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第四章目的基因的制备详解演示文稿

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目的基因的制备基因文库法ppt课件

目的基因的制备基因文库法ppt课件

组织或细胞染色体DNA 限带的所有基 因组DNA片段的集合.
克隆载体 重组DNA分子
受体菌 含重组分子的转化菌
genomic library
每个细胞含有一个基因组 DNA片段与载体的重组DNA分 子，许多细胞组成一个含有基 因组的色概率基因 该种生物所有基因 应用范围 ◆ 基因原始结构功能的研究 ◆ 对比分析内含子、外显子及调控区域 ◆ /46
逆转录
以单链RNA为模板合成双链DNA的反应。
DNA mRNA
14/46
逆转录病毒细胞内的逆转录现象：
RNA 模板 逆转录酶
RNA酶
DNA-RNA 杂化双链
Байду номын сангаас
单链DNA
双链DNA
逆转录现象说明：至少在某些生物，RNA同样具
有遗传物质的传代与表达功能。
15/46
逆转录酶的应用:
应用于基因工程
基因
mRNA 蛋白质多肽链
7/46
2.经验值
Transcription 从cDNA中获得的是经过剪切去除内含子的基因。
ln(1－P)
start codon Plasmid or phage
N=
非翻译区的序列特征对基因的表达具有重要的调控作用，编码序列则是合成基因产物—蛋白质模板。
ln(1－f/g) 某细胞的mRNA分子数为500 000，某个丰度为3500拷贝/细胞的mRNA基因，最小值为500 000/3500=143，丰度为14拷贝/细胞的mRNA
58330
人
3.2×109
320000
1473652
128000
589459
71111
327476
10/46

[课件]基因工程-4章 目的基因的制备PPT

[课件]基因工程-4章 目的基因的制备PPT


如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱 法筛选，则选择多拷贝克隆载体；如果转化子采用 基因产物功能检测法筛选，则选择表达型载体
2018/12/6 7
③重组DNA分子导入受体细胞 如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性 酶切图谱法筛选，则选择大肠杆菌作为受 体细胞；如果转化子采用基因产物功能检 测法筛选，则选择能使目的基因表达的受 体细胞 ④筛选含有目的基因的目的重组子 菌落原位杂交法、基因产物功能检测法 （筛选模型的建立）
18
⑶DNA化学合成的用途
合成天然基因：如生长激素释放抑制素基因、 胰岛素基因、干扰素基因等 合成探针 合成引物 合成连接子和接头 修饰改造基因：如组织型纤溶酶原激活剂基 因、尿激酶原基因等 设计新型基因

2018/12/6
19
㈣逆转录法

酶促逆转录主要用于合成分子质量较大， 转录产物mRNA易分离的目的基因。这种 方法以目的基因的mRNA为模板，在逆转 录酶的作用下合成互补的DNA，即cDNA， 然后在DNA聚合酶的催化下合成双链cDNA 片段，与适当的载体重组后转入受体菌 扩增，获得目的基因的cDNA克隆。

③即使含目的基因的DNA分子未定序或无定位， 也只须先通过酶切分析， 随后再通过部12/6
10
⑵基因分离的物理化学法

这是基因工程在发展初期所用的方法，某些生物 的rDNA基因最早都是利用该法分离获得的。 基本原理是DNA分子的两条链存在着G≡C、A=T碱 基配对,其中GC间存在3个氢键，AT间存在2个氢 键。不同基因片段的碱基组成差异较大，其理化 性质，如浮力密度和解链温度等也有明显不同， 采用适当方法可从基因组分离出目的基因。
2018/12/6

基因工程目的基因的制备ppt课件

基因工程目的基因的制备ppt课件
再以互补oligo(dG)序列作引物，引导第 二链合成。
此法无发夹结构，不用S1核酸酶。
ppt课件.
39
5`
5` CCCCC
CCCCC GGGGG CCCCC
引物结合 逆转录酶
AAAAA 3`
AAAAA TTTTT
AAAAACCC TTTTT 5`
碱性蔗糖梯度离心，水解 RNA回收cDNA
TTTTT 5` Oligo(dG)DNA聚合酶质粒cDNA：包含克隆数少，适于高 丰度的mRNA
噬菌体cDNA：包含克隆数多，适于 低丰度的mRNA。
ppA的制备及mRNA的分离 cDNA第一条链的合成 双链cDNA的合成 cDNA与载体的连接 噬菌体颗粒的包装转染或质粒的转化。
TTTTT
ppt课件.
40
D、 PCR法：
以cDNA的第一链为模板，设计一组引 物，用PCR扩增获得双链cDNA。
ppt课件.
41
5`
5` CCCCC CCCCC
Sal GGGGG Sal CCCCC
引物结合 逆转录酶
AAAAA 3`
AAAAA TTTTT
AAAAACCC TTTTT 5`
碱性蔗糖梯度离心，水解 RNA回收cDNA
载体本身的分子很小，一般只有5kb，便 于直接分析插入片段的酶切图谱。
ppt课件.
19
（2）、缺点：
筛选困难：杂交检测难度大，携带外源 片段大，复制困难，拷贝数少。
重组效率低：大片段易出Cosmid质粒的细菌菌落易贮存。
回收
R COS
ppt课件.
16
③ 重组DNA分子在体外包装成噬菌体颗粒， 转染宿主后铺板筛选培养，即可得到某 种生物的基因组。ppt课件.17

4第四章 目的基因的制备2解析

4第四章 目的基因的制备2解析

反向PCR
思考题
1. 什么叫目的基因？ 2. 以EST法为例说明分离目的基因的过程优缺点？ 4. 如何构建载体表达1000kb的目度如λgt11) 。插入片段
可表达融合蛋白，有活性、抗原性。常采用能与表
达产物发生特异性结合的抗体或化合物进行标记筛
选。特别适用于氨基酸序列不清楚的蛋白质的筛选 。
非表达型：可用一般载体(如λgt10)
，适用于已知
氨基酸顺序或其同源序列蛋白质，根据氨基酸密码
基酸序列的结构阐明之后，基因合成才有实现
的可能。
Messenger RNA with Poly(A) Tail (AAAA)
Buffer wash to release bound mRNA
Ribosomal RNA Lacking Poly (A)
Poly(A) RNA blinds to thymine nucleotides Other RNAs and cellular components flow through column
mRNA 完整性的确定（核酸和蛋白质电泳）
① 体外翻译法： a) mRNA在无细胞翻译体系指导合成高分子量蛋白 质的能力； b) mRNA在无细胞体系中指导合成目的多肽的能力 ； ② 直接检测 mRNA 分子的大小（一般分子质量约 在0.5～8kb之间，大部分位于1.5 ～ 2.0kb之间）； ③ 总mRNA指导合成cDNA第一链长分子的能力 （第一链cDNA应为0.5 ～ 5kb之间的拖影）
将合成的双链DNA重组入载体，导入宿主(大肠杆 菌)增殖
（3）mRNA的丰度与cDNA基因大小的关系要获得高丰度的某mRNA, 必细胞总mRNA数/细胞中某种mRNA的拷贝数 实际需构建的最小值远超过公式理论值

目的基因的制备ppt课件

目的基因的制备ppt课件
第一节 目的基因的制备
钓取目的基因 ▪ 4 利用PCR直接扩增出目的基因
2024/8/2
第一节 目的基因的制备
14
“雪亮工程"是以区（县）、乡（镇） 、村（ 社区） 三级综 治中心 为指挥 平台、 以综治 信息化 为支撑 、以网 格化管 理为基 础、以 公共安 全视频 监控联 网应用 为重点 的“群 众性治 安防控 工程” 。
和固相合成两种形式。前者操作繁琐，基本上已淘汰；后
者反应中间物的分离程序简便，DNA合成仪就是根据固
相亚磷酸三酯法原理设计的
2024/8/2
11
“雪亮工程"是以区（县）、乡（镇） 、村（ 社区） 三级综 治中心 为指挥 平台、 以综治 信息化 为支撑 、以网 格化管 理为基 础、以 公共安 全视频 监控联 网应用 为重点 的“群 众性治 安防控 工程” 。
第一节 目的基因的制备
钓取目的基因 ▪ 4、通过PCR直接扩增出目的基因
2024/8/2
第一节 目的基因的制备
4
“雪亮工程"是以区（县）、乡（镇） 、村（ 社区） 三级综 治中心 为指挥 平台、 以综治 信息化 为支撑 、以网 格化管 理为基 础、以 公共安 全视频 监控联 网应用 为重点 的“群 众性治 安防控 工程” 。
▪/生物基因组的大小
例如，人的单倍体D
▪DMT： 二甲氧基三苯甲基
DMT O
CH2 O G
HH

H
H
OH
Me O P
Me
N
Me
CH CH
Me
Me
DMT O
激活
CH2 O G
HH
H
H
OH
Me O P H

第四章、目的基因的制备

第四章、目的基因的制备
1、建库过程复杂、费时且技术难度大。 2、库容量大，筛选工作费时。 3 3、所得序列含其他DNA（目标序列两侧DNA） DNA DNA 4、只能得到真核基因的基因组DNA，往往含内含子，不 库中获得的真核基因是已经过剪接、 去除了内含子的DNA，可以在原核生物细胞中 表达。
三、PCR扩增法 扩增法
（一）前提条件：待扩增DNA区域两端16-
24bp的序列已知或蛋白氨基酸序列已知 （二）系统组成 系统组成： 单链模板、 系统组成：DNA单链模板、引物、DNA聚 单链模板 引物、 聚 合酶、缓冲系统、 合酶、缓冲系统、dNTP
（三）PCR步骤 步骤
加热变性 两个引物与两条单链模板退火（降温） 结合 聚合酶延伸模板互补链（引物所在链）
4、引物设计方法
人工设计 计算机辅助设计：最佳搭配是用软件 “Primer premier5.0”进行引物搜索，用 “oligo6.0”对引物分析评价
（五）常规PCR的局限性 常规 的局限性
常规PCR：指用TaqDNA聚合酶进行扩增的 ：指用 常规 聚合酶进行扩增的 PCR 局限性：难以一次正确扩增较长的DNA片断 局限性： 以一次正确扩增较长的DNA片断 原因： 酶纠错率差（ 原因：Taq酶纠错率差（比体内酶系统和 酶纠错率差 Klenow酶）， 酶），PCR扩增时易出现错配碱基 扩增时易出现错配碱基 靶序列， 酶扩增30轮后 （长1Kb的DNA靶序列，用Taq酶扩增 轮后， 的 靶序列 酶扩增 轮后， 扩增碱基出错率达2.5bp） 扩增碱基出错率达 ）
例：人白细胞介素－2基因的获得 分离人外周血单个核细胞总RNA，用反转录PCR（RT－ PCR）库中筛选 菌落或噬
（一）菌落或噬菌斑原位杂交法
由M.Grunstein和D.Hos法。 把铺平板培养形成的菌落或噬菌斑印迹到硝酸 纤维素膜上，经溶菌和变性处理后使DNA暴露 出来，再与特异性探针（同位素标记DNA或 RNA片段）杂交，筛选出含有插入序列的菌落 或噬菌斑，然后培养细菌扩增目的基因。

第四章 目的基因的制取

第四章 目的基因的制取

第四章目的基因的制取内容提要•目的基因的制取策略•鸟枪法制取目的基因•物理化学法分离目的基因•化学合成基因•反转录合成DNA第一节目的基因制取的策略一、外源基因与目的基因基因工程主要是通过人工方法分离、改造、扩增并表达生物的特定基因，从而进行遗传研究或是获得表达产物。

通常我们把插入载体的DNA片段称为“外源基因”；将那些已被或准备要被分离、改造、扩增或表达的DNA片段称为“目的基因”。

原核细胞含有上千个基因，真核细胞基因组内的基因数目更是庞大。

目的基因一般都很小，都仅由几千或几百甚至更少的碱基对组成（人生长激素释放抑制因子的基因仅有42bp）。

要想获得某个特定的目的基因，必须对其性质、结构有所了解，根据其特点来制定分离方案。

二、目的基因制取的策略目的基因制取的策略可分为直接制取和间接制取。

一般来说，大部分低等生物基因组的碱基序列已测定，可以直接制取目的基因（确切定位）。

对于高等哺乳动物来说，目的基因在DNA上无法定位，只能间接制取。

获取目的基因的方法：1、直接制取法：以机械的方法或是限制性内切酶对总DNA进行切割，再直接分离特点位点的DNA分子。

2、逆转录法（互补cDNA法）：以RNA为模板，逆转录合成cDNA。

缺点是cDNA中不含天然基因的内含子。

3、PCR扩增法：对于含极微量mRNA的细胞大多采用PCR扩增，再进行目的基因的制取。

4、鸟枪法（散弹法）：可快速和高纯度地从单拷贝或多拷贝基因中筛选获得天然的目的基因。

5、人工化学合成法。

6、其它方法：mRNA差异显示法、限制性片段长度多态性探针技术等。

目前，真核基因，利用DNA合成仪合成目的基因的成本较高；利用cDNA文库获得目的基因需大量前期工作；直接以生物细胞染色体DNA为模板可获得目的基因，但模板的扩增会产生非特异性产物；一般通过构建完整的基因文库，再从文库中“钓取”出目的基因。

第二节鸟枪法制取目的基因一、“鸟枪法”的概念“鸟枪法”是指将基因组按染色体分开后，将它全部打乱，切成碎片，进行随机测序，测序后再将它们拼接起来的方法。

4第四章 目的基因的制备1

4第四章 目的基因的制备1

（3）双抗体免疫法分离编码蛋白的基因
原理：抗原、抗体结合 适用范围：适于分离某一真核蛋白质已被分离纯 化，且足以产生特定抗体的基因。
（4）酶促反转录法直接从特定mRNA分离基因 适用范围：主要用于合成分子质量较大，转录产物 mRNA易分离的目的基因。 原理：分离出目的基因的mRNA,再经RT－PCR合 成cDNA
克隆目的基因的基本战略
随机克隆供体细胞的全基因组DNA片段，然后通
过快速有效的筛选程序从众多克隆中分离出含有目
的基因的目的重组子，进而获得目的基因。
鸟枪法步骤
1.使用限制性内切酶将带 有目的基因的DNA链切成若
干小段。
2.再使用DNA连接酶将其整 合到质粒载体的基因中,并 转化受体细胞使其表达。 3.如果在某个细胞中得到
GGA CCTAG
Sal3AI的酶切末端 dATP、dGTP
利用大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段将酶 切末端稍短的突出段部分补平，可有效防止 DNA片段自身连接成原基因组的结构，及载 体臂的自身连接，使噬菌体双臂仅能与单个 基因组DNA片段连接。
G
Xho I识别位点图4-4 不经分级 分离的构建例如，已知某目的基因位
于20kb的Sal3AI片段中，
将染色体DNA用Sal3AI切开
，琼脂糖凝胶电泳分离，
用刀片切下相当于18 - 22 kb大小区域内的凝胶块，
22 kb 18 kb
20 kb
从此凝胶块中回收DNA片段
，然后与载体进行拼接
Klenow片段
GATCC G
G CCTAG
GATCC AGG
用精密的密度梯度超速离心技术）
单链酶解法（富含GC的片段Tm高） 分子杂密度梯度离心法

《目的基因的制备》课件

《目的基因的制备》课件

表达
让目的基因在目标生物体 中得到表达，产生所需的 蛋白质或产物。

常用的制备方法
1
PCR法
通过聚合酶链式反应扩增目的基因，需设计引物与模板DNA配对。
2
连接法
通过连接酶催化，将目的基因与载体DNA连接，形成重组DNA。
3
重组法
利用重组酶切割DNA，然后将目的基因嵌入到载体DNA中。
PCR法的制备步骤
重组法的制备步骤
1. 将目的基因和载体DNA以及重组酶一起反应。 2. 重组酶切割DNA，使目的基因与载体DNA形成黏性末端。 3. 将目的基因嵌入载体DNA中，即形成重组DNA。 4. 将重组DNA转化入宿主细胞，进行表达。 5. 检测表达产物的功能和纯度。
目的基因的应用
科学研究
目的基因的制备使得科学家可 以深入研究细胞、生物体和人 类基因等重要领域。
1. 设计引物，使其与目的基因的序列互补。 2. 提取模板DNA。 3. 设置PCR反应体系，包括引物、酶、酶缓冲液等。 4. 进行PCR扩增，包括变性、退火、延伸等步骤。 5. 检测PCR产物的纯度和大小。
连接法的制备步骤
1. 准备目的基因、载体DNA和连接酶。 2. 将目的基因与载体DNA进行切割，暴露黏性末端。 3. 用连接酶将目的基因与载体DNA连接。 4. 转化连接产物入宿主细胞，形成重组DNA。 5. 筛选含有目的基因的克隆，进一步分析。
医学研究
目的基因的制备有助于研究疾 病发生机制、疾病基因与药物 治疗的关系，推进医学进步。
农业应用
通过改良作物品种，提高产量 和抗病能力，目的基因的制备 对农业发展具有重要意义。
常见问题及解决方法
1 降低质量
使用高质量的试剂和操作规范可以减少目的基因制备过程中的质量问题。

4第四章 目的基因的制备3

4第四章 目的基因的制备3

处理诱导表达的基因。
原理：利用一对组织对基因表达的差异，筛选 出在其中一种组织中受某种因素调控表达的一
种或一组基因。
应用前提： 1
两种不同细胞群体 2 目的基因 不表达
目的基因 表达
分别制备以上两种细胞群体的总mRNA提取物
差 别 杂 交 法 的 操 作 步 骤
以这两种总mRNA为探清 诱 导 表 达 基 因
生 长 因 子 调 节 基 因
减 数 杂 交 分 离 T 细 胞 受 体 基 因
（3）基因组 DNA 减法杂交
生物素标记
用来分离缺失 突变基因
减 法 杂 交 分 离 缺 失 突 变 体 基 因
回收 cDNA, 制备探 针筛选 ， 以分离 该差异 片段对 应的全 长cDNA 或完整 基因
酵母双杂合系统p254 真核生物的位点特异转录激活因子：化入可表达BD融合蛋白的酵母体内。
路线1 注意问题
寡核苷酸探针可特异地识别目的基因，其长度 应为17-20个核苷酸，即至少需要了解蛋白质 肽链上6个连续的氨基酸顺序。 由于遗传密码的简并性，一种氨基酸顺序存在 多种可能的DNA 顺序。为了获得全部可能的顺 序，通常要合成一组混合的寡核苷酸探针，其 中只有一种能与目的基因完全互补。易出现 “假阳性”（错误的探针与无关cDNA发生杂 交）。
已知脲酸盐氧化酶的32个氨基酸顺序
提取mRNA 简并寡核苷酸引物。 反转录合成
单链cDNA
简并寡核苷酸引物。 PCR，扩增 目的基因DNA
插入载体 猜测体探针 转化E.Coli
阳性克隆
cDNA的cDNA
利用抗体筛选目的cDNA
为35-75个核苷酸探针。
• 选择密码子简并性尽可能少的蛋白质顺序，或者
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片段 的平均长度
• CNA片段出现的概率； f：插入片段的大小与基因组大小的比值。
• 因此E. coli的突变体可以用来克隆trpA基因。首 先从一个正常个体中提取总DNA，然后酶切，连 接产生大量重组DNA分子，其中一个将携带完整 的trpA基因。连接混合物用来转化缺陷型E. coli 细胞，大部分转化子是缺陷型的，携带trpA的重 组子将是野生型的构建 • Cosmid基因组的构建 • YAC基因组的构建
4.1.2.2 cDNA的构建步骤• cDNA和cD生物基因组转录的部分或全部mRNA经 反转录产生的各种cDNA片段分别与克隆载体重组， 贮存在一)
• 当目的基因在某一细胞类型中高表达时，这种利用 mRNA的克隆方法显得特别有用。 例如，麦醇溶蛋白是小麦中一种重要的营养蛋白，在发
育的小麦种子中，编码的麦醇溶蛋白基因高水平表达。
这些细胞中总mRNA的30％是麦醇溶蛋白的mRNA。 显然，如果从小麦种子中克隆mRNA，将会得到大量 特异表达麦醇溶蛋白的克隆。
第四章目的基因的制备详解演示文稿
优选第四章目的基因的制备
4.1 目的基因的制备方法
4. 化学合成法
• 克隆基因的方法有很多，根据研究基础的不同，可以使 用以下的方法克隆目的基因：
• 1因 4. 转座子标签法 5. 图位克隆法 6. 差减杂交法、扣除杂交、差异显示法于植物、动物，所需要的克隆数很大，鉴定目 的基因是一项艰巨的任务。对于不同细胞中有 的基因是表达的， 而有的基因关闭。只有少量基
因在所有的细胞类型中都表达，利用mRNA构建
构建步骤
• 分离纯化总RNA及mRNA • cDNA第一链的合成 • 双链cDNA合利用许多方法对目的克隆进行 鉴定。
• 虽然有一些方法是通过检测克隆基因的翻译产物来鉴定 重组体的，但往往直接鉴定正确的重组体DNA分DNA片段出现的概率； f：某种mRNA的丰度与总mRNA的数的比值。
• 因为任何一种细胞中都只NA。
• 以mRNA为起始材料所得的克隆只包含整个细胞所有基 因的一部分。
直接选择法克隆Kan抗性基因
• 2）标记援救的范围和限制 存在两个限制因素： 1） 必须存在着目的基因的突变品系 2） 需要一种只有野生型能够生长的培养基。 一般而言，标记援救适用于微生物的合成酶
可以在基本培养上选择。
标记拯救法克隆 4.1.2.2 cDNA的构建 4.1.2.3 基因的筛选
• 这将用到一项重要的技术—探针杂交 (hybridization probing)技术。
• 筛选目的克隆最常用的方法是探针杂交法。 探针是由目的基因的已知的信息决定的，有三种 可能性： 1） 目的基因在特定细胞中的丰度 2） 基因所编码的蛋白质或者部分序列 3） 基因是一个基因家族中的一个
探针杂交原理
获得目的克隆的方法有两种
1） 目的基因的直接选择 2） 从基因中筛选4.1.1 直接分离法
• 直接选择的基因比较少，如抗生素抗性基因。如克隆一 个kan抗性基因，在R6-5质粒上含有四种抗性基因： kan, 氯霉素、链霉素、硫胺类药物，kan抗性基因存在 于13个EcoRI片段中的一段中。将R6-5的片段插入 pBR322的EcoR I位点中，连接混合物中将含有13个不 同片段的大量重组拷贝，其中部分是kan抗性的。只有 含kan的克隆才能在含有kan的培养基上正常生长。 1） 标记援救可以扩大直接选择的范围 利用E. coli的突变系可扩展该项技术。例如要从E. coli中克隆trpA基因，编码色氨酸合成酶，一个突变系 不能合成色氨酸，只有加入色氨酸后才能存活。
• 任意两条单链核酸分子都有相互形成碱基对的趋 势。但形成的大多数分子对由于只有少数链间氢 键形成，杂交结构并不稳定。 但如果多聚核苷酸链是互补的，碱基对基因的足够数目的克隆的集合（将生物材料
的基因组DNA或cDNA片段化，然后与特定的载体连接 导入宿主菌形成包含目的基因限制性酶酶切产生能插入载体的片段， 一般是λ替（醇溶朊），小麦中的一种营养蛋白，在正发育
的种子中，以非常高的水平表生物的基因组的全部遗传信息（DNA序列）通
过克隆载体贮存在一个受体菌