非结核分枝杆菌的菌种鉴定方法

非结核性分枝杆菌病应该做哪些检查？*导读：本文向您详细介非结核性分枝杆菌病应该做哪些检查，常用的非结核性分枝杆菌病检查项目有哪些。

以及非结核性分枝杆菌病如何诊断鉴别，非结核性分枝杆菌病易混淆疾病等方面内容。

*非结核性分枝杆菌病常见检查：常见检查：胸部平片、真菌组织病理学、皮肤试验*一、检查1、细菌学检查对疑为NTM肺病患者可取痰液涂片作抗酸染色、痰液培养、支气管灌洗标本培养。

如抗酸染色阳性，应培养后鉴定。

如2～3次培养为同一种NTM，即可诊断。

对NTM脑膜炎、血源性播散性NTM患者可进行脑脊液、血液或骨髓培养。

污染是常见的，尤其是痰标本。

即使用自来水冲洗支气管镜或培养皿也可以产生污染而导致假阳性。

因此，明确诊断必须根据高度怀疑的临床症状和可信的微生物学检查。

2、分子生物学检查选用NTM的16S-23 SrDNA基因间隔区序列(IGS)的PCR-限制性片段长度多态性(PCR-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP)分析，作NTM菌种鉴定，比形态学、生物化学常规方法鉴定更准确、快速与简便。

3、病理学检查对皮肤软组织NTM感染、NTM淋巴结炎可进行活组织病理检查。

在确保活组织无外源性污染的前提下，病变部位组织NTM培养阳性，即可做出NTM病的诊断。

4、Mantoux皮肤试验结核分枝杆菌与NTM有共同抗原，虽然PPD皮试可产生交叉反应，但仍有区别之处。

取结核分枝杆菌的PPD-T与NTM的PPD-NTM同时进行皮肤试验，NTM患者对PPD-T硬结直径一般不超过15mm。

如PPD-NTM皮试硬结直径比PPD-T皮试大5mm或25%以上，即可认为是NTM感染。

5、影像检查 X线胸片上病变多见于右上肺，显示浸润、空洞、结节、纤维干酪和广泛纤维收缩等多种病变。

空洞发生率高达80%，呈单发或多发。

*以上是对于非结核性分枝杆菌病应该做哪些检查方面内容的相关叙述，下面再来看看非结核性分枝杆菌病应该如何鉴别诊断，非结核性分枝杆菌病易混淆疾病。

非结核分枝杆菌(nontuberculous Mycobacteria, NTM)系指除了结核分枝杆菌复合群和麻风分枝杆菌外的一大类分枝杆菌的总称。

NTM种类繁多,迄今已发现160余种,通常采用Runyon分类法(NTM在试管内的生长温度、速度、菌落形态和色素产生与光反应关系)将NTM分为光产色菌、暗产色菌、不产色菌及快速生长分枝杆菌4组[1]。

NTM广泛存在于自然环境中,主要通过水和土壤传播,极少数为致病菌,多数为条件致病菌,人通过环境接触感染NTM而患病[2-3]。

近期的研究显示,NTM的分离率由4.3%(1979年统计)上升至11.1%(2000年统计),再到21.0%(2010年统计)[4],这反映出我国的NTM病患者呈明显增多趋势。

NTM病与结核病的临床表现相似,多表现为全身中毒症状和局部损害,主要累及肺、淋巴结、皮肤及免疫受损患者,若能及时鉴定出菌种甚至亚种,可减少误诊,进而降低因误诊导致的不良后果[2,5]。

不同种类NTM感染采用的治疗方案亦不同,因此,明确NTM 是否感染及鉴定出准确的亚种是拟定最佳诊疗方案的关键。

NTM的实验室检测方法主要是传统细菌学检测和分子生物学检测,传统检测方法(培养基培养后辅以生化试验)因简单、试剂价格合理且易于推广而被沿用至今,但其耗时长、阳性率低、污染大且缺乏可重复性,不能准确、及时地为临床诊断提供参考[6]。

随着分子生物学技术的迅速发展,利用NTM同源DNA序列中的特异性可以鉴定其菌种甚至亚种,这为临床诊DNA测序鉴定非结核分枝杆菌的研究进展陈培幸韶关学院医学院,广东韶关512005[摘要]非结核分枝杆菌(NTM)感染的患者数量逐年增加,同时,NTM新的亚种不断被发现,这导致其检测鉴定难度也随之增加。

迄今发现的菌种已有160余种,而传统检测方法(培养基培养后辅以生化试验)不能准确、及时地为临床诊断提供参考。

随着分子生物学技术的迅速发展,利用NTM同源DNA序列中的特异性(如16S核糖体DNA、核糖体蛋白S1、转录间区序列1、热休克蛋白65、rpo B等)可以快速鉴定菌种。

分枝杆菌菌种鉴定1 检测范围用于定性检测来源于临床疑似结核病和非结核分枝杆菌( Non-tuberculous Mycobacteria,NTM)病患者经过分离培养的分枝杆菌分离株样本中的核酸,检测指标包括临床常见分枝杆菌的17个种或群,包括:结核分枝杆菌复合群、胞内分枝杆菌、鸟分枝杆菌、戈登分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、偶然分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、浅黄分枝杆菌、土分枝杆菌、龟分枝杆菌和脓肿分枝杆菌、草分枝杆菌、不产色分枝杆菌、海分枝杆菌和溃疡分枝杆菌、金色分枝杆菌、苏尔加分枝杆菌和玛尔摩分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌、耻垢分枝杆菌。

可用于结核病和非结核分枝杆菌( Non-tuberculous Mycobacteria,NTM)病的辅助诊断,也可用于流行病学调查等领域。

2 方法原理基因芯片( genechip)也称为DNA芯片、DNA微陈列、寡核苷酸陈列,是指采用原位合成(或显微打印手段),将DNA探针固化于支持物表面上,产生二维DNA探针陈列,然后与标记的样品进行杂交,通过检测杂交信号来实现对生物样品快速、并行、高效地检测。

基因芯片对分枝杆菌的菌种鉴定通过在芯片上设计种属特异性寡核苷酸探针,将标记有荧光分子的PCR扩增产物与芯片上的探针在一定的条件下进行杂交反应,根据碱基互补配对原则,序列匹配的PCR扩增产物与探针形成稳定的二级结构。

根据探针在芯片上的特定位置排布,就可以推断出相应被测细菌的相关信息,鉴定出被测细菌的种类采用基因芯片微量点样技术,将检测上述基因的特异探针与各种对照探针固定在基片上,检测探针和对照探针各重复5个点,形成12行×10列的微阵列，每张芯片上有4个同样的微阵列,每一个微阵列可以检测一份样品。

3 检测样本检测适用的标本类型为来源于临床疑似结核病和非结核分枝杆菌( Non- tuberculous Mycobacteria,NTM)病患者经过分离培养的分枝杆菌分离株。

存在于固体培养基上的待测分离株样本不可冷冻储存，因为冷冻会对后续操作造成影响；存在于液体培养基中的待测分离株样本在-70℃储存不超过5年。

1.分枝杆菌菌种初步鉴定：1.1试剂：见培养基配制标准程序1.2 接种方法:与药物敏感试验相同，10-2mg／ml菌液，接种0.1ml。

37℃孵育，每周观一次，快速生长非结核分枝杆菌一周内可生长菌落，缓慢生长分枝杆菌，四周报告结果。

与药物敏感性试验同步进行。

1.3 结果与报告分枝杆菌菌种初步鉴定结果见表PNB TCH牛分枝杆菌 - -结核分枝杆菌 - +非结核分枝杆菌 + +参考文献:结核病诊断细菌学检验规程2.分枝杆菌菌种系统鉴定：临床分离分枝杆菌菌株，经PNB、TCH等鉴别培养基初步鉴定后，确定为非结核分枝杆菌者或药物敏感试验耐PAS的分离菌株，以及临床提出需作菌种鉴定的菌株，可按下列方法进行系统鉴定。

2.1 培养特性2.1.1 生长速度接种原始分离株的次级培养物10-2mg／ml菌液0.1ml于改良罗氏培养基上，分别置于37℃;45℃和28℃孵育，一周之内生长菌落者为快速生长分枝杆菌。

一周后生长者为缓慢生长分枝杆菌。

2.1.2色素产生将分离菌株接种两支改良罗氏培养基，一支用锡纸或黑纸包缠密封，另一支不包纸，二者一起放入37℃孵育，待不包纸管长出菌落时，开启包纸管观察，有色素产生为暗产色菌。

无色素者，开启试管胶塞通气，以100瓦钨灯泡在相距450cm处照射2—3h，继续放37℃孵育3天，每天观察一次，产生色素者则为光产色菌。

不论照光与否，菌落均无色素产生者为不产色菌。

2.2 生化试验2.2.2 耐热触酶试验（1）原理：有些分枝杆菌经68℃处理后，产生的过氧化氢酶仍保持活性，可分解过氧化氢。

（2）试剂：a)pH7.0 1／15M磷酸盐缓冲液(PB)b)30％过氧化氢溶液(H202)c)10％吐温一80溶液 121℃ 10min灭菌，4℃保存。

(3) 方法：取生长在改良罗氏培养基3—4周的菌落磨菌比浊制备10mg／ml 菌悬液，取0.5ml混悬于含试剂(1)1.0ml试管内，放入68℃水浴20min，待冷却后，缓缓滴加37％H202与10％吐温-80等量混合液0.5ml(此液临用前配制)。

非结核分枝杆菌病诊断与处理详细讲解非结核分枝杆菌病（Non-Tuberculosis Mycobacterium，简称NTM），是由非结核分枝杆菌引起的一类感染性疾病。

与结核病不同，NTM病往往在免疫功能低下的个体中发生。

NTM病病程相对较长，症状多样，通常不会自愈。

如果不及时进行诊断和治疗，将对患者的健康产生严重影响。

本文将详细讲解NTM病的诊断与处理。

一、诊断NTM病的诊断主要依靠以下几个方面：病史调查、临床表现分析、实验室检查以及影像学检查等。

1. 病史调查：患者的个人病史对于NTM病的诊断非常重要。

医生需要了解患者的基本信息、既往病史以及可能的风险因素，例如是否有免疫功能低下等。

2. 临床表现分析：NTM病的临床表现多样，常见的症状包括咳嗽、咳痰、乏力、发热等。

这些症状不容忽视，特别是对于长期咳嗽伴有咳痰的患者。

医生需要结合患者的具体表现来判断是否需要进行NTM病的进一步检查。

3. 实验室检查：实验室检查是确定NTM病诊断的重要手段之一。

目前常见的实验室检查方法有痰液培养、DNA检测、中和试验等。

其中痰液培养是最常用的检查方法，可以通过培养痰液样本中的分枝杆菌来确定是否感染NTM。

此外，DNA检测和中和试验也可以用来确认NTM病的诊断。

4. 影像学检查：影像学检查在NTM病的诊断中起到重要的辅助作用。

常见的影像学检查方法有X线胸片、胸部CT等。

NTM病在影像学上通常表现为肺部或其他器官的结节、空洞、磨玻璃样阴影等。

医生可以通过影像学检查来确定病变的范围和程度，为进一步治疗提供依据。

二、处理NTM病的处理主要包括药物治疗、免疫调节治疗以及手术治疗等。

具体处理方案应根据患者的具体情况来制定。

1. 药物治疗：药物治疗是NTM病的主要治疗方法。

常用的抗生素有环丙沙星、利福平、乙胺丁醇、吡嗪酮等。

治疗方案应根据病原菌的类型、感染部位、药敏试验结果以及患者的肝肾功能等因素来确定。

药物治疗一般需要长期进行，通常持续数月甚至数年。

应用PCR-反向斑点杂交快速鉴定分枝杆菌菌种目的:应用聚合酶链反应-反向斑点杂交法(PCR-RDBHA)快速鉴定分枝杆菌至种的水平。

方法:以分枝杆菌rpoβ基因编码序列为靶基因,应用PCR-RDBHA检测126株分枝杆菌临床分离株。

以PCR-DNA测序为对照,对经PCR-RDBHA鉴定为非结核分枝杆菌(NTM)的临床分离株进行PCR-DNA测序。

结果:126株临床分离株中,经鉴定115株(91.3%)为结核分枝杆菌复合群(MTC),11株(8.7%)为NTM。

NTM中,4株胞内分枝杆菌,1株堪萨斯分枝杆菌,1株戈登分枝杆菌,2株瘰疬分枝杆菌,3株脓肿分枝杆菌。

11株NTM PCR-RDBHA与PCR-DNA测序结果一致。

结论:PCR-RDBHA能鉴定分枝杆菌临床分离株至种的水平,方法简便、快速,结果准确,具有良好的临床应用价值。

[Abstract] Objective: To identify Mycobacterium species rapidly by polymerase chain reaction-reverse dot blot hybridization assay (PCR-RDBHA). Methods: 126 mycobacterial clinical isolates were detected by PCR-RDBHA based on the sequence of rpoβ gene. PCR-DNA sequencing of the nontuberculous mycobacteria (NTM) identified by PCR-RDBHA was performed as control. Results: Among 126 isolates, 115 (91.3%) were determined to be M.tuberculosis complex (MTC), 11 (8.7%) to be NTM which contained 4 M.intracellulare, 1 M.kansasii, 1 M.gordonae, 2 M.scrofulaceum and 3 M.abscessus. The results of 11 NTM identified by PCR-RDBHA were in agreement with PCR-DNA sequencing. Conclusion: It is simple, rapid, accurate and valuable in clinical application that PCR-RDBHA is applied to identify mycobacterial clinical isolates to species level.[Key words] Mycobacterium; Species identification; Polymerase chain reaction; Reverse dot blot hybridization assay目前,常规的分枝杆菌菌种鉴定需采用分枝杆菌培养物进行生长特性试验(生长速度、生长温度、光产色试验、多种鉴别培养基上生长试验)及生化特性试验(耐热触酶试验、硝酸盐还原试验、烟酸试验、吐温-80水解试验、尿素酶水解试验、芳香硫酸酯酶试验、铁离子吸收试验、亚硝酸盐还原试验)等10余项试验,综合分析判定结果[1],方法复杂、费时,慢生长分枝杆菌需3～4周方可获得结果,且准确度较差,难以满足临床诊断和治疗的需要。

《医学微生物学》考点：非结核分枝杆菌2017年《医学微生物学》考点：非结核分枝杆菌指结核分枝杆菌、牛分枝杆菌与麻风分枝杆菌以外的分枝杆菌。

原称为非典型分枝杆菌，其特性有别于结核分枝杆菌，如对酸、碱比较敏感。

以下是店铺带来的详细内容，欢迎参考查看。

菌种分类Runyon根据菌落色素与生长速度将非结核分枝杆菌分为4组。

第Ⅰ组：光产色菌(photochromogen)。

本组细菌在暗处为奶油色，曝光1小时后再培养即成橘黄色。

生长缓慢，菌落光滑。

对人致病的有堪萨斯分枝杆菌(M.kansas)，引起人类肺结核样病变，常有空洞形成; 海分枝杆菌(M.marinum)，在水中可通过皮肤擦伤处侵入，引起皮肤丘疹、结节与溃疡，病理检查见有抗酸菌，易被误认为麻风分枝杆菌。

第Ⅱ组：暗产色菌(scotochromogen)。

这类细菌在暗处培养时菌落呈橘红色。

在37℃生长缓慢，菌落光滑。

对人致病的有瘰疠分枝杆菌(M.scrofulaceum),引起儿童淋巴结炎。

第Ⅲ组：不产色菌(nonphotochromogen)。

通常不产生色素。

40～42℃下生长慢。

菌落光滑。

鸟-胞内分枝杆菌(M.avium-intracellulare)可引起结核样病变，多见于肺与肾。

第Ⅳ组：迅速生长菌(rapid grower)。

在25～45℃生长。

生长快，培养5～7d即可见到菌落，菌落粗糙，有的并能产色。

对人致病的有偶发分枝杆菌 (M.fortuitum)、龟分枝杆菌(M.chelonei)和溃疡分枝杆菌(M.ulcerans)，引起皮肤病。

耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)不致病，但经常在外阴部皮脂中存在，检查粪、尿中结核分枝杆菌时应予注意。

非结核分枝杆菌特点非结核分枝杆菌是否有致病性可用抗煮沸试验加以区别。

非致病株煮沸1min即失去抗酸性，而致病株能耐10min，甚至高压灭菌亦不失去抗酸性。

结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌的`鉴别，除热触酶试检外，可将菌苔置含盐水小滴的玻片上研磨，前者不易乳化而后者容易乳化。

分枝杆菌检测方法总结分枝杆菌检测方法主要有以下几种：1. 痰涂片：这是最常用的方法，优点是快速、低廉、操作简便，但无法区分死活菌，尤其是无法区分结核分枝杆菌（MTB）和非结核分枝杆菌（NTM），而且受制于痰液中分枝杆菌数量，敏感性较低，漏检率很高。

2. 结核培养：与痰涂片相比，培养法灵敏度增加了不少，结核培养阳性是诊断抗酸杆菌的金标准，但缺点在于培养时间周期过长，一般需要8周左右时间，这样很耽误医生用药和患者及时治疗。

3. 结核杆菌IgG抗体检测：感染结核分枝杆菌后，体内可产生特异性抗体。

将结核分枝杆菌抗原包被在固相载体上，与待测血清反应，血清中相应的抗体可结合于其上，再以胶体金（或酶）标记，显示反应，可检出血清中结核分枝杆菌抗体。

结核杆菌IgG抗体检测特异性较好，对于排除结核阳性有利，但无法确诊活动性结核。

4. Xpert MTB/RIF：通过检测MTB基因组中的rpoB基因及其突变情况，实现MTB核酸和利福平耐药检测的全自动实时荧光定量核酸扩增技术。

具有以下优势：特异性好，能准确区分MTB和NTM；灵敏度高，检测快速，仅需要两个小时就完成检查了；适用于各种标本，痰液、肺泡灌洗液、肺组织、脑脊液、淋巴结、关节液以及尿液等均可用于检测；同时可以检测利福平耐药，检测对一线抗结核药物利福平的耐药情况，敏感性特异性极高，可及时为临床用药提供有效参考。

5. IGRA：γ-干扰素释放试验（IGRA）是检测结核分枝杆菌（MTB）特异性抗原刺激T细胞产生的γ-干扰素（IFN-γ），以判断是否存在MTB感染。

IGRA适应证主要包括结核潜伏感染（LTBI）的诊断和活动性结核（ATB）的辅助诊断。

与结核菌素皮肤试验（TST）相比具有明显优势：特异度高，不受卡介苗接种及大多数非结核分枝杆菌（NTM）的干扰；使用单一阈值作为阳性判断标准；作为体外诊断方法，更适用于疫情检测和流行病学调查。

IGRA是世界卫生组织（WHO）推荐的用于诊断MTB感染的体外免疫学方法。

菌道系列一：非结核分枝杆菌感染性疾病是当今世界严重威胁人类健康的重大疾病。

基于NGS的宏基因组学检测（metagenomic NGS, mNGS）对病原体的覆盖极其全面，不需要微生物培养，不需要根据经验进行预设，可以检测耐药突变和毒力基因，为急危重症和未明原因感染的临床诊治提供了全新的思路和解决方案。

前不久宝藤医学为大家分享了PPmeta®-感染宏基因组检测案例，详细介绍了mNGS在感染性疾病中的应用；为了让大家更好的了解临床病原微生物知识，宝藤医学特开设《菌道系列》专栏，和大家一起说感染话菌道。

非结核分枝杆菌(nolq-tuberculous Mycobacteria，NTM)可引起身体各部位的疾病，但以肺部感染最为常见，约占NTM感染的90%，其他相对较常见的受累部位包括淋巴结、皮肤软组织、骨以及全身播散性病变，但也有中枢神经系统、角膜和耳部感染的个案报道。

一细菌特点非结核分枝杆菌(nolq-tuberculous Mycobacteria，NTM)，是指除结核分枝杆菌复合群(mycobacterium tuberculosis complex，MTC)和麻风分枝杆菌以外的分枝杆菌。

NTM的细菌学特点与结核分枝杆菌(MTB)类似，属于需氧菌，细胞壁富含脂质使其具备抗酸染色的特点，NTM在环境中普遍存在，以土壤和水中最为常见，水源性NTM与人类感染的关系最为密切。

二流行病学我国尚缺乏全国性数据，现有的关于NTM的流行病学研究结果显示，我国NTM感染呈现南方多于北方、气候温和地区多于气候寒冷地区、沿海地区多于内陆地区的特点，如以东部沿海地区报道为例，山东为1.37%，江苏为3.37%，上海为5.9%，福建为10.2%，广东为19.3%。

三不同部位感染NTM情况肺部NTM感染最常见的菌种包括MAC、脓肿分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌和蟾蜍分枝杆菌。

NTM 引起的肺外感染以淋巴结炎最为常见，尤其是6个月至2岁的儿童，最常见的致病菌为MAC，其次为瘰疬分枝杆菌和玛尔摩分枝杆菌；NTM引起的骨关节病变较为罕见，且MAC、苏尔加、偶然、蟾蜍、海等分枝杆菌可能较为常见。

非结核分枝杆菌感染的实验室检测非结核分枝杆菌（NTM）普遍存在于环境中，种类繁多，是条件致病菌，在标本采集过程或者实验室操作过程中易导致污染，易误诊为结核病。

随着检测方法的改进和医生意识的增强等因素，NTM感染诊断率明显增加，但实验室鉴定到种较为困难，目前有多种检测方法，各有优缺点。

在SIFIC2023“全国感控与耐药感染”联合大会上，同济大学附属上海市肺科医院检验科的余方友教授详细介绍了NTM感染的实验室检测方法。

一、NTM概述非结核分枝杆菌（non-tuberculous Mycobacteria，NTM）系指除结核分枝杆菌复合群和麻风分枝杆菌以外的一大类分枝杆菌的总称。

其中大部分为寄生菌，仅少部分对人体致病，属条件致病菌。

（一）NTM的特点1.NTM普遍存在于环境中，由于其细胞壁具有较强的疏水性，能天然耐受多种消毒剂、抗生素以及重金属，使其常生存于饮水系统中。

2.NTM可以在很多物体表面形成生物膜，从而使其能够抵御外界不利因素，帮助其在自然界或者物体表面长期存活。

3.已经发现的NTM超过190余种，仅少部分与人类致病相关，分疾病来源与非疾病来源。

4.标本采集过程或者实验室操作过程中导致污染，应严格避免。

（二）NTM的分类1.根据NTM生长速度及产色情况分类（1）光产色分枝杆菌，如堪萨斯分枝杆菌、海分枝杆菌、猿分枝杆菌等；（2）暗产色分枝杆菌，如瘰疬分枝杆菌、戈登分枝杆菌和苏尔加分枝杆菌；（3）分枝杆菌如偶发分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、龟分枝杆菌、耻垢分枝杆菌。

2.根据生长速度分类（1）快速生长型分枝杆菌：在固体培养基上培养7天或小于7天，可以获得肉眼可见菌落的NTM。

包括脓肿分枝杆菌复合群、龟分枝杆菌、偶发分枝杆菌、耻垢分枝杆菌。

（2）慢生长型分枝杆菌：需要大于7天才能在固体培养基上获得肉眼可见菌落的NTM，包括堪萨斯分枝杆菌、鸟-胞分枝杆菌复合群、海分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌。

二、NTM病与病原体（一）NTM的病原学特征1.条件致病菌，易误诊为结核病。