶后应为清澈透明液体，无沉淀，无悬浮物，无絮状物。

2.2准确度
相对偏差应在±10%范围内。

2.3空白限
应不大于2pg/mL。

2.4重复性
批内变异系数CV应不大于10%。

2.5线性范围
试剂盒线性范围（2-500）pg/mL，在此线性范围内，相关系数r应≥0.9900。

2.6批间差
批间变异系数CV应不大于15%。

2.7校准品、质控品均一性
瓶内均一性≤8%，瓶间均一性≤5%。

2.8校准品赋值准确性
相对偏差应在±10%范围内。

2.9质控品赋值准确性
质控品测值在参考范围内。

真武汤调控神经体液系统对心力衰竭作用机制的研究进展吴文俊1,张赤道1,李 雪1,李 彬2,王永霞2,朱明军2摘要 综述真武汤治疗心力衰竭的神经体液机制,阐述其与改善心力衰竭预后药物的对应关系,并提出目前真武汤治疗心力衰竭研究还存在的一些不足及未来需加强的方面㊂真武汤是治疗胸痹㊁心痛的经方,经过检索大量文献发现临床运用真武汤治疗心力衰竭存在偏差㊂真武汤能通过多靶点㊁多途径的神经体液机制治疗心力衰竭㊂真武汤作用于交感神经,去甲肾上腺素(NE )水平降低;作用于肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS ),血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)和醛固酮(ALD )水平降低;作用于其他体液因子系统,一氧化氮(NO )和精氨酸加压素(AVP )水平降低㊂拮抗神经体液系统的过度激活是其作用于神经体液系统所产生的共同效应㊂从神经体液系统与其分泌影响心力衰竭进程因子的内在联系,阐明真武汤治疗心力衰竭的作用机制,与不同作用靶点改善心力衰竭的药物对比,以期使真武汤在临床中治疗心力衰竭更加精确㊂关键词 心力衰竭;胸痹心痛;真武汤;神经体液;机制d o i :10.12102/j.i s s n .1672-1349.2023.22.016 心力衰竭指各种原因导致心脏泵血功能受损,心排血量无法满足机体组织代谢需要,以体肺循环淤血,器官㊁组织灌注不足为临床表现的一组综合征㊂据调查,现在我国存在超过1100万例心力衰竭病人[1],美国有超过510万例心力衰竭病人[2]㊂受饮食习惯㊁情绪偏激㊁人口老龄化等因素的影响,心力衰竭患病率将不断增加㊂心力衰竭不利于病人的预后和良好的生活状态,其5年致死率高达50%[3-4]㊂在治疗上, 新四联 [血管紧张素受体脑啡肽酶抑制剂(ARNI )或血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI )/血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂(ARB )+钠-葡萄糖共转运蛋白2抑制剂(SGLT2i )+β受体阻滞剂+盐皮质激素受体拮抗剂(MRA )]是多版指南推荐的心力衰竭的首选用药,但目前国内西医药物多为单向靶点治疗,治疗效果不明显,对心力衰竭无基金项目 国家自然科学基金重点项目(No.82030120);国家自然科学基金面上项目(No.82074226)作者单位 1.河南中医药大学(郑州450000);2.河南中医药大学第一附属医院(郑州450000)通讯作者 朱明军,E -mail :*********************引用信息 吴文俊,张赤道,李雪,等.真武汤调控神经体液系统对心力衰竭作用机制的研究进展[J ].中西医结合心脑血管病杂志,2023,21(22):4153-4156.根治作用,且有一定的不良反应[5-8]和禁忌证,存在着明显的局限性㊂而中医经方的治疗可以避免很多的不良反应,再经过准确辨证后可以适用广泛的人群,中药还具有多靶点㊁多成分㊁多途径的优势[9]㊂真武汤可以从多个靶点㊁多个作用途径改善病人心力衰竭的临床症状,同时能提高病人生存质量[10],随着中医药的发展,中医界对运用中药治疗心力衰竭的研究越来越深入,对于提高病人的生活质量,改善身心健康以及减少住院次数,缩短住院时间等方面,中医治疗发挥着重大作用,同时也是未来治疗心力衰竭新的发展方向㊂1 心力衰竭发生的神经体液系统机制心力衰竭多由心肌损害和心脏前后负荷过重所致,如慢性心肌缺血㊁心肌梗死㊁高血压㊁慢性贫血等各种疾病使心功能障碍,心脏的收缩和舒张功能减退,导致心排血量下降,进而人体启动神经体液机制进行代偿,但最终神经体液机制的过度激活导致直接细胞凋亡,心室重塑,从而心泵衰竭㊂其中交感神经兴奋性增强,肾素-血管紧张素-醛固酮系统(renin -angiotensin -aldosterone system ,RAAS )过度激活以及其他体液因子的改变在心力衰竭进展中发挥主要作用㊂真武汤对神经体液系统作用机制及其与改善心力衰竭预后药物对应关系详见表1㊂表1真武汤对神经体液系统作用机制及其与改善心力衰竭预后药物的对应关系神经体液系统影响效应改善心力衰竭预后的药物交感神经抑制交感神经拮抗交感神经激活,降低血浆NE水平β受体阻滞剂RAAS抑制神经内分泌系统拮抗RAAS,降低血浆AngⅡ㊁ALD水平ACEI/ARB/MRA/ARNI 其他体液因子NO改善NO-sGC-cGMP通路刺激sGC活化,降低血浆NO水平sGC刺激剂AVP调节AVP-AVPR-AQP系统降低AVP水平,抑制AQP蛋白的表达托伐普坦注:NO为一氧化氮;sGC为可溶性鸟苷酸环化酶;cGMP为环磷酸鸟苷;AVP为血管升压素;AVPR为血管升压素受体;AQP为水通道蛋白;NE为去甲肾上腺素;AngⅡ为血管紧张素Ⅱ;ALD为醛固酮㊂1.1交感神经交感神经支配心脏,通过释放神经递质NE和心脏中相应的受体结合调控心脏㊂NE通过靶细胞膜腺能受体(adenergic receptors,AR)介导发挥其作用, AR分为α-AR和β-AR两种亚型㊂关于心肌的β肾上腺素能受体,主要为β1㊁β2,前者约占3/4,故β1与心脏关系最为密切㊂NE与β1受体结合使β受体构型产生改变,细胞内兴奋型G蛋白(stimulatory G protein, Gs)-腺苷酸环化酶系统被激活,发生信息传递,第二信使环磷酸腺苷产生,依靠L型钙通道的磷酸化作用使细胞膜对钙的通透性增大,导致钙内流增加,产生正性肌力效应㊂各种原因使交感神经NE释放与受体作用过程紊乱时均可致心力衰竭发生㊂当心脏排血量不足时,交感神经兴奋性增强,心脏交感神经末梢释放大量的NE,神经系统无法充分摄取,体内NE水平升高,进而诱发心肌细胞肥厚㊁凋亡和心脏重构[11],同时NE也可作用并激活β1受体,而长期的交感神经刺激使β-AR对NE的反应呈进行性减弱,晚期由于受体密度下调和受体与Gs的功能性失耦联而出现受体的减敏现象,导致心肌收缩和舒张功能下降[12],长期作用机制下可发生心力衰竭㊂1.2RAASRAAS为体内肾脏所产生的一种升压调节体系,主要作用是调节血压和水电解质平衡,维持人体内环境的相对稳定㊂正常生理状态下,肾素由肾小球入球动脉的球旁细胞分泌,从而使血管紧张素原转化为血管紧张素Ⅰ,再经转换酶生成AngⅡ㊂AngⅡ是参与RAAS作用过程的主要效应物质,结合AngⅡ受体,刺激肾上腺皮质分泌ALD,促进小动脉平滑肌收缩,在交感神经正反馈机制作用下使NE分泌增加,这些效应均可使血压升高,维持机体正常代谢㊂任何导致RAAS不能正常运行的疾病均可导致心力衰竭㊂心肌缺血时,心排血量降低,肾脏灌注不足,RAAS过度激活,肾素分泌增加,从而使血管紧张素转化酶(angiotensin converting enzyme,ACE)活性增高,AngⅡ生成增多,周围血管阻力增加,加重心脏后负荷,同时交感介质分泌增多,儿茶酚胺浓度增高,使醛固酮释放,引起水钠潴留,心脏前负荷增加[13]㊂RAAS过度激活情况下会加重心脏前后负荷,当超出代偿区间,心肌会逐渐肥厚,继而纤维化,心室重塑,导致心力衰竭㊂1.3其他体液因子NO由血管内皮细胞分泌,生理情况下血管内皮细胞可分泌内皮衍化舒张因子和内皮衍化收缩因子,调节血管舒缩㊂心力衰竭时,心肌细胞的诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)基因因氧化应激状态表达增加,合成大量NO,高浓度的NO产生大量cGMP,激活蛋白激酶G,阻断肌膜钙通道,深度抑制心肌收缩功能㊂同时NO还可以直接诱导细胞凋亡,通过与超氧化物的重组,生成过氧化亚硝酸盐,导致心肌细胞凋亡,引起心力衰竭㊂最新研究表明,敲除iNOS基因的小鼠左心室重构水平显著降低㊂这暗示高水平的NO可能促进心肌重构作用[14],导致心力衰竭的发生㊂另外NO还可以直接抑制ATP合成和电压敏感的钙离子通道,从而降低心肌的收缩性能[15-16]㊂AVP由垂体释放,是神经内分泌介质中的一种,具有抗利尿和促周围血管收缩作用,是心力衰竭过程中引起水钠潴留的关键物质[17]㊂心力衰竭时心房牵张感受器敏感性下降[18],无法抑制垂体释放AVP,从而使血浆AVP水平升高㊂AVP与V2受体结合,增加AQP2敏感性,水钠的重吸收增多,影响肾脏对水液代谢的处理能力[19],致水潴留增加,同时增加心脏负荷,心肌增厚,渐进性纤维化,导致心力衰竭㊂2真武汤治疗心力衰竭神经体液机制临床试验和动物实验证实真武汤在抗心力衰竭中发挥着多靶点㊁多途径的治疗作用㊂真武汤通过拮抗神经体液系统的过度激活,调节神经体液因子的分泌,减轻心脏的前后负荷,抑制心肌重塑,改善心肌的舒缩功能,从而发挥治疗心力衰竭的作用㊂2.1基于交感神经作用机制研究董志勇等[20]采用放射免疫法测定不同剂量的真武汤对心力衰竭大鼠血浆NE水平的影响,发现中高剂量的真武汤均可降低NE水平并呈剂量依赖性,随着浓度增加,降低NE水平增强;低剂量组虽能降低NE水平,但与模型组相比较差异无统计学意义,提示真武汤在10.5g/kg剂量下抑制交感神经过度激活的区间已达到饱和状态㊂表明真武汤在达到一定剂量时具有强有力调节心力衰竭大鼠交感神经内分泌的作用,达到改善心力衰竭的效果㊂经治疗后NE水平降低,可能与真武汤调节交感神经的兴奋性有关,进而改善β-AR对NE减敏状态,恢复心肌正常功能,治疗心力衰竭㊂2.2基于RAAS作用机制研究刘聪等[21]采用不同剂量的真武汤给心力衰竭大鼠灌胃,采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测,观察高㊁中㊁低剂量真武汤对心力衰竭大鼠血清AngⅡ及ALD 水平的影响,与模型组比较,真武汤低剂量组可降低AngⅡ水平,但其对降低ALD水平效果不明显;中㊁高剂量可显著降低AngⅡ及ALD水平㊂提示真武汤能够明显降低心力衰竭时AngⅡ及ALD水平,且随着真武汤的剂量梯度的增加,心力衰竭大鼠血清AngⅡ及ALD水平降低幅度呈递增趋势㊂真武汤能够明显降低心力衰竭大鼠组织中AngⅡ㊁ALD及AngⅠ型受体的蛋白表达,发挥类似ACEI㊁ARB和MRA作用治疗心力衰竭㊂这就可能与真武汤抑制RAAS的过度激活有关,阻断ACE的作用,使AngⅠ转化成AngⅡ受到抑制,缓解周围血管阻力,减轻心脏后负荷,从而减轻心室扩张,阻止心室重量增加,逆转心室重塑,切断心力衰竭恶性循环,消除AngⅡ在心力衰竭中的危害作用,改善心功能㊂另一方面,同时调控ALD分泌,减轻水钠潴留,缓解对心脏造成的前负荷作用,从而治疗心力衰竭㊂真武汤能够明显降低心力衰竭大鼠中Ang Ⅱ㊁ALD受体的蛋白表达,提示其治疗心力衰竭的机制可能与调节神经内分泌功能及降低肾素㊁血管紧张素Ⅱ和ALD水平有关[22]㊂2.3基于其他体液因子作用机制研究李晓峰等[23]采取化学比色法和放射免疫法评估常规治疗与加用真武汤对住院病人血浆NO水平的影响,两组病人治疗前的NO水平比较差异无统计学意义(P>0.05),治疗后以及组内治疗前后比较差异有统计学意义(P<0.05),提示真武汤和常规治疗心力衰竭均可以降低病人血浆NO水平,间接改善血管的收缩和舒张功能且真武汤降低的幅度更大㊂由于心脏NO的产生增加并且与心脏收缩功能呈负相关[24],真武汤可能阻碍了NO的某种生成机制的靶向通路,导致NO减少,心肌收缩功能增强,从而改善心力衰竭,这可能与sGC刺激剂的作用机制有异曲同工之妙㊂刘燕君等[25]通过体表面积换算公式的方法给心力衰竭大鼠服用等效剂量的真武汤㊁呋塞米㊁芪苈强心胶囊,采用ELISA法检测,观察真武汤组㊁呋塞米组㊁芪苈强心胶囊组对心力衰竭大鼠AVP含量的影响㊂与空白组比较,模型组AVP含量升高(P<0.01);与模型组比较,真武汤组AVP含量降低(P<0.05)㊂提示真武汤治疗后,通过调控AVP-AVP受体-AQP系统, AVP水平下降,AQP2蛋白的表达受抑制,影响对水的转运和重吸收功能,缓解水钠潴留,减轻心脏负荷,发挥着AVP受体拮抗剂治疗心力衰竭的作用㊂3小结与展望心力衰竭是临床最常见的心血管疾病,心肌的器质性和功能性病变均是心力衰竭的重要病因㊂心肌缺血缺氧㊁缺血再灌注㊁纤维化后导致神经体液系统异常激活和体液因子的异常改变是心力衰竭的病理生理机制㊂实验研究表明真武汤对心力衰竭发挥着多靶点㊁多通路㊁多途径的治疗作用㊂真武汤作用于神经体液系统,提高神经内分泌细胞的阈值,从而拮抗神经体液的过度激活,减少NE㊁AngⅡ及ALD的分泌,降低NO㊁AVP等炎性体液因子的水平,减轻心脏的前后负荷,抑制心肌重塑,改善心肌的舒缩功能,从而发挥治疗心力衰竭的作用㊂围绕心力衰竭的神经体液机制,探究真武汤作用机制已取得一定的进展和成就㊂由于真武汤治疗心力衰竭机制的复杂性,目前对其研究还存在一些不足之处:1)真武汤治疗胸痹心痛资料源于‘伤寒论“,实验中的动物模型和病人未能按照中医的辨证分型区分验证,且代表治疗量的指标模拟方式和测定方法单一,不能体现出中医病证结合的理念;2)真武汤基于神经体液治疗心力衰竭的观察性研究较多,机制性研究较少,无法直接与心力衰竭的病理生理机制相对应;3)真武汤治疗心力衰竭的效果测定中,多为直接测定生理生化性指标,无法得知真武汤作用于心力衰竭病人各个时间段的反应,不能像中医一样见微知著,不利于对其不良反应的研究和发现;4)实验对象样本量少,观察时间短,容易犯 轻率概括 的错误,现有的结论还需进一步探究;5)对于真武汤各中药成分的综合药理研究还存在局限性,不利于对真武汤成分的进一步改善和发展㊂鉴于心力衰竭复杂的病理生理机制,真武汤对神经体液系统多靶点㊁多通路㊁多途径的治疗作用以及中医辨证论治的特点,在未来的研究中应注意以下几点: 1)扩大受试人群或模型的样本容量,进行多中心研究,消除因抽样误差导致错误的结论;2)采用高新兴技术对真武汤的各组成成分及综合成分进行药理研究,并研究将各个药物和综合成分作用于受试对象产生的生理生化指标,以期知晓其治疗心力衰竭的单独药物靶点和整体作用靶点机制;3)心力衰竭研究对象应与临床实际相契合,选取具有不同中医辨证分型的心力衰竭对象;4)真武汤治疗心力衰竭的机制实验应实现辨证研究,提高研究的针对性和严谨性;5)将网络药理学㊁数据挖掘与各种互联网技术等多种技术与中医特色理念㊁西医生理生化研究相结合,建立多方位,多系统的研究方案,进一步揭示真武汤治疗心力衰竭的神经体液机制㊂参考文献:[1]GO A S,MOZAFFARIAN D,ROGER V L,et al.Heart disease andstroke statistics--2014update:a report from the American Heart Association[J].Circulation,2014,129(3):e28-e292.[2]顾东风,黄广勇,何江,等.中国心力衰竭流行病学调查及其患病率[J].中华心血管病杂志,2003,31(1):3-6.[3]ROGER V L,WESTON S A,REDFIELD M M,et al.Trends in heartfailure incidence and survival in a community-based population [J].JAMA,2004,292(3):344-350.[4]LEVY D,KENCHAIAH S,LARSON M G,et al.Long-term trends inthe incidence of and survival with heart failure[J].The New England Journal of Medicine,2002,347(18):1397-1402. 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中文说明书UNIONHONEST酶标板吸附测试Enzyme linked lmmnnosorbenl Assay _____________________________________________________________________________________ 人（Human）肾素（Renin）ELISA检测试剂盒本试剂仅供研究使用标本：血清或血浆试验原理：RENIN试剂盒是固相夹心法酶联免疫吸附实验（ELISA）.已知RENIN浓度的标准品、未知浓度的样品加入微孔酶标板内进行检测。

先将RENIN和生物素标记的抗体同时温育。

洗涤后，加入亲和素标记过的HRP。

再经过温育和洗涤，去除未结合的酶结合物，然后加入底物A、B，和酶结合物同时作用。

产生颜色。

颜色的深浅和样品中RENIN的浓度呈比例关系。

试剂盒内容及其配制：试剂盒成份96孔配置48孔配置96/48人份酶标板1块板（96T）半块板（48T）塑料膜板盖1块半块标准品：1000mU/ml1瓶（1.0ml）1瓶（0.5ml）空白对照1瓶（1.0ml）1瓶（0.5ml）标准品稀释缓冲液1瓶（8.0ml）1瓶（4.0ml）生物素标记的抗RENIN抗体1瓶（8.0ml）1瓶（4.0ml）亲和链酶素-HRP 1瓶（12ml）1瓶（5ml）洗涤缓冲液1瓶（20ml）1瓶（10ml）底物A 1瓶（6.0ml）1瓶（3.0ml）底物B 1瓶（6.0ml）1瓶（3.0ml）终止液1瓶（6.0ml）1瓶（3.0ml）自备材料：1. 蒸馏水。

2. 加样器：5ul、10ul、50ul、100ul、200ul、500ul、1000ul。

3. 振荡器及磁力搅拌器等。

4.样品收集、处理及保存方法：1、血清……操作过程中避免任何细胞刺激。

使用不含热原和内毒素的试管。

收集血液后，1000×g离心10分钟将血红细胞迅速小心地分离。

2、血浆……EDTA、柠檬酸盐、肝素血浆可用于检测。