根癌农杆菌介导的植物遗传转化1

烟草遗传转化实验报告实验目的烟草是遗传转化的模式植物,已经建立了一套完善的转化再生体系｡本实验以烟草为实验材料,了解根癌农杆菌介导法的基本原理和一般步骤, 掌握遗传转化的基本操作技术｡实验要求:掌握根癌农杆菌侵染植物获取转基因材料的方法;理解农杆菌介导途径进行基因转化的机理:了解转基因植物筛选的方法｡实验原理:根癌农杆菌是一种能诱发植物产生肿瘤的细菌,根癌农杆菌中诱导植物产生肿瘤的质粒,简称为Ti质粒｡野生型农杆菌的Ti质粒,含有两个与致瘤有关的区域: 一个是T-DNA区,含致瘤基因;另一个是毒性区,在T-DNA的切割､转移与整合过程中起作用｡用于植物基因转化的农杆菌Ti质粒载体系统的构建,是将野生Ti质粒中的致瘤基因删除,并在T-DNA区域内插入适当的选择标记和多克隆位点｡p BI121载体是常用的植物表达载体,载体的骨架是pUC18,以CaMV3SS启动子驱动的新霉素磷酸转移酶基因NPTII为卡那霉素(kan) 抗性选择标记基因,含有卡那霉素抗性基因作为筛选基因｡β一葡萄糖苷酶gus基因作为报告基因,转化的获得的转基因细胞､组织或植株,具有抗卡那霉素的特性,经组织化学染色呈蓝色｡实验器材摇床､超净工作台､小型离心机､冰箱､移液抢､镊子､手术刀､酒精灯､棉球､培养皿､三角瓶､滤纸､牛皮纸､牙签｡实验材料植物材料:烟草无菌苗农杆菌与载体:农杆菌LBA4404 p BI121 YEB培养基:牛肉膏(5 g/L)､蛋白胨(5 g/L)､酵母提取物(1 g/L)､蔗糖(5 g/L)､MgSO4(0.5g/L)､pH 7.0烟草分化培养基: MS + 2mg/L 6-BA + 0.5mg/L IAA烟草生根培养基: MS + 0.5mg/L IAA卡那霉素(Kan) 母液: 50mg/ml, 过滤除菌,分装,-20°C保存｡头孢霉素(cef) 母液: 300mg/ml, 过滤除菌,分装,-20"C 保存｡利福平(rif): 50mg/ml,过滤除菌,分装,-20"C保存｡。

根癌农杆菌介导反义fad2-1基因转化大豆的研究周延清;刘艳菊;李敏;段红英;周春娥;王芳;苑保军【摘要】通过根癌农杆菌介导法将反义fad2-1基因导入大豆子叶节,研究了农杆菌菌液浓度、预培养时间、共培养时间、恢复培养时间、乙酰丁香酮浓度和pH值对大豆子叶节形成丛生芽的影响,建立了有效的转化体系,获得了转基因大豆再生植株.PCR、PCR-Southern blotting检测结果表明,反义fad2-1基因成功转入并整合于大豆基因组.GC检测结果表明,转反义fad2-1基因大豆种子油酸含量比非转基因大豆种子的油酸含量提高了14.44%,而亚油酸含量降低了20.27%.【期刊名称】《河南农业科学》【年(卷),期】2010(000)009【总页数】5页(P17-21)【关键词】大豆;根癌农杆菌;反义fad2-1基因;遗传转化;反义抑制【作者】周延清;刘艳菊;李敏;段红英;周春娥;王芳;苑保军【作者单位】河南师范大学,生命科学学院,河南,新乡,453007;河南师范大学,生命科学学院,河南,新乡,453007;河南师范大学,生命科学学院,河南,新乡,453007;河南师范大学,生命科学学院,河南,新乡,453007;河南师范大学,生命科学学院,河南,新乡,453007;河南师范大学,生命科学学院,河南,新乡,453007;周口市农业科学院,河南,周口,466001【正文语种】中文【中图分类】S565.1大豆(Glycine max L.)是重要的油料、食用和饲料作物,其主要用途之一是压榨大豆油,大豆油用量占全世界食用油的31%[1]。

大豆油90%是脂肪酸,包括硬脂酸、棕榈酸等饱和脂肪酸和油酸、亚油酸与亚麻酸等不饱和脂肪酸。

脂肪酸的组成和配比种类决定植物油的品质[2,3]。

由于不饱和脂肪酸存在较多,使大豆油的保存期缩短。

因此,大豆油往往要经过部分氢化,以减少多不饱和脂肪酸的含量。

在此过程中,自然形成的双键变成反式构象,这种反式不饱和脂肪酸是引起冠心病的主要因素之一。

农杆菌介导法实验九植物遗传转化——农杆菌介导法⼀、⽬的了解农杆菌转化的机理；掌握农杆菌介导转化⽔稻的技术⼆、原理根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)具有跨界转移DNA的能⼒。

下列因⼦与转化过程有关：1. Ti 质粒(tumor-inducing plasmid)上的T-DNA (transferred DNA)T-DNA是农杆菌Ti质粒上能够转移到植物基因组的⼀段DNA序列。

T-DNA含有RB和LB两个边界，它们是25bp的正向重复序列，是T-DNA 转移的顺式作⽤元件。

不同类型的农杆菌其边界序列有所不同，但划线部分为完全保守序列。

置于该边界内的任何外源基因均可被转化。

LB缺失突变后农杆菌仍能致瘤，但RB缺失会导致致瘤能⼒丧失，这时⼏乎完全没有T-DNA的转移。

LB（－链）5’GT TTACACCACAA TA TATCCTG CCA 3’RB（＋链）5’TGA CAGGA TA TA TTGGCGGGTAA AC 3’2. Ti质粒上的Vir区（virulence region）操纵⼦转化所必需的基因有vir A、B、C、D、E、G。

其中蛋⽩VirD1/D2识别T-DNA边界RB和LB；VirC识别T-DNA右边界的超驱增强⼦；VirD2在T-DNA底链起内切酶作⽤造成切刻，并与T－链5’ 共价结合，带有1个核定位信号NLS；VirB形成转移复合通道；VirE2为单链DNA 结合蛋⽩，有2个NLS。

该操纵⼦的表达顺序如下：vir A和vir G组成型表达形成VirA和VirG蛋⽩→VirA被植物创伤信号分⼦激活→激活的VirA使VirG激活→激活的VirG 诱导vir C、D、E、B、F、H表达。

3. 农杆菌染⾊体基因组相关基因：chv A、chv B（农杆菌运动、附着）、chv D、chv E（编码单糖结合蛋⽩、趋化性）、pscA、att、cel（合成纤维素丝，附着）。

遗传转化的方法和技术常见的遗传转化方法和技术包括农杆菌介导法、基因枪转化法和聚乙二醇-介导法等。

其中，农杆菌介导法是植物基因转化中使用最普遍的一种方法。

其Ti质粒具有将DNA整合到植物染色体上，并使之与植物内源基因同步表达的能力。

农杆菌介导法的具体步骤如下：1. Ti质粒的构建：利用农杆菌进行遗传转化前，必须对Ti质粒进行改造。

改造的目的有以下几点：去除T-DNA区的激素基因，因为激素基因的产物会导致转化细胞激素水平的不平衡而引起细胞的无限分裂，阻碍正常植株的再生。

保留T-DNA区的左右边界，尤其是左边界，以保证T-DNA的正常转化。

在去除的T-DNA区，增加至少一个可以在植物体内表达的选择基因，以使转化细胞易于被检测出来。

在T-DNA区外加一个可以克隆外源目的基因的多聚接口。

在T-DNA区外加一个抗菌素基因标记质粒，该基因只能在细菌中表达，而不能在植物中表达。

2. 外源基因的转化：除Ti质粒外，发根农杆菌的Ri质粒也已成为植物基因工程载体家庭中的新成员。

发根农杆菌感染植物伤口，向目的植物转入Ri质粒中的T-DNA，经一段时间后被感染的植物会在不定的部位生出发状根。

发状根没有向地性，可在无激素的培养基上培养生长，生长迅速并产生许多分枝，其增长速度一个月可增殖数倍到数百倍。

发根农杆菌对植物的这种作用主要依赖于其菌体中的Ri质粒。

例如通过发状根培养来生产只有在高度的根趋向分化细胞中才能产生的有用次生代谢物质等。

3. 外源基因的转化：一般而言，农杆菌只感染双子叶植物；但利用Ti质粒作载体已将外源基因导入了水稻、玉米、吊兰、石刁柏、香蕉等某些单子叶植物中。

农杆菌介导的遗传转化技术简单，易于掌握，对植物受体要求不严，绝大多数双子叶植物和少数单子叶植物的组织或器官均可，且转化频率较高，转化周期较短，是目前应用最广的一种植物遗传转化方法。

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农杆菌介导高等植物基因转化的影响因素刘石泉　余沛涛　(上海师范大学生命与环境科学学院)关健词　农杆菌　高等植物　基因转化　影响因素 简述了近年来农杆菌转化的基本原理和载体系统的进展,同时着重阐述了不同属性农杆菌、不同植物基因型和外植体、不同再生植株的细胞起源、不同培养方法、不同药物选择以及在叶绿体与细胞核中转化等因素影响农杆菌介导高等植物基因转化,以及这个研究课题的进展现状. 转基因产品目前已引起了国内外各界的广泛关注.面对目前全球已有近4000万公顷种植面积的转基因作物[1],市场上有近4000种转基因食品[2],预计每年转基因作物的产值为100亿美元以上[3].转基因技术已经在200多种植物中获得成功,特别是转基因棉花、水稻、大豆、玉米、烟草、蔬菜等均已在生产上发挥了重大作用[4].利用转基因技术可以冲破物种界限,实现种间遗传育种,并改良现有的物种性状,具有不可估量的前景.一、农杆菌转化的基本原理 农杆菌(Agrobacterium)是一种天然的基因转化系统.农杆菌分为根瘤农杆菌(A.tumefacious)和发根农杆菌(A.rhizogenes).根瘤农杆菌中含有肿瘤诱导质粒(T i),其上含有可转移DNA(T-DNA)区、毒性区(Vir区)以及冠瘿碱代谢基因编码区.T-DNA两端是两个25bp的重复序列,分别称为左边界和右边界,两个边界序列之间是生长素和细胞分裂素合成基因以及冠瘿碱合成基因.Vir 区中含有多个基因段,如VirA、VirB、VirC、VirD、VirE、VirG、VirH等,每个基因段都含有多个基因.当植物受到伤害时,分泌含有酚类化合物的汁液,如乙酰丁香酮等,这些酚类化合物一方面通过染色体毒性基因(chvA、chvB 等)介导的催化作用促使农杆菌向植物受伤部位移动并附着于植物细胞表面;另一方面则被T i质粒上由VirA 和VirG组成的双组分调节系统识别,从而诱导其他Vir 基因的表达.VirD1和VirD2共同作用,由T-DNA右边界开始向左边界切割产生一条T-DNA单链(T-链),T -链5’末端与一分子VirD2结合,其余部分与VirE2结合,组成T-复合体.T-复合体被转移到农杆菌外,通过植物细胞壁上VirB蛋白组成的通道进入到植物细胞内. VirD2和VirE2上的核定位信号被转运蛋白识别,经主动运输过程通过核孔进入细胞核内,在VirD2的帮助下,插入植物核染色体中,完成T-DNA由农杆菌向植物的转移及整合过程[5]. 发根农杆菌的转化过程与根瘤农杆菌类似,只是其中含有的质粒称为根诱导质粒(Ri),其中T-DNA区同样含有与发根农杆菌生成有关的植物激素的合成基因及冠瘿碱合成基因. T-DNA区内的基因表达调控序列与真核生物类似,因而可以不在农杆菌中表达,而在植物中表达.T-DNA整合进入植物细胞染色体后,其中的生长素和细胞分裂素合成酶类基因表达,导致植物细胞大量增殖,形成肿瘤.随着被转化细胞的增殖,T-DNA也被大量扩增,冠瘿碱合成酶类基因拷贝数也随之增加,从而可以合成越来越多的冠瘿碱.冠瘿碱是农杆菌的主要碳源和氮源,其他土壤微生物不能代谢,从而使农杆菌在自然界中为自己赢得了独立的生存空间.二、农杆菌转化系统的发展1.菌株的改造 农杆菌根据转化能力的强弱可分为超毒菌株和普通菌株.超毒菌株是H ood等[6]报道的,他们利用双元载体策略,对农杆菌菌株A281进行了改造.他们构建了两种质粒,一种含有pT iBo542的T-DNA区,另一种含有pT iBo542的其余部分(即pEHA101).进一步的研究结果是从pT iBo542衍生出了两种转化系统:一种是超毒菌株,如EHA101,EHA105;另一种是超双元载体.K omair[7]从pT iBo542中构建了pT OK162超双元载体,并由它衍生出Ptok233.超毒菌株和超双元载体系统后来被人们广泛使用.2.载体系统的发展 天然的T i质粒含有与冠瘿碱代谢有关的基因,T-・61・DNA区内含有生长素和细胞分裂素基因,这些基因在实际应用中是多余的或不利的,因而必须对之改造,方能应用于实际转化操作. 首先是卸甲T i质粒的发明.Z ambryski等[8]将T i质粒T-DNA区中导致肿瘤生成基因去除,制成了卸甲的T i质粒,并将其T-DNA区转入到了植物中.利用卸甲T i 质粒可以使材料转化处不再生成肿瘤,从而获得转基因植株. 农杆菌载体系统分为共整合载体系统和双元载体系统.共整合载体系统包括两个质粒:一个是在农杆菌中T i质粒,含有Vir区和T-DNA区;另一个是在大肠杆菌中的中间载体,可以在体外进行操作.将目的基因插入其中,通过三亲交配实验,在含有辅助质粒的第三种菌株的帮助下,促使大肠杆菌中的中间载体通过结合过程进入农杆菌. Vir区和T-DNA是反式作用的,二者置于两个质粒上而不影响二者的相互作用.根据这一原理,人们构建了双元载体系统,它由两个质粒组成:一个置于农杆菌中,含有Vir区;另一个含有T-DNA区.这个质粒可以作得比较小(10kb左右,因而能利用大肠杆菌方便地进行体外操作.第二个质粒可以通过液氮冻融高效地转入农杆菌中.利用双元载体系统,可以实现载体和任意农杆菌的搭配,有利于找到高效的转化组合. 另外,K omari等[9]发展了另一种双元载体系统.他们把抗生素基因和G US基因分别放在两个T-DNA区上,将两个T-DNA区构建到同一个质粒中.利用含有这个质粒载体的农杆菌LBA4404转化烟草和水稻,两个基因的共转化频率为47%,只含带G US基因T-DNA区和只含带抗生素抗性基因T-DNA区的植株占被转化植株的一半以上.这有助于解决抗生素抗性基因存在于转基因植物中的问题,获得只含有目的基因、屏弃了抗生素抗性基因的转基因植株.3.植物农杆菌转化的发展 农杆菌的天然寄主是双子叶植物,植物的农杆菌转化也就由双子叶植物开始,并取得了一系列成功.已有多种双子叶植物,如烟草、马铃薯、番茄、茄子、大豆、甜菜、拟南芥菜以及十字花科芸薹属植物等被转化成功.对于双子叶植物而言,农杆菌的转化是比较容易的,但是,农杆菌介导的单子叶植物的转化直到20世纪90年代之后才取得一系列进展.目前已经转化成功的有石蒜科、百合科、鸢尾科、薯蓣科和禾本科的植物[5].三、影响农杆菌介导植物基因转化的 因素 Dandekar等[10]在对胡桃的研究中和Martin等[11]在对葡萄的研究中认为影响转化效率的两个重要因素为:用于转染的农杆菌菌株和目标植物受侵染的部位.实际上,农杆菌介导的遗传转化有两个关键过程:农杆菌侵染转化材料及转化材料的再生.各种因素对于转化效率的影响都可以归于对这两个过程的影响,而这两个过程需要相辅相成.下面就影响上述两个过程的诸多因素有关研究进行分析.1.不同属性农杆菌对转化的影响 农杆菌作为植物基因转化的工具,其属性对转化的成功有决定性的影响,这也是长期以来在转化过程中将研究重点放在选择和处理农杆菌的原因.农杆菌依其代谢冠瘿碱的种类可分为章鱼碱型、胭脂碱型、农杆碱型和琥珀碱型等类型,不同的菌种会影响基因转化的效果. 由于农杆菌T i质粒上Vir区编码产物负责接受外界信号、T-DNA的加工、转移及整合等功能,所以该区对菌种的侵染力起决定性作用,因此,农杆菌Vir基因的表达及表达水平的高低直接影响到转化,这也是到目前为止对农杆菌的研究热点仍然集中在Vir基因及其编码产物上的原因. 植物受伤细胞分泌的某些酚类化合物对农杆菌Vir 基因的表达有诱导作用.目前广泛使用乙酰丁香酮、羟基乙酰丁香酮及植物细胞培养液来诱导农杆菌,并在一些转化中取得好的转化效果[12,13].已有实验表明,一些自身不能产生对Vir基因具有高效诱导的酚类化合物的植物,使用乙酰丁香酮能产生较好的效果.同样,在共培养时间短、难以诱导Vir基因表达的情况下,酚类物质的使用可能会产生良好的效果[14].乙酰丁香酮的使用还可以减小植物基因型的差异[15].而在另一些植株的转化上,如草莓等,乙酰丁香酮的使用无效甚至有害[16]. 其他物质对Vir基因有诱导作用,如肌醇[17]、非代谢糖类(2-脱氧葡萄糖、6-脱氧葡萄糖[18]等).采用渗透保护剂甜菜碱和脯氨酸也可以诱导Vir基因的表达[19].此外,不同菌种Vir基因的诱导效果还与诱导培养基的pH有关[20]. 一般说来,农杆菌Vir基因诱导必须注意以下几点:①诱导培养基pH介于5～6之间.②农杆菌培养温度应在28～30℃.③避免在培养基中含有酵母提取物.・71・④培养基中需含有较高的糖浓度.2.植物基因型及外植体对转化的影响 大多数农杆菌能侵染多种植物,但其侵染性因植物种类而不同,有的甚至局限于某种植物的某种基因型.一般认为,基因型的特异性与细胞的生理状态有关,所以在进行转化之前必须对植物的基因型进行选择.在莴苣、拟南芥、马铃薯的转化中,基因型的差异表现比菌种的差异大.来源于植物的不同外植体及同一外植体的不同发育阶段对农杆菌的侵染具有不同的敏感性.总的说来,分生组织及伴有活跃细胞分裂的外植体对农杆菌的侵染最为敏感.幼叶、幼胚、茎尖顶端分生组织、小孢子、愈伤组织、悬浮细胞培养物等均可作为外植体.一般认为,幼嫩的外植体比老的外植体好.杨广东等[21]以大白菜3d苗龄带柄子叶为外植体,经根癌农杆菌介导,将修饰的豇豆胰蛋白酶抑制剂基因(sck)导入大白菜自交系“G P-11”和杂交种“中白4号”,并获得了对菜青虫具有一定抗性转基因植株.欧阳波等[22]通过根癌农杆菌介导转化番茄下胚轴,将外源双价基因导入番茄,获得了一批卡那霉素抗性苗.研究表明,番茄下胚轴是良好的遗传转化受体.烟草细胞看护培养能够提高外植体的转化效率和减少农杆菌对外植体的污染.从实际情况看,农杆菌感染外植体主要在切口部位,即使较老的外植体,其切口细胞受伤后,在内外源激素的作用下,转化成具有分生能力很强的细胞团.例如,有些外植体经预培养后,由于植物细胞启动脱分化,再与农杆菌共培养,对农杆菌侵染的敏感性增强,其受农杆菌侵染的细胞年龄就不能依据其外植体进行判断.当然对于外植体的发育阶段的确定是必要的.张建全等[23]对马铃薯反义AcInv基因,经农杆菌介导入生产上推广的9个普通四倍体栽培种,对影响转化的各个因素进行了优化研究.结果表明,在愈伤组织诱导过程中,外植体的预培养为:茎段2d,叶盘3d效果较好;茎段和叶盘侵染时间分别达8min和10min时转化率较高;外植体与农杆菌共培养时间分别为2d和3d时,茎段和叶盘的转化率较高;各个品种的外植体在卡那霉素抗性培养基上均能形成愈伤组织,但只有1号(“大西洋”)最后从愈伤组织上产生苗,形成正常植株,其再生率为11.2%,聚合酶链反应(PCR)扩增检测表明,大部分转基因植株为阳性.另外判断某种植物对农杆菌侵染的敏感性,不能纯粹以一种或几种外植体来判断,必须研究尽可能多的外植体类型.以木薯胚状体萌发出的子叶为外植体,获得很高的瞬时表达[24].从组培角度来讲,所选的外植体必须具有较高的分生能力、脱性强的细胞.3.再生植株的细胞起源对转化的影响 成功转化的关键是将外源基因导入那些具有脱性强的细胞.农杆菌介导的转化方法主要作用于表层细胞,如果细胞起源于深层,则很难得到转化株,即使得到转化株,其转化频率也很低,且转化株表现为嵌合体,这就是所谓再生与转化的矛盾.在油菜的转化中Mukho2 padhyay[25]等发现以胚轴切段为外植体很容易得到转化体,而以子叶为外植体则相当困难.解剖学研究表明,同样起源于维管束薄壁细胞的芽的发生方式有两种:一种是位于切面的维管束薄壁细胞先产生愈伤组织,然后产生芽;另一种是芽直接离从切面450～625μm的维管束细胞不经愈伤而直接形成芽.以胚轴切段为外植体,两种再生方式都存在,而只能以第一种方式获得转基因植株.而以子叶为外植体,只能通过第二种方式再生植株,从1000个外植体中只得到两株嵌合的转化株.以此推测,在子叶外植体中,由于具有再生能力的细胞团距离切口较远,细菌较难感染这些细胞,因而影响转化株的获得.柳建军[26]等研究建立了一套简单、高效的辣椒遗传转化系统.利用根癌农杆菌介导的带柄子叶转化法将豇豆胰蛋白酶抑制剂(C pTI)基因转入辣椒栽培品种益都羊角椒中获得转C pTI基因植株.杨广东[27]等以12～14 d苗龄的甜椒带柄子叶为外植体,经根癌农杆菌介导,将修饰的豇豆胰蛋白酶抑制剂基因(sck)导入甜椒杂交种“中椒5号”和常规种“茄门”中,室内离体叶片饲虫和田间自然抗虫性鉴定进一步证明,转基因植株对棉铃虫具有一定抗性.木薯的转化中,幼叶外植体切口细胞对农杆菌比较敏感,且能从幼叶诱导高频的胚状体的发生,但以此系统为基础的转化没有得到转化株,其原因是切口部位受细菌感染的细胞,只能呈现愈伤生长,而胚状体起源于离切口一定距离的内层维管束细胞,细菌难达到这些细胞,因而也难得到转化株[28].4.培养方法对转化的影响 转化所用的组培不同于纯粹的组织培养方法.农杆菌介导的转化要经过几个步骤:外植体接种农杆菌、与农杆菌共培.外植体在含抑制农杆菌及筛选转化体的药剂的培养基上培养,要受到农杆菌和药剂的胁迫.因此为保证转化细胞的生长,必须:①合理掌握接菌的数量、时间和共培的时间,注意解决瞬时表达效率高及随后而来的细菌增殖所导致的外植体不能生长的矛盾.有些植物外植体生长易受农杆菌侵染后的抑制,还有些嫩的外植体经农杆菌侵染后不能生长[29].②采用预培的方法以减轻伤害胁迫,调整细胞状态.预培养还有可能减少・81・伤害胁迫而有利于农杆菌的感染[23].③采用化学药剂缓解胁迫对外植体生长的抑制.硝酸银是抑制乙烯生成的抑制剂,具有促进形态发生的功能,所以在油菜转化的培养基中加入较高浓度的硝酸银(70～90nm olΠL)就能提高再生频率,且是在选择条件下获得转化体的必要条件[25].在葡萄的转化中,旺盛生长的胚性愈伤组织在接种农杆菌后,生长受抑制,组织褐化以至细胞死亡,据测试,这是细胞的过氧化造成的.后来有人用抗氧化剂DTT (dithiothreitol)和PVPP(polyvinypolypyrrolidone),可使被侵染的细胞恢复生长,有高达63%的外植体能产生胚状体,进而获得转化株[29]. T aylor等[30]通过改变木薯次生胚状体诱导的培养基,以G D基本培养基代替MS培养基,以Picoram代替2、4-D,经反复继代,获得一种脆性愈伤,以这种愈伤为外植体,采用基因枪法获得了转化株[31].以木薯体细胞胚状体萌发出的子叶为外植体能诱导器官发生并再生植株,且由于细胞源于切口及其附近部位[32],采用结合农杆菌介导的转基因方法业已成功地获得了木薯的转基因株[24].5.不同选择药物对转化效率的影响 由于在植物基因转化中,外源基因稳定的整合频率低,故如何选择适当的筛选标记,以准确、有效地分离转化与非转化细胞,且不干扰细胞的正常生长,也不干扰再生植株的产生,是转化成功的重要环节之一.转化常用的筛选标记有:新霉素磷酸转移酶(NPTII)、潮霉素磷酸转移酶(HPT或HPH)、PPT乙酰基转移酶(PAT)及二氢叶酸还原酶(DHFR)等基因. 杨广东等[33]在培养基中添加不同浓度的卡那霉素、头孢霉素和羧苄青霉素,观察抗生素对大白菜基因型G P -11种子发芽以及离体子叶再生的影响.结果表明,G P -11种子在含有200mgΠL卡那霉素的MS培养基上发芽生长时,幼苗子叶完全黄化,侧根数为0;随卡那霉素浓度的增加,芽、主根和侧根生长均受到一定程度抑制,但发芽率和发芽势不受影响.4d苗龄的离体子叶在含有10mgΠL卡那霉素并附加一定激素的改良MS培养基生长时,基本无绿芽诱出,在含7.5mgΠL和5mgΠL卡那霉素的培养基中,诱导的绿芽率只有32.5%和40.2%;在仅含3mgΠL卡那霉素的生根培养基中,小苗完全丧失生根能力.在添加浓度高至400mgΠL的头孢霉素或羧苄青霉素的诱芽培养基中,G P-11诱芽率为0,且它们之间差异不明显,但在添加头孢霉素或羧苄青霉素的生根培养基中,小苗生根依然正常.试验结果表明,在农杆菌介导的基因转化中,对大白菜转化苗筛选的卡那霉素浓度在10mgΠL左右是适宜的,添加的抑菌剂浓度在能控制农杆菌生长的同时,尽量降低浓度,最好不超过400 mgΠL;在诱导生根培养基中,卡那霉素浓度不宜超过3mgΠL.另外,对T0代转基因种子进行遗传分析时,在发芽培养基中添加卡那霉素浓度应该达到200mgΠL. NPTII作为一种选择标记基因,可用于多种作物的转化,其中筛选中常用的抗生素为卡那霉素和geneticin.某些单子叶植物能耐高浓度的卡那霉素,一般用geneti2 cin进行筛选.然而玉米的转化以200mgΠL的卡那霉素筛选时,仍能得到转化株[34].在水稻的转化中,卡那霉素筛选会干扰绿色植株的再生,而用庆大霉素则得到转化的绿苗,绝大多数对潮霉素比对卡那霉素敏感,潮霉素用于禾谷类作物的转化比卡那霉素效果好.PAT可用于单子叶植物及双子叶植物的筛选.植物细胞对叶酸类似物MTX(metholtreate)非常敏感.该化学物质主要抑制植物DHFR,而从大肠杆菌质粒R67分离得到的DHFR对MTX不敏感,将该基因转入烟草细胞后,再生的植株能抗MTX.采用该选择标记已获得小麦的抗MTX转基因株[35]. 另外,为了证实已经获得转基因植株,近几年人们一般不只是单一地采用抗生素标记,而是结合其他手段予以证实.如杨广东等[21]将修饰的豇豆胰蛋白酶抑制剂基因(sck)导入大白菜自交系“G P-11”和杂交种“中白4号”,并获得了卡那霉素抗性植株.PCR检测和S outhern blot杂交证实,sck基因已整合进大白菜基因组中;豇豆胰蛋白酶抑制剂活性检测表明,大部分转基因植株都对牛胰蛋白酶有一定的抑制活性.室内离体叶片饲虫和田间自然抗虫性鉴定进一步证明,转基因植株对菜青虫具有一定抗性.武东亮等[36]构建了人工合成的G FM CryIA 杀虫基因和经过修饰的C pTI基因的融合杀虫基因高效植物表达载体p G BIF4ABC.通过农杆菌介导的叶盘法转化烟草,获得42株卡那霉素抗性植株,用棉铃虫杀虫实验检验表明具有抗虫性.对其中7株烟草植株进行PCR 和S outhern印迹,4株烟草基因组中有融合杀虫基因的整合,为转基因植株.其中2株的抗虫性为高抗,1株中抗,1株不抗.6.叶绿体转化与细胞核转化的不同影响 近20年来,外源基因向核中转化一直是转基因的主要方向,然而,随着研究的不断深入,人们发现核转化有很多弊端,如核基因组大、背景复杂,外源基因整合位点和整合拷贝数难以控制,易出现基因失活、基因沉默、位置效应等现象[37].自1988年有些学者相继开展了叶绿体遗传转化研究,使这项新的遗传转化技术的优越性・91・和发展前景日益为人们所认识并受到重视.到目前为止,已经在烟草[38]、水稻[39]、拟南芥[40]、马铃薯[41]和油菜[42]等植物中实现了叶绿体的转化,这一转化系统已开始成为植物基因工程中的新的生长点.四、结束语 农杆菌是天然的遗传工程师,自1983年被首次用于烟草基因转化以来,农杆菌已经广泛应用于高等植物的转化.目前由农杆菌介导的转基因植物已扩展到经济作物、粮食作物、蔬菜、花卉、药用植物、水果、树木及牧草等,有些已经实现了商品化,在改良植物的遗传性状方面发挥了重要作用[43].但是,农杆菌转化外来基因到植物体内是一个复杂的过程,目前有一些重要的作物或者它们的重要品种仍然不能用农杆菌来转化,或者转化效率太低.可以预见,随着对农杆菌感染机制的进一步阐明,影响农杆菌转化的因素进一步明朗化,人们按照自己的愿望设计未来作物将不再是梦想,遗传转化技术在植物分子改良以及分子生物学的研究中,也将会有更多的应用、更多的新突破.(2002年7月4日收到)刘石泉　硕士生,上海师范大学生命与环境科学学院,上海200234余沛涛　副教授,上海师范大学生命与环境科学学院,上海2002341　刘谦,朱鑫泉.生物安全.北京:科学出版社,2001:452462　M etcalfe D.D.,Astw ood J.D.,T ownsend R.,et al.Assessment of the allergenic from genetically engineered crop plant.Critical Reviews in Food Science and Nutrition,1996;36:S16521863　S imm M.G erman geneticists get s ome relief.Science,1994;263(7):23 4　陈祯.高等植物转基因研究.生物学通报,2002;3(8):6285　徐春晖,夏光敏,贺晨霞.农杆菌转化系统研究进展,2002;14(4): 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