荧光定量PCR检测乙肝病毒-DNA的临床意义

实时荧光PCR检测在乙型肝炎病毒DNA检测方面的临床意义邹敏【摘要】目的对采用血清学标志物检测确定为乙型肝炎的患者进行实时荧光PCR 检测,探讨实时荧光PCR检测的临床应用价值.方法对乐昌市人民医院自2007年7月到2009年12月门诊及体检中心进行血清学标志物检测(HBV-M)诊断为阳性的乙型肝炎患者336例,采取实时荧光PCR检测,对其结果进行分析.结果大部分乙型肝炎患者定量PCR检测HBV-DNA的结果与HBV血清学标志物检测结果一致.大三阳、小三阳患者血清中PCR结果拷贝数均较高,而HBsAb(+)或HBsAg(-)的标本PCR有个别阳性结果,但其拷贝数很低.结论实时荧光PCR检测HBV-DNA在判断体内HBV是否在复制,复制程度以及HBV血清学标志阴性肝炎患者的诊断方面,较优于血清学标志物检测,值得临床推广.【期刊名称】《中国医药指南》【年(卷),期】2010(008)019【总页数】2页(P196-197)【关键词】乙型肝炎病毒;实时荧光PCR;DNA;临床意义【作者】邹敏【作者单位】广东省乐昌市人民医院检验科,512200【正文语种】中文【中图分类】R512.6+2目前肝炎病毒至少有5型。

在肝炎病毒当中，乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)危害性最大，其传播广泛，易形成持续性带病毒状态或转变为慢性感染，少数可演变为肝硬化、原发性肝细胞癌。

因此，准确、快速诊断HBV的感染情况对于防治乙型肝炎极为重要。

HBV基因组为双股环状DNA，考虑到HBV-DNA是直接反应HBV存在、活动性复制及具有传染性的可靠指标，本研究采用实时荧光PCR法进行HBV-DNA检测共336例，报道如下。

1 材料和方法1.1 标本来源本组为乐昌市人民医院从2007年7月至2009年12月门诊及体检中心进行血清学标志物检测(HBV-M)为阳性的乙型肝炎患者336例，其中男171例，女165例，16～83岁，平均为56岁。

实时荧光PCR检测乙肝病毒DNA的临床意义目的用实时荧光定量PCR检测乙型肝炎患者HBVDNA结果进行分析,以探讨其临床诊疗意义。

方法对850例临床标本用时间分辨荧光免疫技术定量测定乙肝病毒血清学指标,用荧光定量PCR法检测血标本中的HBVDNA,并依据乙肝两对半结果进行归类分组。

结果302份HBsAg(+)、HBeAg(+)、HBcAb(+)标本中有261份HBVDNA为阳性,阳性率为86.4%,其PCR定量拷贝数为(2.21±0.76)×107/ml;321份HBsAg(+)、HBeAb(+)、HBcAb(+)标本有96份HBVDNA 阳性,阳性率达到29.91%,PCR定量拷贝数为(1.69±0.98)×106/ml;32份HBsAg(+)、HBcAb(+)标本中有9份HBVDNA为阳性,阳性率为28.13%,28份HBeAb(+)、HBcAb(+)标本有4份PCR HBVDNA阳性,阳性率14.29%;11份HBcAb(+)标本有6份PCR HBVDNA阳性,阳性率为42.9%;74份HBsAb(+)、HBeAb(+)、HBcAb(+)标本有5份HBVDNA阳性,阳性率6.75%;13份HBsAb(+)、HBeAb(+)阳性标本有2份PCR HBVDNA阳性,阳性率为14.3%;12份HBsAb(+)、HBcAb(+)标本有1份HBVDNA阳性,阳性率7.69%;4份HBsAb(+)的标本HBVDNA均为阴性,PCR 定量拷贝数为<1.00E×103;24份HBsAg(+)、HBsAb(+)、HBeAg(+)、HBcAb(+)标本中有21份HBVDNA为阳性,阳性率为87.50%;1份HBsAg(+)标本HBVDNA 均为阳性,阳性率为100%;10份HBsAg(+)、HBsAb(+)、HBeAb(+)、HBcAb(+)标本有3份HBVDNA均为阳性,阳性率30.00%,其余38例全阴性结果和各少见模式基本见有HBVDNA的检出。

实时荧光PCR在乙肝病毒DNA检测中的临床意义目的对采用血清学标志物检测确定为乙型肝炎的患者进行实时荧光PCR 检测，探讨实时荧光PCR 检测的临床应用价值。

方法首先要对患者采用血清学标志物这种方法检测，进一步确定他是乙型肝炎的患者。

再次就是选择500例患者进行检测，这样有利于保证实验的准确性。

结果几种乙肝模式中，“大三阳”患者的DNA阳性检出率和拷贝数均比其他模式高，并有显著性差异。

PreS1-Ag的阳性率与乙肝DNA的阳性率有很好的一致性，但由于两者检测的成分和表达的意义不完全一致，因此不能等同于或代替HBV-DNA的检测。

结论PCR定量测定H13V-DN13可以真实反映体内乙肝病毒感染和复制及病毒载量情况，更有利于临床治疗和疗效观察。

标签：乙型肝炎病毒；实时荧光PCR；DNA；临床意义乙肝是目前世界上最常见、最广泛、危害最严重的病毒性肝炎之一，其传播广，危害性较大，易形成持续性带病毒状态而转为慢性感染，少数甚至转变为肝硬化一、原发性肝细胞癌。

荧光PCR技术融合了PCR和DNA探针杂交技术的优点，解决了PCR定量和防污染等问题，而且具有快速、准确、特异等特点。

本研究采用实时荧光PCR法进行HBV-DNA检测共500例，报道如下。

1、资料与方法1.1一般资料首先选择可能携带乙型肝炎的患者，这些患者最好是年龄跨度较大，在15一70岁的年龄段中都有患者存在，这样更有利于实验的准确}h}，防止出现偏差。

然后采用血清学标志法进一步确定他们是乙肝患者，这样可以使实验结果的偏差较小。

最重要的是要记录好乙型肝炎患者中乙肝病毒DNA的数据，并且要注意保存仔细。

然后将这500位乙肝病毒携带者和患者，再用荧光PCR的方法对其进行检测，然后仔细记录这些数据。

最后把用血清学标志法检验的乙肝病毒DNA 数据与用荧光PCR方法检验的乙肝病毒DNA数据做比较，然后把比较的数据进行分析，并用论文的形式呈现出来。

1.2 方法1.2.1 试剂和仪器乙肝血清标志物检测试剂盒来自兰州标佳生物技术有限公司，批号分别为：表面抗原20081206，表面抗体20090302，E抗原20090201，E抗体20081104，核心抗体20090201，前S1抗原为20081002；HBV-DNA试剂购于中山大学达安基因股份有限公司；酶标仪为上海瑞美公司MultisKanMK3；PCR仪为中山大学达安基因股份有限公司核酸扩增实时荧光检测系统DA7600型。

１８６实时荧光ＰＣＲ检测乙肝病毒ＤＮＡ的临床效果分析张明跃乙型肝炎的主要感染源即乙肝病毒感染，该疾病在我国的发病率及传染率均较高。

有研究显示，大约２０％急性乙肝患者会逐渐转变为慢性乙肝，严重时可能转化为肝癌或者肝硬化，因此快速且准确地判断乙肝有利于该疾病的治疗和预后。

乙肝病毒血清标志是检测该疾病最常见的指标，可反映患者的免疫反应状态。

有研究显示，定量检测乙肝病毒ＤＮＡ可准确判断乙肝传染性，能判断此病毒感染的不同复制状态。

实时荧光ＰＣＲ检测弥补了传统ＰＣＲ假阳性的缺点，可定量检测乙肝病毒ＤＮＡ，并为乙肝的抗病毒治疗提供有效的疗效评估。

基于此，本研究对实时荧光ＰＣＲ用于乙肝病毒ＤＮＡ检测中的临床效果进行分析，提临床诊断提供参考依据。

１ 资料及方法１．１ 临床资料选择２０１７年５月—２０１８年１０月至我院检查的肝病变患者５００例，另选择５０例体检健康，收集其血液样本，均采取荧光定量ＰＣＲ检测。

研究前须对本研究相关人员详细说明情况。

１．２ 方法仪器及相关试剂选择：乙肝血清标志物酶联免疫吸附实验试剂盒、ＦＱ－ＰＣＲ　试剂盒（购于湖南圣湘生物科技有限公司）、扩增仪（购于上海宏石医疗科技有限公司）、洗板机（北京普朗的ＤＮＸ－９６２０Ｇ）、酶标仪（北京普朗ＤＮＭ－９６０６）、荧光定量　ＰＣＲ　检测仪（购于美国　ＢＩＯ－　ＲＡＤ　公司；型号为ＢＩＯ－ＲＡＤ　ｉｃｙｃｌｅｒ）取肝病患者及体检健康者清晨空腹状态的静脉血５ｍＬ，将其装入灭菌的一次性真空塑料管，血液标本进行实时荧光ＰＣＲ检测。

血液标本离心处理后取血清１００　μＬ置于－２０℃环境保存备用，并提取乙肝病毒ＤＮＡ，在乙肝病毒模板中倒入ＰＣＲ的反应液，均匀混合后置于毛细管中，设置阳性对照、阴性对照和空白管。

将其放入荧光定量检测仪中进行ＰＣＲ扩增，温度调控至５０℃，激活其ＵＮＧ，温度调至９３℃，预变性２　ｍｉｎ，在９３℃５　ｓ，６０℃３５　ｓ，共４０个循环。

在此期间，模板工作电压控制在２２０±２２　Ｖ，温度需控制在３０℃￣９９℃之间。

乙肝两对半定量检测的临床意义血清乙肝标志物（两对半）定性测定始于80年代中期，对乙肝的疾病诊断、病程监测、疗效观察起到了一定的作用。

随着临床医学的迅速发展，定性检测已远远不能满足临床及患者的要求。

由于受检测抗原抗体定性结果不是“阳性”就是“阴性”，无法动态观察病情和疗效的变化，所以，为临床所能提供的信息有限。

随着检验医学的发展，\两对半\定量测定成为可行，大大弥补了酶标（elisa）定性检测的不足。

同时，两对半的定量检测可与血清hbv－dna荧光定量pcr测定相互补充，综合评价患者病情与药物疗效。

一、两对半定量检测极大的提高了检测的灵敏度。

化学发光免疫技术检测hbsag灵敏度可达0.1ng/ml，而酶标（elisa）检测hbsag的灵敏度达到2ng/ml酶标才会呈阳性。

1、急性乙肝早期：定量能够及早验出hbsag，推定hbv病毒感染，几乎能够与pres1同时检测，在病程观测中大大缩短了\窗口期\时间，而酶标检测在乙肝早期检测往往hbsag呈圆形阴性。

2、慢性乙肝：一些患者由于机体常缺少对hbv包膜蛋白的免疫系统接收者，hbsag抒发较低，酶标检测可以发生hbsag和hbsab均阴性的情况，而定量检测则可避免这些情况的发生,为恰当推论病情提供更多依据。

3、如病毒发生变异后，表达量较低，常规elisa测不出抗原，而定量检测具有极高的灵敏度，可发现并极有可能同时检测出hbsag和hbsab。

国内外学者研究表明hbsag的免疫应答与肝细胞损伤有一定关系。

血清中hbsag含量和病人对hbsag细胞免疫成反比关系，而肝功能改变则与此种细胞免疫成正比。

定量hbsag是反映这一关系的唯一手段。

4、可以辨认出低浓度的hbsag携带者。

特别就是一些群体例如医护工作者、病人家属等，由于长期密切接触，但又非轻易经血传播病毒感染成急性乙肝，而是长期少量病毒感染，并提振机体产生一定的免疫力，可能将呈圆形低浓度病毒感染，特别应引发人们的足够多注重，紧密高度关注并采取措施避免发展成乙肝或慢性携带者。

两种荧光定量PCR试剂检测HBV-DNA的比较与评价HBV-DNA是指乙型肝炎病毒的DNA，乙型肝炎是一种常见的传染病，严重者可发展为肝硬化和肝癌。

对HBV-DNA进行准确快速的检测对于乙型肝炎的预防和治疗非常重要。

目前，常用的HBV-DNA检测方法之一就是荧光定量PCR法。

本文将对比两种常用的荧光定量PCR试剂对HBV-DNA的检测效果进行评价，以期为临床实验提供参考依据。

一、试剂介绍1. 荧光定量PCR试剂A荧光定量PCR试剂A是一种常用的商业试剂，根据厂家说明书得知，该试剂的检出限为10 IU/ml，检测范围为10-10^8 IU/ml，重现性良好，适用于临床检测。

二、检测原理荧光定量PCR是一种利用PCR技术和荧光探针技术相结合的方法，可以对DNA进行高灵敏度的定量检测。

在HBV-DNA检测中，荧光定量PCR试剂会通过特定的引物和探针对乙型肝炎病毒的DNA进行扩增，并利用荧光信号来定量检测目标DNA的含量。

三、检测结果比较与评价1. 灵敏度比较通过对同一份样本分别使用试剂A和试剂B进行检测，发现试剂A的检出限明显低于试剂B。

在实际应用中，对于低水平的HBV-DNA，试剂A的性能表现更为优越，可以更精准地检测出病毒载量较低的患者。

2. 稳定性比较在长期使用过程中，试剂A和试剂B的稳定性表现出一定的差异。

试剂A在不同存储条件下的试剂稳定性较好，能够保持较长时间的高灵敏度和准确性；而试剂B在长期使用后，可能会出现一定程度的灵敏度下降，需要更频繁地更换试剂批次以保证结果的准确性。

在进行多次重复检测实验后，发现试剂A和试剂B的重现性表现相当，均具有较好的重现性。

这表明无论是试剂A还是试剂B，都可以在不同实验条件下保持较高的结果稳定性，可以满足临床实验的需求。

四、总结与展望通过对试剂A和试剂B的检测结果比较与评价，我们可以得出结论：试剂A相对于试剂B在HBV-DNA定量检测中具有更高的灵敏度和更好的稳定性，能够更准确、更快速地检测出乙型肝炎病毒的DNA含量。