农杆菌介导的拟康氏木霉遗传转化及T-DNA插入突变体的筛选

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２．ＣｏｌｇＡｇｏｏｌｅｅｒｎｍｙ，ＬｉｏｈｎｉｅｓｔａｃｅｇＵｎｖｒｉｙ，Ｌｉｏｈｎ２２０ａｃｅｇ５００，Ｃｉ）ｈｎａ
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分转化子表现为生长和形态异常，ＣＰＲ验证潮霉素Ｂ抗性基因已整合进转化子基因组ＤＮＡ中。该转化体系的建
立为开展其生防机理研究和探索菌株改良奠定了基础。
关键词
康氏木霉；农杆菌介导；遗传转化
文献标识码：ＡＤＩ１．９９ｊｉｎ０２Ｏ：０３６／．ｓ．５９—１４．０００．１ｓ５２２１．６０６
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２１．６）４７００３（： — ６６７
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农杆菌介导的拟康氏木霉遗传转化及ＴＤＡ插入突变体的筛选－Ｎ
赵培宝。任爱芝。胡明江张秀省，，，，陈蕾蕾宋晓妍石梅，，
（．山东大学微生物国家重点实验室，济南１
摘要
２００；２５１０．聊城大学农学院，聊城
２２０）５００
建立并优化了农杆菌介导转化拟康氏木霉（ｒｈｄｒａｐｅｄｋｎｎｉＳ２获得ＴＤＴｉｏｅｍｓｕｏｏｉｇｉＭＦ）ｃ－ＮＡ插入突变体的
ｓｏｅｆｒｔｏ．ＰｐｒｏｍａｉｎＣＲｍｐｉｉａｉｎｓｏｄｔａｈ — ａｌｃｔｈｗｅｈｔｔｅＴＤＮＡａｅｎｉｔｇａｅｎｏｔｅｇｎｍｅ，ａｄｗａｔｂｅｆｏｈｄｂｅｅｒｔｄｉｔｈｅｏｎｎｓｓａｌ
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中图分类号：Ｑ７５Ｓ４６８：７
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基因的转移与重组体的筛选和鉴定-2

基因的转移与重组体的筛选和鉴定-2二、重组DNA分子转入真核细胞1. 根癌农杆菌Ti质粒介导法农杆菌介导的Ti质粒载体转化法是目前研究最多、机制最清楚、技术方法最成熟的基因转化途径。

迄今为止约8096的转基因植株都是利用农杆菌介导转化系统获得的。

农杆菌是一类土壤习居菌，革兰氏染色呈阴性，能感染双子叶植物和裸子植物，而对绝大多数单子叶植物无侵染能力。

植物受伤后，伤口处细胞分泌大量的酚类化合物，如乙酰丁香酮（AS）和羟基乙酰丁香酮（OH－As），它们是农杆菌识别敏感植物的信号分子。

具有趋化性的农杆菌移向这些细胞，并将其Ti质粒上的T－DNA的转移至细胞内部。

根据这一性质，将待转移的目的基因组入Ti质粒载体，通过农杆菌介导进人植物细胞，与染色体DNA整合，得以稳定维持或表达。

步骤：（1）外植体选择与预培养；（2）接种活化的农杆菌工程菌；（3）共培养；（4）选择培养；（5）转化植株再生2. 高压电穿孔法利用脉冲电场将DNA导入受体细胞的方法叫做高压电穿孔法。

利用这种方法，可以将DNA导入动、植物及细菌细胞。

具有简单方便、对细胞毒性低以及转化效率高等优点。

（1）标准的操作程序——将高浓度的含有克隆基因的质粒DNA加到原生质体的悬浮液中，然后置于200～600V／cm的电场下进行电脉冲刺激。

经过如此电穿孔处理的原生质体在组织培养基中培养1～2星期之后，选择已经捕获了转化DNA的细胞，作进一步的继续培养，以便获得再生植株。

应用这种方法已成功地转化了玉米和水稻的原生质体，其转化效率在0．1％～1．0％之间。

（2）影响电穿孔导入DNA效率的因素：① 外加电场的强度：250～750 V／cm较宜；② 电脉冲的时间：20～100ms；③工作温度：对不同类型细胞所要求的条件不同，可以在0℃至室温（25℃）之间进行选择；④ DNA的构象和浓度：线性 DNA比环状 DNA要好，浓度控制在1～ 40μg／mL。

⑤工作缓冲液的离子成分：也对其DNA导入效率发生作用，一般用盐溶液悬浮细胞要比用非离子溶液更易DNA的导入。

拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定

拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定09生工吴超 200900140129一、实验原理T-DNA插入法是反向遗传学研究的重要手段。

T-DNA是农杆菌的一个大质粒，长度在25kb左右。

野生型农杆菌的T-DNA上带有激素合成基因，感染植物后会导致植物细胞快速增殖形成愈伤组织，失去分化能力。

所以一般实验使用改造后的农杆菌——T-DNA中导入了卡那霉素抗性基因和抗除草剂基因。

因此在农杆菌感染植物后可用除草剂来筛选转化子。

在转化子培养到F2代出现分离后，就需要对其基因型进行鉴定。

T-DNA插入突变体鉴定方法主要有两种：三引物法和双引物法。

在本实验中使用三引物法。

三引物法的原理如图1所示，即采用三引物（LP、RP、BP）进行PCR扩增。

野生型植株目的基因的两条染色体上均未发生T-DNA插入，所以其PCR产物仅有1种，分子量约900bp（即从LP到RP）；纯合突变体植株目的基因的两条染色体上均发生T-DNA插入，T-DNA本身的长度约为25kb，过长的模板会阻止目的基因特异性扩增产物的形成，所以也只能得到1种以BP与LP或RP为引物进行扩增的产物，分子量约为400-700bp；杂合突变体植株只在目的基因的一条染色体上发发生了T-DNA插入，所以PCR扩增后可同时得到两种产物。

上述3种情况的电泳结果差异明显，能有效区分不同基因型的植株。

此法优点是可同时鉴定出纯和突变体并确证T-DNA的插入情况。

图1 T-DNA插入示意图CATB，即十六烷基三甲基溴化铵，是一种离子型表面活性剂。

能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。

并且CATB可在高离子强度的溶液里与蛋白质和大多数多聚糖形成复合物进而形成沉淀，但不沉淀核酸。

本实验使用CATB抽提DNA。

聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是体外核酸扩增技术。

它具有特异性高、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至几万倍，使肉眼能直接观察和判断。

根癌农杆菌介导的真菌遗传转化研究进展

3atmt技术在真菌中的研究趋势2005年michielse等在发表的一篇综述里描述了atmt技术的转化特点5然而接下来的10年一些研究趋势还在继续更多焦点还是共培养条件对转化效率的影响例如细菌和真菌细胞浓度共培养时间和温度以及受伤植物根释放的可以促进农杆菌转化的代谢产物乙酰丁香酮的浓度
江苏农业科学２０２０年第４８卷第３期
靶基因替代的突变体，还可操控基因的表达以取得生物工程方面的效益。了解这项技术是如何应用的能够指导或预测未来技术在真菌中的应用，从而推进真菌方面的研究。
１根癌农杆菌及其介导的真菌遗பைடு நூலகம்转化
根癌农杆菌是一种植物病原菌，属于 α－变形菌，是自然界中一种天然的能创造转基因生物的介体。在这个过程中，根癌农杆菌将质粒的一个ＤＮＡ片段插入到宿主植物细胞核基因组中，自然界里，这段细菌的ＤＮＡ能够编码蛋白质用于改变植物的生长而利于自己的繁殖［６］。在大多情况下，这会导致植物形成非增生性的瘿或瘤，被改变的受体基因组通常不会遗传给后代植株。然而，甘薯基因组分析表明，在很稀有的情况下，这些转化事件能够更永久地融合进受体植物基因组并遗传下去［７］。农杆菌属细菌属于根瘤菌科，更接近于能与植物形成共生关系固定空气中氮素的根瘤菌属细菌。根癌农杆菌又被命名为放射型根瘤菌［８］，但真菌转化领域使用该物种作为转化介体时依旧使用根癌农杆菌这个名字。
１９９８年，Ｄｕｎｎ－Ｃｏｌｅｍａｎ等在《ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ》杂志上发表了一个评论，介绍了真菌上应用的一个新的转化技术，即利用根癌农杆菌将外源的ＤＮＡ转入到丝状真菌中［１］。当外源ＤＮＡ转入真菌进而整合到真菌基因组的过程中有可能破坏一个关键的基因而引起性状的改变，据此可以了解有关真菌基因或多或少的信息。将根癌农杆菌应用于真菌的遗传转化，这一非凡创举早在１９９５年于模式生物酿酒酵母中首次被证实［２］，１９９６年利用农杆菌转化了酵母［３］，１９９８年将这一植物病原细菌成功应用于子囊菌和担子菌等７种丝状真菌的转化中［４］。从１９９５年第一次报道根癌农杆菌介导真菌遗传转化到２００５年，１０年间，该技术已成功应用于５０余种真菌［５］。此后１０年，根癌农杆菌介导的遗传转化在真菌中的应用不断扩大，在许多真菌中甚至作为一种标准的试验技术进行基因操作。有些真菌，农杆菌介导转化（ＡＴＭＴ）技术是最容易甚至是唯一的一种引入外源ＤＮＡ的试验技术。在其他真菌种类中，ＡＴＭＴ成为一种强大的正向遗传学技术，用于构建携带Ｔ－ＤＮＡ随机插入标签的突变体库并用于基因分析，抑或用于反向遗传学构建特定

农杆菌介导的真菌T-DNA插入突变

达外源基因的转基因植物。
真菌与人们的生活和植物的生长有着不可分割的作
用。丝状真菌的遗传转化是人们进行基因功能研究的重要
途径，其遗传转化体系的建立为人们从分子水平理解丝状真菌的遗传背景、互作模式及进一步的菌株改造提供了条件。为基因的克隆、表达及调控研究奠定了坚实的基础并提供了有效的手段。ｏｈｆｌｒＲｃｅｅｅ大学的ＭｉｒｎａｕｌｓａａｄＴｔｍ利用ｈ
ＡｂｔａｔＡｏｔｎｃｎｑｅｇｎｔｔｎｈｓｅｎｕｅｔｄｎｏａｅｍｐｒｎｅｅ．ｇｏａｔｒｕｔｍｅａｉｎａｅａｉｔｓｒｃ：ｓａｉｒｔｅｈｉｕ，ｅｅｍｕａｉａｅｓｄｔｓｙａｄｉｌｔｏｔｔｎｓＡｒｂｃｅｉｍｍｐａｔｏｂｏｕｓｉａｇｕｆｃｅｓｈｓｈｂｌｙｔｉｔａｓｅＮＡｔｌｎｅｌｂｅｅｉｎｉｅｒｇｉｄｆａｉｎａｅｅｔｎｅｈｏｔａｇｏｐａｔｔｂｃｅｕａｄｆｎｉＨｎｅｏｔｎｆｒＤｐａｔｌｙｇｎｔｅｇｎｅｎ，ｔｍｏｉｃｔｓｈｖｘｅｄｄｔｅｈｓｒｎｅｆｍｌｎｓｏａｔｒｍｎｇ．ｅｃ，ｒｏｃｓｃｉｓｉｏｒｉｕＡｇｏａｔｒｍｕｆｃｅｓｍｅｉｔｄｇｎｔｔｎｉｏｅｏｅｍｕａｏｔｏｓｗｄｌｓｄｉｈａｔｓｖｒｌｙａｓＩｅａｔｌ，ｈｒｂｃｅｉｔｍｅａｉｎ — ｄａｅｅｅｍｕａｉｓｎｆｔｔｔｎｍｅｄｉｅｕｅｎｔｅｌｓｅｅａｅｒ．ｎｔｒｃｅｔｅｕｏｈｉｈｙｈｉｐｎｉｌｆｈｄａｉｎｔｅｒｓａｃｉａｏ，ｅｔｒｙｅ，ｘｓｅｒｂｅｎｓｅｓｉｔｌｗｅｅｉｔｄｃｄｉｒｃｐｅｅｏｔｍｅｉｔ，ｈｅｒｈｓｕｔｎｖｃｏｐｓｅｉｄｐｏｌｍｓｄｉａｉｌｙａｒｒｕｅ．ｏｅｔｉｔｔａｔｆｂｉｌｎｏＫｅｒｓｉｓｒｏｔｔｎＴＤＮＡＭＴＡｒｂｃｅｉｍｙｗｏｄ：ｅｉｎｍｕａｉ； — Ａ；Ｔｎｔｏ；ｇｏａｔｒｕ

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