整个基因克隆实验流程(完整)

以猪APOA2基因为例一．提取总RNATRIzol法提取RNATRIZOL试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂。

它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性。

加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。

RNA存在于水样层中。

收集上面的的水样层后，RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。

在除去水样层后，样品中的DNA和总蛋白也能相继以沉淀的方式还原。

乙醇沉淀能析出中间层的DNA，在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。

共纯化DNA对于样品间标准化RNA的产量十分有用Trizol试剂可以快速提取人、动物、植物、细菌不同组织的总RNA，该方法对少量的组织(50-100 mg)和细胞(5×106)以及大量的组织(≥1 g)和细胞(>107)均有较好的分离效果。

TRIZOL试剂操作上的简单性允许同时处理多个的样品。

所有的操作可以在一小时内完成。

TRIZOL抽提的总RNA能够避免DNA和蛋白的污染。

故而能够作RNA 印迹分析、斑点杂交、poly(A)+ 选择、体外翻译、RNA酶保护分析和分子克隆。

如果是用于PCR，当两条引物位于单一外显子内时，建议用级联扩大的DNase I(Cat. No. 18068)来处理抽提的总RNA。

并且利用DNA、RNA和蛋白质在不同溶液中的溶解性质，可以通过分层分别将不同层中的RNA（上层）、DNA（中层）、蛋白质（下层）分离纯化出来，效率极好。

Trizol试剂能促进不同种属不同分子量大小的多种RNA的析出。

例如，从大鼠肝脏抽提的RNA琼脂糖凝胶电泳并用溴化乙啶染色，可见许多介于7 kb和15 kb之间不连续的高分子量条带，（mRNA和hnRNA成分）两条优势核糖体RNA条带位于~5 kb (28S)和~2 kb (18S)，低分子量RNA介于0.1 和 0.3 kb之间 (tRNA, 5S)。

当抽提的RNA用TE稀释时其A260/A280比值≥1.8使用TRIzol注意事项TRIzol对人体有害，使用时应戴一次性手套，注意防止溅出。

一、实验目的1. 学习基因克隆的基本原理和方法。

2. 掌握PCR扩增、酶切、连接等基因克隆实验技术。

3. 验证目的基因的克隆是否成功。

二、实验原理基因克隆是指将目的基因片段从基因组中分离出来，并插入到载体中，使其在宿主细胞中复制、表达的过程。

实验过程中，主要涉及PCR扩增、酶切、连接、转化、筛选等步骤。

三、实验材料1. 模板DNA：含有目的基因的基因组DNA。

2. 引物：根据目的基因序列设计的上下游引物。

3. Taq DNA聚合酶：用于PCR扩增。

4. 酶切体系：限制性内切酶、缓冲液、连接酶等。

5. 连接载体：线性化载体。

6. 转化宿主菌：大肠杆菌DH5α。

7. 筛选培养基：含抗生素的LB培养基。

8. PCR扩增试剂：10×PCR缓冲液、dNTPs、MgCl2等。

四、实验方法1. PCR扩增（1）设计引物：根据目的基因序列设计上下游引物，长度约为20-30bp，分别位于目的基因的上下游。

（2）PCR反应体系：取模板DNA 1μl，上下游引物各1μl，10×PCR缓冲液5μl，dNTPs 4μl，MgCl2 2μl，Taq DNA聚合酶0.5μl，加ddH2O至50μl。

（3）PCR反应程序：95℃预变性5min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环，最后延伸10min。

2. 酶切连接（1）酶切：取PCR产物5μl，加限制性内切酶（如EcoRI）1μl，10×酶切缓冲液2μl，ddH2O 2μl，混匀后置于37℃水浴酶切2h。

（2）连接：取线性化载体5μl，酶切产物5μl，10×连接缓冲液2μl，T4 DNA 连接酶1μl，混匀后置于16℃连接过夜。

3. 转化（1）制备感受态细胞：将大肠杆菌DH5α在LB培养基中培养至对数生长期，按照1:100的比例加入CaCl2，混匀后冰浴30min。

（2）热激转化：将连接产物加入感受态细胞中，混匀后置于42℃水浴45s，迅速转移至冰浴中。

整个基因克隆实验规程完整Document serial number【KK89K-LLS98YT-SS8CB-SSUT-SST108】一、组织总RNA的提取相关试剂：T rizol；氯仿；苯酚；异丙醇；75%乙醇；RNase-free水相关仪器：制冰机；液氮&研钵/生物样品研磨仪；高速离心机；移液器（1ml、200μl、100μl/50μl）；涡旋振荡仪；恒温金属浴。

相关耗材：解剖工具，冰盒，离心管，离心管架，吸头（1ml，200μl/300μl），一次性手套，实验手套。

实验步骤1.取暂养草鱼，冰上放置一段时间，然后解剖，剪取肠道50~100mg，放入研钵中，加入液氮迅速研磨，然后加入1ml 预冷TRIzol试剂，充分研磨至无颗粒物存在。

2.转移到离心管中，室温放置5min，使细胞充分裂解；3.按1ml Trizol加入200μl氯仿，盖上盖子，迅速充分摇匀15s，然后室温放置3min；4.4℃，,12000g 离心15min；此时混合物分为三层，下层红色的苯酚氯仿层，中间层和上层无色水相；RNA存在于无色水相中；5.小心吸取上清液，千万不要吸取中间界面，否则有DNA污染；转移至一个新的离心管，加入等体积的异丙醇，轻轻混匀；6.室温放置10min；4℃，,12000g 离心10min；7.弃上清，加入1ml 75%乙醇洗涤；涡旋，悬浮沉淀；4℃，,12000g 离心5min；8.弃上清；可以再次用75%乙醇洗涤沉淀；9.弃上清；用移液器轻轻吸取管壁或管底的残余乙醇，注意不要吸取沉淀；室温放置5min晾干沉淀；（RNA样品不要过于干燥，否则极难溶解）10.沉淀中加入30μl RNase-free水，轻弹管壁，使RNA溶解。

RNA质量检测相关试剂：溴酚蓝， TEB/TAE电泳缓冲液，溴乙锭（EB）相关仪器：（超微量分光光度计，移液器（2.5μl 或2μl 规格，10μl规格），电子天平，电泳仪，电泳槽，凝胶成像仪，微波炉，制冰机）相关耗材：（无菌无绒纸，吸头，离心管架，PCR管，PCR管架，锥形瓶，烧杯，一次性手套，实验手套，冰盒）（1）RNA纯度的检测：测定其OD260和OD280的值，根据其OD260/ OD280的比值，当其比值在1.9~2.1之间，说明提取的总RNA纯度比较高，没有蛋白质和基因组的污染。

基因工程中的基因克隆与基因表达实验总结基因工程作为一门新兴的交叉学科，已经广泛应用于生物医学、农业、环境保护等领域。

其中，基因克隆和基因表达实验是基因工程的核心技术，对于研究基因功能和开发新药已经起到了重要作用。

本文将对基因工程中的基因克隆和基因表达实验进行总结，并探讨其在科学研究和应用中的前景。

一、基因克隆实验基因克隆是通过重组DNA技术，将感兴趣的基因从一个生物体中复制并插入到另一个生物体中的过程。

它是研究基因功能、生物制药和转基因等领域的基础。

基因克隆实验主要包括以下几个步骤：1. DNA提取与限制性内切酶切割：通过提取DNA样品，使用限制性内切酶切割将目标基因和载体DNA切割成相应片段。

2. 基因插入：将目标基因与载体DNA片段进行连接，常用的方法是使用DNA连接酶将两者黏合。

3. 转化与筛选：将连接后的DNA转入到宿主细胞中，使其成为转基因细胞。

通过选择性培养基进行筛选，可以获得拥有目标基因的转基因细胞。

通过基因克隆实验，我们可以获得不同生物体的目标基因，并进行后续的研究和应用。

例如，通过将某种植物的耐旱基因克隆到其他作物中，可以提高作物的抗旱能力，增加农作物产量。

二、基因表达实验基因表达实验是将目标基因在宿主细胞中进行转录和翻译，产生具有特定功能的蛋白质的过程。

基因表达实验是研究基因功能和制备重组蛋白等领域的重要手段。

基因表达实验主要包括以下几个步骤：1. 选择合适的表达系统：根据需要表达的蛋白质的性质和规模，选择合适的表达系统。

常用的表达系统包括细菌、酵母、哺乳动物细胞等。

2. 构建表达载体：将目标基因插入到表达载体中，通常使用限制性内切酶和DNA连接酶进行连接，并通过测序确保插入正确。

3. 细胞转染：将构建好的表达载体导入到宿主细胞中。

不同表达系统有不同的转染方法，如细菌的化学转型、酵母的电转染等。

4. 表达和纯化：经过一定时间的培养，宿主细胞会表达目标基因，合成目标蛋白质。

可以通过蛋白质纯化技术，如亲和层析、凝胶电泳等手段获得纯度较高的目标蛋白质。

基因克隆方案基因克隆是现代生物学中一项重要的技术手段，可以帮助科学家们研究和理解基因在生物体内的功能以及相互作用关系。

本文将介绍一种基因克隆的方案，包括所需材料、实验步骤以及预期结果。

材料准备：1. 原核或真核生物DNA样本2. 大肠杆菌或其他合适的宿主细胞3. 抗生素培养基4. 离心管和显微管5. 高速离心机6. 热循环仪7. DNA聚合酶、限制性内切酶、连接酶等相关试剂实验步骤：1. DNA片段的制备a. 提取所需的DNA样本，并利用限制性内切酶进行酶切，得到所需的目标DNA片段。

b. 进行DNA片段的纯化，通过凝胶电泳确认目标DNA片段的大小，并将其收集起来。

2. 载体的制备a. 准备合适的载体，如质粒或病毒。

b. 利用限制性内切酶对载体进行酶切，以开放载体的多个切位。

c. 将目标DNA片段与载体进行连接，使用连接酶催化反应使其稳定结合。

3. DNA的转化与筛选a. 将连接好的DNA测序样本转化到合适的宿主细胞中，如大肠杆菌。

b. 将转化后的细胞培养于含有抗生素的培养基上，以筛选带有目标DNA的克隆。

c. 通过PCR等方法检测筛选出的克隆是否携带目标基因，确认克隆是否成功。

4. 克隆的扩增与提取a. 选择带有目标基因的克隆进行扩增培养。

b. 利用高速离心机将细胞进行离心分离，提取出目标DNA。

预期结果：经过以上步骤，我们可以获得目标基因的克隆并进行扩增。

在实验结果中，我们能够观察到目标DNA片段在凝胶电泳图谱中的特定带状条带，同时，通过PCR验证可以进一步确认克隆是否成功。

此外，最终扩增的目标基因克隆可以用于后续的实验研究，如转基因生物的构建或基因功能的研究。

总结：通过以上实验方案，我们可以使用基因克隆技术获得目标基因的克隆，并获得扩增后的纯净DNA样本。

这项技术在现代生物学和医学研究中具有广泛的应用前景，为科学家们研究基因的功能及其在人类健康中的意义提供了关键的工具。

然而，需要注意的是，基因克隆技术的操作需要严格遵守实验室安全规范，并经过充分的训练，以确保实验的准确性和安全性。

克隆基因的操作流程
克隆基因是一种基因工程技术，它可以将感兴趣的基因从一个生物体中复制到另一个生物体中。

克隆基因的操作流程包括以下几个步骤：
1. 选择目标基因：首先需要确定感兴趣的基因，这个基因可以是任何生物体中的基因，如人类、动物、植物等，也可以是一种人工设计的基因。

2. 剪切DNA：通过限制性内切酶，将目标基因从DNA分子中切割出来。

这些切割出来的DNA片段被称为限制性内切片段。

3. 连接载体：将目标基因插入到载体DNA中。

载体是一种DNA 分子，可以承载基因并将其引入到目标生物体中。

在这个步骤中，需要使用一种酶来将目标基因和载体DNA连接起来。

这个过程被称为“重组”。

4. 转化宿主细胞：将重组后的载体DNA转化到宿主细胞中，使宿主细胞能够表达目标基因。

5. 筛选：筛选出表达目标基因的宿主细胞。

这个步骤可以通过一些特定的实验方法来实现，如PCR、Southern blotting等。

6. 验证：验证目标基因是否被正确地插入到宿主细胞中，并且是否表达出来。

通过这些步骤，就可以成功地克隆基因了。

克隆基因技术在医学、农业、工业等领域中有着广泛的应用，可以用来生产新药、改良农作物品种、生产高效酶等。

简述基因克隆的基本过程
基因克隆是指利用生物学技术进行繁殖某一抗原性基因组片段实现基因复制的过程。

主要由下面几个步骤组成：
一、启动物获取：
1. 从细胞中分离出DNA片段；
2. 使用酶切技术将DNA片段的‘钩子’附加到对应的载体上；
二、基因克隆扩增：
1. 把完美结合的细菌进行培养，促进DNA分子的复制；
2. 使用克隆抗体来处理载体以防止它们散发；
三、基因克隆分离：
1. 使用特定的限制酶进行裂解，将前面复制的DNA分离出来；
2. 使用水和石蜡将克隆体分离；
四、基因克隆实验：
1. 实验研究克隆DNA片段表达的基因；
2. 用PCR微量实验研究克隆体的表达水平；
五、基因突变：
1. 对克隆的DNA片段进行诱变；
2. 使用嵌合子技术将变异的片段插入到载体中；
六、基因表达检测：
1. 检测新插入的基因是否有正常表达；
2. 研究新基因对于抗性或者功能的影响；
七、生成抗原性基因组片段：
1. 用PCR实验研究整个新基因的表达水平；
2. 使用基因合成技术进一步改善新基因的特性；
基因克隆技术的应用有很大的广度，能够有效地增强病原体与病毒的抗体力，提升受抗原抗药的抵抗力，为生物科学的发展提供更多的研究材料。

基因克隆的基本原理和流程
基因克隆是一种技术，它使用质粒或DNA片段来复制一个特定的基因序列。

这种技术可以被用来产生大量相同的基因，以改变物种的表型特征，也可以用来研究有关基因的功能、结构和表达的有关信息。

基因克隆的基本原理是使用一种叫做酶切的酶，通过限制性内切酶将DNA片段分割成较小的片段，然后使用DNA 聚合酶将它们连接在一起。

这样，就可以生成几乎完全相同的DNA序列。

基因克隆的流程可以分为三个主要步骤：
1. 提取DNA：首先，由于想要克隆的基因位于一个细胞上，所以必须提取该细胞中的DNA。

常见的提取方法有水解法和溶剂提取法，其中水解法主要通过分解细胞壁和细胞质来提取DNA。

2. 克隆：其次，在提取出DNA后，使用限制性内切酶将DNA分割成较小的片段，然后使用DNA聚合酶将它们连接在一起。

3. 将克隆的DNA植入宿主：最后，将克隆的DNA植入一个宿主细胞，使其可以在宿主体内进行表达。

这里，一般会使用一种叫做质粒的DNA载体，它可以将克隆的基因植入宿主细胞中，从而使细胞获得克隆的基因。

基因克隆是一个复杂的流程，其中包括对基因的提取、克隆和植入宿主体等步骤，而且要完成克隆，还需要使用一系列不同的技术和工具，如限制性内切酶、DNA聚合酶和质粒等。

基因克隆技术在生物学、医学和农业等领域都有着重要的应用，它们已经成为研究基因功能、结构和表达的重要工具。

基因克隆步骤完整版基因克隆是一项复杂的生物技术，可以用于生物研究、药物开发和农业改良等领域。

下面是基因克隆的完整步骤：1.设计克隆实验方案：首先，确定要克隆的基因序列。

这可以是来自同一物种的已知基因，或者是从其他物种中提取的基因。

然后，设计适当的引物（引物是专门设计用来扩增特定DNA序列的短片段）用于PCR扩增。

2.DNA提取：提取目标组织或细胞中的DNA。

常用的DNA提取方法包括酚/氯仿法、盐法和商业DNA提取试剂盒等。

3.PCR扩增：使用引物和DNA模板进行多轮PCR扩增，从而产生大量目标基因的复制。

4.凝胶电泳：将PCR产物进行凝胶电泳分析，以确认扩增是否成功，并确定目标基因的大小。

5.DNA纯化：将目标基因的PCR产物从凝胶中切割并纯化。

这通常通过使用商业DNA凝胶提取试剂盒来完成。

6.多重限制性内切酶切割和连接：根据克隆方案中的设计，使用适当的限制性内切酶切割DNA。

然后，将目标基因连接到一个载体DNA中，这个载体DNA称为克隆载体。

克隆载体通常是一个圆形的质粒DNA。

7.转化：将克隆载体插入到宿主细胞中。

这可以通过热激冷转化、电转化或化学转化等方法实现。

8.筛选转化子：使用适当的筛选方法筛选转化子。

这可以通过选择性培养基，例如含有抗生素的培养基，或者通过对转化子进行荧光筛选等方法。

9.扩增：从筛选出的阳性克隆中提取DNA，并使用PCR或其他方法进行扩增。

10.序列分析：对扩增的DNA进行序列分析，以确认克隆是否成功。

这可以通过将DNA提交给商业实验室进行测序，或者使用自动测序设备进行测序。

11.功能分析：对克隆所得基因进行功能分析。

可以通过转基因生物的研究，观察基因对生物表型的影响。

12.存储和应用：将克隆所得的基因保存在冷冻库中，以备后续研究或应用。

总结：基因克隆是一项复杂的过程，包括基因序列设计、DNA提取、PCR扩增、凝胶电泳、DNA纯化、限制性内切酶切割和连接、转化和筛选转化子、扩增、序列分析、功能分析和存储等步骤。