下载文档原格式
基因克隆的技巧
基因克隆是生物学研究中常用的技术之一，它可以将感兴趣的基因从一个生物体中复制到另一个生物体中。
以下是基因克隆的一些常见技巧：
1. DNA提取：从源生物体中提取目标基因的DNA。
常见的方法包括溶解细胞膜、蛋白质降解和碱解。
2. 剪切和黏贴：利用限制酶（也称为内切酶）剪切目标DNA，并在相应的酶切位点上黏合连接，形成重组DNA。
3. DNA扩增：通过聚合酶链式反应（PCR）或其他扩增方法，复制目标DNA 片段，以获得足够数量的DNA进行后续实验。
4. 重组载体构建：将目标DNA插入载体DNA，形成重组载体。
载体可以是质粒、噬菌体或其他类型的DNA。
常见的方法包括限制酶消化和连接、启动子和终止子的选择，以及DNA酶切和黏接。
5. 转化：将重组载体导入宿主细胞。
常见的方法包括化学法、电穿孔法和基因枪法。
6. 筛选：使用适当的筛选标记（例如抗生素抗性基因）鉴定并筛选成功转化的细胞。
7. 分离和培养：分离并培养选出的转化细胞，以获得包含目标基因的克隆。
这些技巧在基因克隆中被广泛使用，但具体的操作和条件可能会因实验需求和研究对象而有所不同。
DNA分子克隆技术（也称基因克隆技术）：在体外将DNA分子片段与载体DNA片段连接，转入细胞获得大量拷贝的过程中DNA分子克隆(或基因克隆)。
其基本步骤包括：制备目的基因→将目的基因与载体用限制性内切酶切割和连接，制成DNA重组→导入宿主细胞→筛选、鉴定→扩增和表达。
载体（vecors）在细胞内自我复制，并带动重组的分子片段共同增殖，从而产生大量的DNA分子片段。
主要目的是获得某一基因或NDA片段的大量拷贝，有了这些与亲本分子完全相同的分子克隆，就可以深入分析基因的结构与功能，随着引入的DNA片段不同，有两种DNA库，一种是基因组文库（genomic library）,另一种是cDNA库。
载体所谓载体是指携带靶DNA片段进入宿主细胞进行扩增和表达的工具。
细菌质粒是一种细菌染色体外小型双链环状结构的DNA，分子大小为1-20kb，对细菌的某些代谢活动和抗药性表型具有一定的作用。
质粒载体是在天然质粒的基础上人工改造拼接而成。
最常用的质粒是pBR322。
基因库的建造含有某种生物体全部基历的随机片段的重组DNA克隆群体，其含有感光趣的基因片段的重组子，可以通过标记探针与基因库中的重组子杂交等方法而筛选出来，所得到的克隆经过纯化和扩增，可用于进一步的研。
其主步骤包括：（1）构建基因库迅速的载体；(2)DNA片段的制备；（3）DNA片段与载体DNA 的连接；（4）包装和接种。
cDNA库的建造是指克隆的DNA片段，是由逆转录酶自mRNA制备的cDNA。
cDNA库包括某特定细胞的全部cDNA克隆的文库，不含内含子。
特异基因的筛选常用的方法有：（1）克隆筛选即探针筛选法；（2）抗体检测法，检测其分泌蛋白质来筛选目的基因；（3）放射免疫筛选法，查出分泌特异抗原的基因；（4）免疫沉淀法，进行特异基因的筛选。
核酸序列测定DNA的碱基序列决定着基因的特性，DNA序列分析（测序，sequencing）是分子生物学重要的基本技术。
基因克隆与表达及功能鉴定研究在现代生命科学领域中，基因克隆与表达以及功能鉴定是非常重要的研究方向之一，它涉及到许多生物医学、农业、工业和环境等领域的研究和实际应用。
本文将从基因克隆与表达的基本原理、方法、技术和应用，以及功能鉴定的原理、方法、技术和应用等方面进行探讨。
一、基因克隆与表达基因克隆是指通过分子生物学技术，将含有某个或某些特定基因的DNA序列从一个大的DNA分子（如染色体）中分离出来，然后插入到特定的载体DNA中，形成重组DNA分子的过程。
基因表达是指基因信息的转录和翻译过程，将基因的DNA序列转录成RNA分子，然后翻译成蛋白质分子的过程。
基因表达是生物体形成和发展的基础，也是生命活动的重要表现形式。
1. 基因克隆原理基因克隆的主要原理是利用限制酶、DNA连接酶、DNA聚合酶以及质粒或噬菌体等DNA载体的特性，将特定DNA序列插入到载体DNA中，形成重组DNA分子。
限制酶是一种能够识别、切割DNA分子特定序列的酶，其识别序列具有一定的特异性。
DNA连接酶是一种能够连接两个DNA分子的酶，常用的有T4 DNA连接酶和快速连接酶等。
DNA聚合酶是一种能够在DNA模板上合成互补链的酶，其作用是在重组DNA分子中完成互补链的合成。
2. 基因克隆方法基因克隆的主要方法有限制性片段长度多态性（RFLP）分析、聚合酶链式反应（PCR）克隆、原核表达克隆和真核表达克隆等。
RFLP分析是一种利用限制酶对DNA序列进行切割，并根据不同的RFLP位点进行区分的方法，其主要应用于基因型鉴定和进化研究等领域。
PCR克隆是一种利用PCR技术扩增目标基因或DNA片段，并将扩增产物克隆到载体DNA中的方法，其主要应用于基因检测、DNA测序和分子克隆等领域。
原核表达克隆是一种利用质粒或噬菌体等原核生物作为DNA载体，将外源基因转入细菌或古细菌等原核生物细胞中，通过蛋白质表达实现基因功能研究的方法。
真核表达克隆是一种利用真核生物（如哺乳动物、鸟类、昆虫、线虫等）作为DNA载体，将外源基因转入具有表达能力的真核细胞中，通过蛋白质表达实现基因功能研究的方法。
一、CDNA基因克隆的基本原理CDNAplementary DNA）是DNA的互补序列，通过反转录酶将mRNA作为模板合成的一种DNA。
CDNA基因克隆是利用逆转录酶将mRNA逆转录合成cDNA，并通过PCR或其他方法将cDNA插入到质粒载体中，实现对目标基因的克隆。
二、CDNA基因克隆的流程1. RNA提取：首先需要从细胞中提取出总RNA，可以使用TRIzol等试剂进行RNA的提取纯化工作。
2. 反转录合成cDNA：将提取得到的RNA作为模版，利用逆转录酶进行cDNA的合成。
反转录反应通常包括RNA模版、随机引物、dNTPs、逆转录酶和缓冲液，并经过一系列温度循环反应，将mRNA 逆转录成cDNA。
3. cDNA纯化：为了避免反转录反应中产生的非特异性产物和杂质，需要对反转录反应产物进行纯化。
4. cDNA扩增：对cDNA进行PCR扩增，以获得目标基因的cDNA 片段。
PCR反应体系包括cDNA模板、引物、dNTPs、Taq聚合酶和缓冲液，通过一系列温度循环反应，扩增目标基因cDNA片段。
5. 酶切与连接：将PCR扩增得到的cDNA片段与质粒载体进行酶切，并在两者的黏端上连接。
6. 转化：将连接得到的质粒转化入大肠杆菌等细菌中，使其进行复制。
7. 筛选与鉴定：通过筛选和鉴定，选出携带目标基因cDNA片段的质粒，进行测序和分析，最终确定目标基因序列。
三、CDNA基因克隆的应用CDNA基因克隆技术已广泛应用于基因克隆、基因表达等多个领域。
在科研领域中，通过CDNA基因克隆技术可以方便快捷地获得目标基因的cDNA，实现对目标基因的研究和功能分析；在医药领域，CDNA基因克隆技术也被应用于基因治疗、蛋白表达等方面。
总结：CDNA基因克隆是一种重要的基因工程技术，通过反转录酶合成cDNA并将其插入到质粒中，可以方便地获取目标基因序列，具有广泛的应用前景。
掌握CDNA基因克隆的基本原理和流程对于开展相关实验研究具有重要意义。
基因工程的基本步骤
基因工程是一种利用生物技术手段来改变或调节生物体
自身基因表达的方法，从而达到改善生物体性状的目的。
其基本步骤可以概括为以下几个方面：
1. 基因克隆
基因克隆是基因工程学的基础技术之一。
首先要从生物
体的DNA中选取目标基因，并将其放入载体中，然后进行转化，使其进入宿主细胞中并被表达出来。
常用的克隆方法是PCR、
限制酶切和连接等。
2. 基因转染
基因转染是指将已构建好的目标基因载体导入到目标细
胞中，使其发生基因表达和突变。
目前常用的转染方式有病毒介导转染、转染剂克服细胞膜屏障、电穿孔和微射流等。
3. 基因突变
基因突变是一种常用的基因工程手段。
通过改变基因的
序列或结构，使其在生物体内表达的蛋白质产生变异，从而实现对生物体性状的改变。
突变方法包括化学诱变、定向突变等。
4. 基因表达
基因表达是指将生物体中的目标基因导入到宿主细胞中，并使其在细胞中高效表达的过程。
通过各种方式（如新增启动子序列、加强mRNA稳定性、引入信号肽等）来提高基因表达
效率。
5. 基因分析
基因工程完成后，需要进行基因的分析和检验，以确保
目标基因已成功表达且维持了稳定性。
常用的基因分析方法包括PCR、南方杂交、Western blot和质谱分析等。
总之，基因工程是一种综合使用多种生物技术手段的专业技术，它可以很好地提升生物体的性状和生命活力，为人类的健康和福祉做出贡献。
基因工程操作技术及原理之基因克隆1．克隆已知序列的基因根据已知基因的序列设计引物(primer)，利用PCR方法克隆基因。
即使不同种属之间，基因编码区序列的同源性高于非编码区的序列。
在某种植物的同源基因被克隆的条件下，可先构建eDNA文库或基因组文库，然后以该基因(或部分序列)为探针来筛选目的基因的克隆。
2．功能克隆根据基因的产物蛋白质克隆基因，利用这种方法分离基因，首先应根据已知的生化缺陷或特征确认与该功能有关的蛋白质，再分离纯化这一蛋白并制备相应抗体；或测定其氨基酸序列，推测可能的mRNA序列，根据mRNA序列设计相应的核苷酸探针或寡核苷酸引物。
利用抗体或核苷酸探针筛选基因组DNA文库或cDNA文库，也可利用寡核苷酸引物对核D NA或cDNA进行PCR扩增。
通过对阳性克隆或PCR扩增产物的序列分析鉴定分离基因。
3．作图克隆作图克隆又称图位克隆，是随着分子标记图谱的建立而发展起来的基因克隆技术。
根据连锁图谱定位的基因来克隆目的基因。
作图克隆是从连锁标记出发，通过大片段克隆(BA C库或YAC库)的染色体步移(chromommewalking)到达靶基因。
4．表型差异克隆利用表型差异或组织器官特异表达产生的差异来克隆基因，对于有些植物的性状，既不了解它们的基因产物也没有对它们进行基因定位，但已知它们的表型存在差异，利用这些差异，用下述方法也可克隆植物基因。
(1)消减杂交法即消减杂交法(subtractive hybridization)是通过鉴定两个mRNA间差异而分离基因的方法。
其基本方法是：提取两种差异细胞或组织的DNA后，反转录合成c DNA，并用限制性内切核酸酶切割成小片段。
将其中一个样品的酶切产物分成两份，分别连接不同的含有特定酶切位点的40bp左右的寡核苷酸接头，作为检测者(tester)。
用另外一个样品过量的酶切产物作为驱动者(driver)与带有不同接头的tester进行第一次杂交。
DNA分子克隆技术（也称基因克隆技术）：在体外将DNA分子片段与载体DNA片段连接，转入细胞获得大量拷贝的过程中DNA分子克隆(或基因克隆)。
其基本步骤包括：制备目的基因→将目的基因与载体用限制性内切酶切割和连接，制成DNA重组→导入宿主细胞→筛选、鉴定→扩增和表达。
载体（vecors）在细胞内自我复制，并带动重组的分子片段共同增殖，从而产生大量的DNA分子片段。
主要目的是获得某一基因或NDA片段的大量拷贝，有了这些与亲本分子完全相同的分子克隆，就可以深入分析基因的结构与功能，随着引入的DNA片段不同，有两种DNA库，一种是基因组文库（genomic library）,另一种是cDNA库。
载体所谓载体是指携带靶DNA片段进入宿主细胞进行扩增和表达的工具。
细菌质粒是一种细菌染色体外小型双链环状结构的DNA，分子大小为1-20kb，对细菌的某些代谢活动和抗药性表型具有一定的作用。
质粒载体是在天然质粒的基础上人工改造拼接而成。
最常用的质粒是pBR322。
基因库的建造含有某种生物体全部基历的随机片段的重组DNA克隆群体，其含有感光趣的基因片段的重组子，可以通过标记探针与基因库中的重组子杂交等方法而筛选出来，所得到的克隆经过纯化和扩增，可用于进一步的研。
其主步骤包括：（1）构建基因库迅速的载体；(2)DNA片段的制备；（3）DNA片段与载体DNA 的连接；（4）包装和接种。
cDNA库的建造是指克隆的DNA片段，是由逆转录酶自mRNA制备的cDNA。
cDNA库包括某特定细胞的全部cDNA克隆的文库，不含内含子。
特异基因的筛选常用的方法有：（1）克隆筛选即探针筛选法；（2）抗体检测法，检测其分泌蛋白质来筛选目的基因；（3）放射免疫筛选法，查出分泌特异抗原的基因；（4）免疫沉淀法，进行特异基因的筛选。
核酸序列测定DNA的碱基序列决定着基因的特性，DNA序列分析（测序，sequencing）是分子生物学重要的基本技术。
目的基因的克隆方法
1. 直接克隆法呀，这就好比你直接去商店挑了一个你最喜欢的玩具，简单又直接！比如说，我们想克隆某个特定基因，就像你一眼看中那个可爱的小熊玩偶，直接把它拿过来就行啦。
2. 还有反转录克隆法哦，哎呀，就好像把一段声音录下来再倒放出来一样神奇！比如从细胞中的 mRNA 反转录得到 cDNA，不就是很有趣的过程嘛？
3. 载体介导克隆法呢，就好像给基因找了一辆专门的车来运输它！像把基因放到特定的载体里，让它顺利到达目的地。
4. 基因文库筛选法呀，哇，这就像是在一个超级大的宝库中找宝贝！比如说在庞大的基因文库中去努力找到我们想要的那个目的基因。
5. PCR 扩增克隆法哟，这就跟变魔术一样厉害呢！比如通过 PCR 技术把特定基因大量扩增出来，好神奇呀！
6. 杂交捕获克隆法，哈哈，就好像用一个小陷阱去抓住我们想要的基因！像是专门设计来抓住目标基因一样。
7. cDNA 末端快速扩增法，这不就像是跑步冲刺一样快速到达终点嘛！像快速扩增 cDNA 的末端，得到我们要的基因片段。
8. 人工合成克隆法，哇塞，这可真牛，就像自己动手做一个超级厉害的东西出来！比如人工合成一些小的基因片段呢。
9. 染色体步移克隆法，嘿嘿，就好像一步一步探索一个神秘的地方一样！像是沿着染色体逐步找到我们的目的基因。
我觉得这些目的基因的克隆方法都超级有趣，各有各的神奇之处呀！真的是让我们对基因世界的探索更加丰富多彩了呢！。
一、目的基因克隆的策略有哪些？其理论依据什么？如何根据具体条件，如目的性状的特点，已知控制目的性状的基因的信息合理选择基因克隆的方法？1、主要有以下几个克隆的策略：（1）PCR法分离目的基因：从蛋白质的一级序列分析得到核酸序列的相关信息，设计简并引物，通过对mRNA进行反转录得到cDNA，以cDNA为模板，然后将目的基因通过PCR方法扩增，或者直接从基因组DNA扩增的方法。
（2）核酸杂交的方法：通过对蛋白质的氨基酸序列分析，设计简并引物，通过核酸杂交的方法从基因文库中筛选得到目的基因。
（3）免疫学筛选法分离目的基因：利用免疫学原理，通过目的蛋白的特异抗体与目的蛋白的专一结合，从表达文库中分离目的蛋白基因。
2、若控制该性状的目的蛋白质不容易分离纯化，这PCR方法比较适宜，若蛋白质分离纯化容易，且有现成的基因文库，则后两种方法较为简单。
二、蛋白组学方法克隆目的基因的理论依据是什么？有哪些技术环节？要用到哪些技术？1、理论依据：以分离纯化的目的蛋白为研究起点，通过对目的蛋白的一级结构分析，获得起码的氨基酸序列信息后，反推可能的DNA序列，然后设计引物，从cDNA中将目的基因扩增出来，或者设计核酸探针，通过杂交技术将目的基因从基因文库中筛选出来。
或通过抗体抗原免疫反应从表达文库中将该基因分离出来。
2、技术环节是确定并制备出高纯度的蛋白质。
3、所需要的实验技术有：蛋白质的双向电泳技术，由第一向的等电聚焦电泳和第二向的SDS-PAGE电泳组成；蛋白质氨基酸序列分析。
三、基因组学方法克隆基因的策略有哪些？各有什么特点？如何选择恰当的基因组学方法克隆目的基因？1、基因文库筛选方法通过对基因文库的筛选将目的基因分离出来，一般有两种方法：核酸杂交法，原理是分子杂交；PCR筛选法，通过ＰＣＲ方法将目的基因分离出来，对于以混合形式保存的文库，先将文库分成几份，每份为一个“反应池”进行PCR反应，待选出阳性池后，将阳性池的混合克隆稀释，然后等量分置96孔板中，进行横向池及纵向池的ＰＣＲ反应，然后将阳性菌落群进行稀释，重复上述工作，直到筛出阳性单克隆。
