目的基因的制备基因文库法

目的基因的4种获取方法
1、从基因文库中获取目的基因；
2、cDNA文库；
3、反转录法；
4、人工合成法。

目的基因，也称靶标基因，是指在实验中研究或操纵的特定基因。

在基因克隆过程中目的基因就是要分离、纯化、克隆并转化到生物体的那个可以带来预期表型性状如抗虫或耐除草剂的基因。

目的基因获得方法是取得含有所需生物学功能或编码所需产物结构基因的DNA片段的方法。

1969年贝克威思等从大肠杆菌中分离出了乳糖操纵子DNA，以后有不少科学家用生物学方法、物理化学方法分离出许多纯化的基因。

但总的来看为数不多。

1970年首次完成了77对碱基的酵母丙氨酸tRNA基因的全合成；1973年又合成了126对碱基的酪氨酸tRNA的结构基因。

但上述两次合成的基因都不能得到表达。

1976年8月成功地合成了能表达功能的人工基因——193对碱基的大肠杆菌酪氨酸tRNA基因。

自此以后人工合成基因的报道不断出现。

胰岛素目的基因的获取方法一、基因文库法基因文库法是一种通过构建基因文库来获取目的基因的方法。

基因文库是指将基因组或特定基因的DNA片段克隆到表达载体上，形成的基因重组分子集合。

通过筛选文库，可以获得特定的目的基因。

基因文库法包括基因组文库和cDNA文库，其中cDNA文库构建较为简单，应用更为广泛。

二、化学合成法化学合成法是一种通过化学手段合成目的基因的方法。

在已知目的基因序列的基础上，利用DNA合成仪，按照碱基互补配对原则，合成目的基因的DNA片段。

化学合成法的优点是快速、准确、特异性高，适用于小片段DNA 的合成。

但是，对于大片段DNA的合成，化学合成法存在难度和限制。

三、RT-PCR法RT-PCR法（逆转录-聚合酶链式反应）是一种通过逆转录和PCR技术获取目的基因的方法。

该方法首先将RNA逆转录为cDNA，然后利用PCR技术扩增目的基因片段。

RT-PCR法具有灵敏度高、特异性强、操作简便等优点，广泛应用于基因克隆、基因表达和基因突变研究等领域。

四、基因定点诱变技术基因定点诱变技术是一种通过诱变手段获取目的基因的方法。

该方法利用定点诱变技术，如寡核苷酸定向诱变技术（ODT）和锌指核酸酶技术（ZFNs），对特定基因位点进行突变，从而获取具有特定变异特征的目的基因。

基因定点诱变技术广泛应用于基因功能研究和遗传性疾病治疗等领域。

五、基因重组技术基因重组技术是一种通过构建重组载体获取目的基因的方法。

该方法将目的基因插入到载体中，形成重组分子，然后将重组分子导入到宿主细胞中，通过筛选和分离，获得含有目的基因的表达产物。

基因重组技术广泛应用于基因克隆、基因表达和蛋白质工程等领域。

六、基因合成技术基因合成技术是一种通过合成手段获取目的基因的方法。

该方法利用化学合成或酶促合成技术，按照目的基因的序列，合成完整的基因片段。

基因合成技术具有快速、准确、特异性高等优点，适用于小片段DNA的合成，广泛应用于基因克隆、基因表达和蛋白质工程等领域。

基因⽂库构建的过程、原理及⽅法基因⽂库构建的过程、原理及⽅法1 cDNA ⽂库的构建1.1 cDNA ⽂库构建的基本原理与⽅法cDNA ⽂库是指某⽣物某发育时期所转录的全部 mRNA 经反转录形成的 cDNA ⽚段与某种载体连接⽽形成的克隆的集合。

经典 cDNA ⽂库构建的基本原理是⽤ Oligo(dT) 作逆转录引物，或者⽤随机引物，给所合成的 cDNA 加上适当的连接接头，连接到适当的载体中获得⽂库。

其基本步骤包括：RNA 的提取(例如异硫氰酸胍法，盐酸胍—有机溶剂法，热酚法等等，提取⽅法的选择主要根据不同的样品⽽定)，要构建⼀个⾼质量的 cDNA ⽂库，获得⾼质量的 mRNA 是⾄关重要的，所以处理 mRNA 样品时必须仔细⼩⼼。

由于RNA 酶存在所有的⽣物中，并且能抵抗诸如煮沸这样的物理环境，因此建⽴⼀个⽆ RNA 酶的环境对于制备优质 RNA 很重要。

在获得⾼质量的 mRNA 后，⽤反转录酶 Oligo(dT) 引导下合成 cDNA 第1链， cDNA 第2链的合成(⽤ RNA 酶 H 和⼤肠杆菌 DNA 聚合酶 I，同时包括使⽤ T4 噬菌体多核苷酸酶和⼤肠杆菌 DNA 连接酶进⾏的修复反应)，合成接头的加⼊、将双链DNA 克隆到载体中去、分析 cDNA 插⼊⽚断，扩增 cDNA ⽂库、对建⽴的 cDNA ⽂库进⾏鉴定。

这⾥强调的是对载体的选择，常规⽤的是λ噬菌体，这是因为λ DNA 两端具有由12个核苷酸的粘性末端，可⽤来构建柯斯质粒，这种质粒能容纳⼤⽚段的外源 DNA。

1.2 cDNA 全长⽂库经典 cDNA ⽂库的构建虽然⾼效、简便，但⽂库克隆的⽚段⼀般较⼩，单个克隆上的 DNA⽚段太短，所能提供的基因信息很少，⼤多需要⼏个克隆才能覆盖⼀个完整的全基因的 cDNA。

为了克隆到真正的 cDNA 全长，建⽴富含全长的 cDNA⽂库具有重要意义。

为此，必须克服仅⽤ mRNA 的 PolyA 尾合成以及由普通逆转录酶作⽤特点所导致的局限性。

如何通过构建基因⽂库来获取⽬的基因⼀、概念主要有两种基因⽂库：基因组⽂库和cDNA⽂库。

基因组⽂库：⼀个⽣物体的基因组DNA⽤限制性核酸内切酶部分酶切后，将酶切⽚段插⼊到载体DNA分⼦中，所有这些插⼊了基因组DNA⽚段的载体分⼦的集合体，将包含这个⽣物体的整个基因组，也就是构成了这个⽣物体的基因⽂库。

cDNA⽂库：是指某⽣物某发育时期所转录的全部 mRNA 经反转录形成的cDNA⽚段与某种载体连接⽽形成的克隆的集合体。

⼆、构建基因⽂库的主要程序1、DNA提取及⽚段化或是cDNA的合成⼀个⽣物体的基因组DNA⽤限制性核酸内切酶部分酶切或全部mRNA经反转录形成的cDNA⽚段。

2、载体的选择及制备这些载体可以分为两类，⼀类是基于噬菌体改建的，利⽤了噬菌体的包装效率⾼和杂交筛选背景低的优点；另⼀类经改造的质粒载体或⼈⼯染⾊体，其主要优点在于可容纳超过100kb以上的外源⽚段。

3、DNA⽚段或cDNA与载体连接⽤重组DNA技术将某种⽣物细胞的DNA的所有⽚断随机地连接到基因载体上。

4、重组体转化宿主细胞⽤质粒作为载体的重组DNA分⼦可以通过转化引进细胞。

⽤λ噬菌体的DNA作载体的重组分⼦直接经转染引⼊细胞的效率较低；⼀般需先⾏离体包装，即把重组DNA分⼦包在噬菌体外壳中，再通过噬菌体感染⽽把重组DNA分⼦引⼊敏感细菌细胞中。

三、鉴定和转化细胞的筛选当获得了含重组体的宿主细胞时，即完成了基因的克隆。

然⽽，它只是分离基因的第⼀步，基因克隆后还要对克隆的基因进⾏分离。

因此，还必须对其进⾏必要的检测与分析，如序列测定，体外转录及翻译、功能互补实验等。

通过这些实验确定基因结构及功能，此时才能算分离到了⽬的基因。

所以，基因克隆、克隆基因分离、分离基因鉴定是利⽤基因⽂库技术分离⽬的基因的主要内容。

从基因⽂库中筛选某⼀克隆的基因常⽤办法是分⼦杂交。

⾸先把属于⼀个⽂库的细菌或噬菌体以较低密度接种在培养⽫上以取得相当分散的菌落或噬菌斑，然后⽤硝酸纤维滤膜吸印，使培养⽫和滤膜的相对应的位置上具有相同的克隆。

基因工程中的目的基因获得的方法
基因工程中获得目的基因的方法有以下几种：
1. PCR扩增法：利用聚合酶链反应（PCR）从一个已知源
DNA扩增目的基因的特定片段。

这种方法需要已知目的基因
的序列或者已知相关基因的序列来设计引物，通过PCR扩增
特定片段。

2. 基因合成法：利用化学合成技术合成目的基因的DNA序列。

这种方法可以通过合成多个片段，再进行连接而合成完整的目的基因。

3. DNA文库筛选法：构建基因文库，将源DNA片段插入载体中形成DNA文库。

然后利用对目的基因编码的蛋白质进行筛选，找出含有目的基因的载体。

4. 基因克隆法：将目的基因从一个生物体中剪切出来，然后将其插入到另一个载体中，形成重组DNA。

这种方法通常使用
限制酶切和连接酶进行DNA分割和连接。

5. 基因编辑法：利用CRISPR-Cas9、TALENs或ZFNs等基因
编辑技术，直接对细胞或生物体进行基因编辑，将目的基因插入到细胞或生物体的基因组中。

这些方法可以根据具体的实验需求和技术可行性来选择合适的方法来获得目的基因。

目的基因的制备方法1. 目的基因合成法：目的基因合成法是一种通过化学合成的方式来制备目的基因的方法。

该方法通常用于制备较短的目的基因（小于1000bp），优点是速度快，产量高，并且可以轻松地对目的基因进行修改。

在该方法中，目的基因的序列首先被设计并确定，然后通过化学合成的方式进行合成。

通常将该序列分成几个较短的片段，并逐一地进行合成和连接，直到完整的目的基因被制备出来。

2. PCR扩增法：PCR扩增法是一种广泛应用于制备目的基因的方法。

该方法利用特定引物的作用下，在体外反应体系中将目的基因的DNA序列扩增至所需的数量。

优点是产量高，适用于中等长度的目的基因，且可以进行定向的修饰。

在该方法中，首先设计引物，确定PCR反应体系中目的基因的起始和终止位置。

然后，通过PCR扩增反应，将模板DNA中的目的基因序列扩增至所需数量。

通过纯化和测序等处理，制备出干净的目的基因。

3. 基因克隆法：基因克隆法是将目的基因分子克隆至载体DNA上的一种方法。

该方法通常适用于较长的目的基因（大于1000bp），优点是产量高，重复性好，并且可以进行定向的修饰。

在该方法中，需准备一种能够接受目的基因的载体DNA，并将其线性化。

然后，在体外反应体系中，将目的基因的DNA序列与线性化载体DNA连接，形成重组DNA。

通过将重组DNA转化至感受态细胞中并筛选，制备出所需的目的基因。

4. 基于CRISPR技术的编辑法：基于CRISPR技术的编辑法是在生物体内或外对目的基因进行编辑的方法。

该方法利用CRISPR-Cas9等系统以及其引导RNA的作用，直接在目的基因序列中进行特定断裂和编辑。

优点是精度高，易于实现定向编辑。

在该方法中，首先需要设计合适的引导RNA序列，并在细胞内或外表达Cas9蛋白，以引导Cas9与引导RNA结合并特异性切割目的基因的DNA序列。

然后，在切割的断口处，可将外源DNA序列转化进去，实现目的基因的定向编辑。

5. 手工组装法：手工组装法是一种将片段PCR产物或化学合成的短片段组装成完整目的基因的方法。