实验三PCR扩增制备目的基因

扩增目的基因实验报告一、实验目的本次实验的主要目的是通过聚合酶链式反应（PCR）技术扩增特定的目的基因，以便后续的基因分析、克隆和表达等研究工作。

二、实验原理PCR 技术是一种在体外快速扩增特定 DNA 片段的方法。

其基本原理基于 DNA 半保留复制的机制，通过高温变性、低温退火和适温延伸三个步骤的循环进行。

在高温下，双链 DNA 模板解链成为单链；在低温下，引物与单链模板结合；在适温下，DNA 聚合酶以引物为起始点，沿着模板链合成新的 DNA 链。

经过多次循环，目的基因得以大量扩增。

三、实验材料与设备1、材料模板 DNA：含有目的基因的基因组 DNA 或 cDNA 片段。

引物：根据目的基因的序列设计的一对特异性寡核苷酸引物。

dNTPs（脱氧核糖核苷三磷酸）：包括 dATP、dCTP、dGTP 和dTTP。

Taq DNA 聚合酶。

PCR 缓冲液。

无菌去离子水。

2、设备PCR 仪。

微量移液器。

离心管。

电泳仪。

琼脂糖凝胶。

四、实验步骤1、反应体系的配制在无菌的离心管中，依次加入以下成分：模板 DNA：＿____ng上游引物：＿____μM下游引物：＿____μMdNTPs：各_____mMTaq DNA 聚合酶：＿____U10×PCR 缓冲液：＿____μL无菌去离子水补足至总体积_____μL2、 PCR 反应条件设置预变性：95°C 5 分钟变性：95°C 30 秒退火：根据引物的退火温度，一般为 55 65°C 30 秒延伸：72°C 30 秒 1 分钟（根据目的基因的长度而定）循环次数：一般为 30 35 个循环终延伸：72°C 5 10 分钟3、 PCR 产物的检测配制 1 2%的琼脂糖凝胶。

取适量的 PCR 产物与上样缓冲液混合，点样于琼脂糖凝胶的加样孔中。

以适当的电压进行电泳，观察 PCR 产物的条带。

五、实验结果与分析1、电泳结果经过电泳，在凝胶成像系统中观察到了预期大小的条带，表明目的基因成功扩增。

DNA重组生物实验报告课程名称：_生命科学导论实验课_ 指导老师：______成绩：__________________实验名称：__基因工程实验__ 实验类型：__生物实验_______同组学生姓名：__一、实验目的和要求基因工程实验是生物实验中极具代表性的一部分，在此次实验中有如下目的和要求：1、通过本实验了解和掌握含GFP基因质粒的提取和琼脂糖DNA电泳的等十个小实验组合而成的基因工程实验的原理和技术。

2、了解生物实验的完整流程，对实验室基本操作规范与仪器设备使用方法得到初步了解，从而建立系统、有条理的实验思路。

3、培养实验动手能力，在实践中加强对专业知识的认知与体会，融汇贯通，寓学于用，感受生物学科的魅力。

二、实验内容和原理基因工程又称DNA重组技术，是将不同来源的基因按照预先设计的蓝图，在体外构建成杂种DNA分子（又称重组DNA分子），然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性，获得新品种和生产新产品等。

基因工程技术为生命科学的研究提供了有力的手段，同时为以基因工程技术为核心的现代生物技术产业的建立奠定了扎实的基础。

基因工程技术建立的标志性实验是：①1972年，美国斯坦福大学的伯格(P.Berg)等人将猿猴病毒SV40的DNA和大肠杆菌λ噬菌体DNA分别进行EcoRI酶切，然后用T4DNA连接酶将两个酶切片段进行连接，率先完成了人类历史上第一个DNA分子的体外重组实验，因此荣获了1980年的诺贝尔化学奖。

②1973年，美国斯坦福大学的科恩（S.Cohen）等人在体外构建了含四环素和链霉素两个抗性基因的重组质粒，并将其导入大肠杆菌中，获得了双抗性的大肠杆菌转化子，成功完成了第一个基因克隆实验。

上述两大科研成果标志着基因工程技术的诞生。

一个典型的基因工程技术包含以下几个步骤：1.目的基因和载体DNA的获取。

2.目的基因和载体DNA的限制性内切酶的酶切消化。

3.酶切后的目的基因和载体DNA的体外重组连接，以获得重组DNA分子。

第1篇一、实验背景聚合酶链式反应（PCR）是一种体外扩增特定DNA序列的方法，广泛应用于分子生物学领域。

目的基因扩增实验是分子生物学实验中的一项基本技能，通过PCR技术可以将微量的目的基因片段扩增到足够数量，便于后续的基因克隆、基因表达、基因测序等研究。

本实验旨在通过PCR技术扩增目的基因片段，并对扩增结果进行鉴定。

二、实验目的1. 掌握PCR技术的基本原理和操作步骤；2. 学会设计引物和优化PCR反应条件；3. 通过琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增产物进行鉴定。

三、实验材料1. 实验试剂：PCR试剂盒、dNTPs、Taq DNA聚合酶、DNA模板、上下游引物、10×PCR缓冲液等；2. 实验仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、移液器、恒温水浴箱等；3. 实验耗材：无菌离心管、DNA纯化柱、琼脂糖凝胶、电极等。

四、实验方法1. 引物设计：根据目的基因序列，设计特异性引物，确保扩增片段长度适中，避免非特异性扩增。

2. PCR反应体系配置：按照PCR试剂盒说明书配置PCR反应体系，包括模板DNA、上下游引物、dNTPs、Taq DNA聚合酶、10×PCR缓冲液等。

3. PCR反应程序：根据实验目的和引物Tm值，设计合适的PCR反应程序，通常包括预变性、变性、复性、延伸等步骤。

4. PCR反应：将配置好的PCR反应体系放入PCR仪中，按照预定的PCR反应程序进行扩增。

5. 琼脂糖凝胶电泳：将PCR扩增产物与DNA Marker进行琼脂糖凝胶电泳，观察扩增产物条带。

6. 结果分析：根据电泳结果，判断目的基因是否成功扩增，并分析扩增产物的大小和纯度。

五、实验结果1. 电泳结果：在琼脂糖凝胶电泳中，观察到目的基因片段的条带，其大小与预期结果相符。

2. 结果分析：根据电泳结果，可以确定目的基因成功扩增，扩增产物大小为预期值。

六、实验讨论1. 引物设计：引物设计是PCR实验成功的关键因素之一，需要根据目的基因序列设计特异性引物，避免非特异性扩增。

实验三PCR扩增制备目的基因概念反转录是以RNA为模板,通过反转录酶,合成DNA的过程，是DNA生物合成的一种特殊方式。

区分:反转录与逆转录不等同。

反转录是进行基因工程过程中，人为地提取出所需要的目的基因的信使RNA，并以之为模板人工合成DNA的过程；逆转录是RNA类病毒自主行为，在整合到宿主细胞内以RNA为模板形成DNA的过程。

二者虽同为RNA→DNA的过程，但地点不同，相对性的来说，反转录在体外，逆转录在体内。

2反转录酶与反转录过程反转录过程由反转录酶催化，该酶也称依赖RNA的DNA聚合酶（RDDP），即以RNA为模板催化DNA链的合成。

合成的DNA链称为与RNA互补DNA（cDNA）。

反转录酶存在于一些RNA病毒中，可能与病毒的恶性转化有关。

人类免疫缺陷病毒（HIV）也是一种RNA病毒，含有反转录酶。

在小鼠及人的正常细胞和胚胎细胞中也有反转录酶，推测可能与细胞分化和胚胎发育有关。

大多数反转录酶都具有多种酶活性，主要包括以下几种活性。

①DNA聚合酶活性；以RNA为模板，催化dNTP聚合成DNA的过程。

此酶需要RNA为引物，多为色氨酸的tRNA，在引物tRNA3′－末端以5′→3′方向合成DNA。

反转录酶中不具有3′→5′外切酶活性，因此没有校正功能，所以由反转录酶催化合成的DNA出错率比较高。

②RNase H活性；由反转录酶催化合成的cDNA与模板RNA 形成的杂交分子，将由RNase H从RNA5′端水解掉RNA分子。

③DNA指导的DNA聚合酶活性；以反转录合成的第一条DNA单链为模板，以dNTP为底物，再合成第二条DNA分子。

除此之外，有些反转录酶还有DNA内切酶活性，这可能与病毒基因整合到宿主细胞染色体DNA中有关。

反转录酶的发现对于遗传工程技术起了很大的推动作用，目前它已成为一种重要的工具酶。

用组织细胞提取mRNA并以它为模板，在反转录酶的作用下，合成出互补的DNA(cDNA)，由此可构建出cDNA文库(cDNA library)，从中筛选特异的目的基因，这是在基因工程技术中最常用的获得目的基因的方法。

pcr技术扩增目的基因的步骤
PCR（聚合酶链式反应）技术是一种用于扩增特定DNA 片段的技术。

以下是一般PCR 技术扩增目的基因的步骤：
1. 设计引物：根据目的基因的序列，设计一对特异性的引物。

引物是一小段DNA 序列，与目的基因的两端互补。

2. 制备模板DNA：从含有目的基因的样本中提取DNA 作为模板。

可以使用各种方法，如苯酚-氯仿提取法或商业试剂盒。

3. 反应体系准备：将模板DNA、引物、PCR 反应缓冲液、dNTP（脱氧核苷酸三磷酸）、DNA 聚合酶等试剂按照适当的比例混合在一起，形成PCR 反应体系。

4. 热循环：将反应体系放入PCR 仪中，进行热循环。

热循环包括三个步骤：变性、退火和延伸。

在变性步骤中，模板DNA 被加热至高温，使双链DNA 解开成为单链。

在退火步骤中，温度降低，引物与模板DNA 互补结合。

在延伸步骤中，温度再次升高，DNA 聚合酶开始合成新的DNA 链。

5. 循环次数：热循环通常进行多个循环，每个循环包括变性、退火和延伸步骤。

循环次数取决于目的基因的长度和扩增效率。

6. 产物分析：经过一定的循环次数后，PCR 反应产生大量的扩增产物。

可以通过琼脂糖凝胶电泳或其他方法对产物进行分析，以确认目的基因的扩增。

PCR 技术的具体步骤和条件可能因不同的实验目的和设备而有所差
异。

在进行PCR 实验之前，建议仔细阅读相关的实验指南和操作手册，并根据实际情况进行调整。

内蒙古大学基因工程大实验思考题本科生基因工程实验(记录及课后思考题)姓名:学号:专业:完成日期:2012年9月9日指导老师:一、质粒DNA的小量制备1.影响最终质粒产量的主要因素有哪些？①与菌的生长状况有关②和提取时的温度有关，需要低温③加溶液Ⅱ、Ⅲ时操作要温和④要用酚和氯仿的混合液多次抽提去除蛋白质⑤要用冰乙醇沉淀2.提取到的质粒纯度将直接影响到以后的酶切效果，如何操作才能尽可能的避免蛋白质的污染？加入酚：氯仿：异戊醇去除蛋白质，氯仿可使蛋白质变性并有助于液相与有机相的分离。

二、质粒DNA电泳鉴定1.泳道的质粒DNA有几条带？为什么？质粒可能会有超螺旋构型，环状构型和线性构型。

这三种构型中，迁移率最快的应该是超螺旋的，其次是线性和环状。

通常观察到的是超螺旋和环状质粒。

2.溴酚蓝的迁移率相当于多少bp的DNA？在0.7%、1%、1.4%、2%的琼脂糖凝胶电泳中，溴酚蓝的迁移率分别与1000bp、600bp、200bp、150bp的双链线性DNA片段大致相同3.影响本实验结果的因素有哪些？DNA的长度，结构，胶的浓度，电压等会对实验结果造成影响。

三、质粒DNA的酶切1.酶切反应混合物的体积是否对酶切效果有影响？为什么？有影响加入反应的酶体积不超过反应总体积的1/10，避免限制酶活性受到甘油的影响。

大多数限制酶贮存在50％甘油溶液中，以避免在-20℃条件下结冰。

2.如何估计DNA用量和酶的用量？DNA样品的浓度（μg / μl）:OD260×稀释倍数×50/10001U酶切割1ug的质粒，酶的量不要超过酶切体系的1/10。

3.在吸取内切酶的时候如何操作才能避免浪费？将枪头不要插入液体很深部位，刚过液面且可以吸取所需的体积的液体。

四、PCR扩增制备目的基因1.复性温度是根据什么确定的？可以根据公式：2（A + T）+ 4（C + G），再减5-10度,一般为55℃-60℃当50％的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度.Tm对于设定PCR 退火温度是必需的。

pcr扩增目的基因实验报告PCR（聚合酶链反应）是一种重要的分子生物学技术，通过扩增目的基因，可以在短时间内获得大量的目的基因产物。

本文将介绍PCR扩增目的基因的实验过程和结果分析。

一、实验目的本实验的目的是通过PCR扩增目的基因，以便后续的分析和应用。

PCR技术的优势在于其高效、快速和特异性，可以在短时间内获得大量的目的基因产物。

二、实验材料与方法1. 材料：（1）PCR试剂盒：包括聚合酶、引物、dNTPs等。

（2）DNA模板：包括待扩增的目的基因DNA。

（3）PCR仪：用于控制反应温度。

2. 方法：（1）DNA提取：从待扩增的样品中提取目的基因DNA，可以采用常规的DNA 提取方法，如酚/氯仿提取法或商用DNA提取试剂盒。

（2）PCR反应体系的准备：按照PCR试剂盒说明书中的比例将试剂加入PCR 反应管中，同时加入目的基因DNA模板。

（3）PCR扩增：将PCR反应管放入PCR仪中，按照以下程序进行扩增：预热（95℃，5分钟）；循环反应（95℃，30秒；退火温度，30秒；72℃，时间根据目的基因大小确定，一般为1分钟/千碱基）；最终延伸（72℃，10分钟）。

（4）PCR产物分析：将PCR扩增产物进行电泳分析，可以采用琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳方法。

三、实验结果与分析通过PCR扩增目的基因后，我们进行了琼脂糖凝胶电泳分析。

结果显示，在目的基因区域出现了明显的特异性条带，证明PCR扩增成功。

此外，我们还观察到PCR扩增产物的大小与预期一致，表明PCR反应的特异性良好。

根据PCR扩增产物的大小，我们可以进一步判断目的基因的存在与否。

如果PCR扩增产物与预期大小一致，则说明目的基因存在于样品中；反之，如果未观察到特异性条带，则说明目的基因不存在或浓度过低。

此外，PCR扩增产物的强度也可以反映目的基因的相对丰度。

如果PCR扩增产物的强度较弱，则说明目的基因在样品中的浓度较低；反之，如果PCR扩增产物的强度较强，则说明目的基因在样品中的浓度较高。