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第十五章免疫细胞功能检测技术第一节淋巴细胞的功能检测免疫细胞是指参与机体免疫应答的细胞，大致可分为两类，一类能识别特异性抗原，主要指淋巴细胞群，包括T细胞、B细胞、NK细胞、K细胞等；另一类能捕获抗原，处理抗原，包括中性粒细胞、巨噬细胞、树突状细胞等。
淋巴细胞功能测定可分为体内试验和体外试验。
体内试验主要是进行迟发型超敏反应，借此间接了解淋巴细胞对抗原、半抗原或有丝分裂原的应答反应；体外试验主要包括淋巴细胞对抗原或有丝分裂原刺激后的增殖反应、细胞毒性试验及淋巴细胞分泌产物的测定。
一、T细胞功能检测（一）T细胞增殖试验1.原理：T细胞在体外受到有丝分裂原或抗原的刺激后，细胞增殖，并转化为淋巴母细胞。
因此，淋巴细胞增殖反应又称淋巴母细胞转化。
2.刺激物：植物血凝素（PHA）、刀豆素A（ConA）和美洲商陆（PWM）、白喉类毒素、破伤风类毒素、纯化蛋白衍生物（PPD）和白色念珠菌等。
3.方法学：检测T细胞增殖反应的方法有：（1）形态学检查法：运用普通光学显微镜，简便易行。
缺点是依靠肉眼观察形态学变化，判断结果易受主观因素影响，重复性和准确性较差。
（2）3H-TdR掺入法：敏感性高，客观性强，重复性好，但需一定设备条件，及存在放射性核素污染问题。
（3）MTT比色法：本方法的敏感性虽不及3H-TdR掺入法，但操作简便，无放射性污染。
较常采用。
（二）T细胞分泌功能测定通过对于T细胞分泌细胞因子的含量、生物学活性和基因表达水平，以反映T细胞功能。
（三）T细胞介导的细胞毒试验常选用可传代的已建株的人肿瘤细胞，与待检淋巴细胞混合，观察肿瘤细胞杀伤的情况。
是评价机体细胞免疫水平的常用指标，特别是测定肿瘤患者CTL杀伤肿瘤细胞的能力，常作为判断预后和观察疗效的指标之一。
（四）体内实验1.特异性抗原皮肤试验：常用结核菌素皮肤试验。
其他皮试抗原还有白色念珠菌素、皮肤毛癣菌素、腮腺炎病毒等。
若受试者从未接触过该抗原，则不会出现阳性反应，因此阴性者也不一定表明细胞免疫功能低下。
第一章概述第一节免疫学简介一、免疫学概念与免疫应答1.免疫的概念免疫是机体免疫系统识别“自己”与“非己”、排出抗原性异物、维持自身生理平衡和稳定的过程。
其生理过程对机体有益，其病理性应答对身体有害。
2.免疫应答的过程（1）识别阶段：是巨噬细胞等抗原递呈细胞对外来抗原或自身变性抗原进行识别、摄取、降解和递呈抗原信息给T辅助细胞及相关淋巴细胞的阶段。
（2）活化阶段：是T、B淋巴细胞在接受抗原信号后，在一系列免疫分子的参与下，发生活化、增殖、分化的阶段。
（3）效应阶段：是浆细胞分泌特异性抗体，执行体液免疫功能。
T细胞中的Th细胞分泌细胞因子等效应分子，T杀伤细胞执行细胞毒效应功能。
另有少量T细胞和B细胞在增殖分化后，不直接执行效应功能，而作为记忆细胞。
当其再次遇到相同抗原时，迅速活化、增殖、分化为效应细胞，执行高效而持久的特异性免疫效应功能。
3.免疫功能机体免疫自稳功能紊乱会导致A.恶性肿瘤B.反复感染C.自身免疫病D.免疫缺陷病E.免疫耐受『正确答案』C『答案解析』免疫的现代概念是A.机体消除和杀灭自身突变细胞B.机体排除抗原性异物的过程，对机体都是有利的C.机体抵抗病原微生物入侵的防御能力D.机体清除衰老、变异细胞的功能E.机体识别和排斥抗原性异物的功能『正确答案』E『答案解析』免疫是机体识别和排斥抗原性异物的一种生理功能；免疫应答是指机体免疫系统接受抗原刺激发生一系列反应，并以排出或分解该抗原为目的的反应过程。
二、免疫组织与器官免疫系统由免疫器官、免疫细胞和免疫分子构成。
（一）中枢免疫器官是免疫细胞产生、分化和成熟的场所，由骨髓和胸腺组成。
1.骨髓：在出生前后，主要承担造血功能（多能造血干细胞，HSC），是各类免疫细胞以及T细胞的前体细胞的发生场所。
为B细胞分化成熟的场所。
2.胸腺：T细胞分化、发育、成熟的场所，骨髓迁入的淋巴样干细胞（LSC）在胸腺细胞和胸腺基质细胞的相互作用下，最终成为功能性CD4+、CD8+T细胞。
其他主治系列-临床医学检验【代码：352】-临床免疫学和免疫学检验（一）酶免疫技术[单选题]1.酶免疫技术用于样品中物质的定量测定（EIA）是基于A.酶标记物参与免疫（江南博哥）反应B.酶催化免疫反应，复合物中酶活性与样品测值呈正比C.含酶标记物的免疫复合物中的酶可催化底物成色，其色泽与待测物量相关D.固相化技术的应用，使结合和游离的酶标记物能有效的分离E.酶与抗原或抗体的特异结合正确答案：C参考解析：酶免疫技术是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。
加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。
[单选题]2.下列对血清中酶活力的测定的描述哪一项是错误的A.可测定产物生成量B.可测定底物消耗量C.需最适pHD.需最适温度E.与底物浓度无关正确答案：E参考解析：酶促反应中需要最适pH、温度及过量的底物，反应速度可用一定时间内产物生成量或底物消耗量来反映。
[单选题]3.酶免疫技术中的酶结合物是指A.酶标记抗原B.酶标记抗体C.酶标记抗原或抗体D.结合在固相载体上的酶E.酶与底物的结合正确答案：C参考解析：酶结合物是指用酶标记后的抗原或抗体。
[单选题]4.用于酶免疫技术的HRP，其RZ值应大于？A.1.0B.2.0C.3.0D.4.0E.5.0正确答案：C参考解析：辣根过氧化物酶（HRP）的纯度用RZ表示，它是以HRP分别在403nm 和275nm处的吸光度比值来表示的。
用于酶免疫技术的HRP，其RZ值应大于3.0。
[单选题]5.在ELISA定性检测中，当弱阳性室内质控物检测为阴性时，以下处理当天的检测结果的方式最为正确的是A.阳性结果可以发出，找到失控原因后，对阴性样本重新进行检测B.先将结果发出，再查找原因C.报告一律不发，找到失控原因后，对所有样本重新进行检测D.阴性结果可以发出，找到失控原因后，对阳性样本重新进行检测E.发出全部报告，下次检测时更换质控品正确答案：A参考解析：由于是弱阳性结果为阴性，主要存在假阴性反应，即有阳性结果定为阴性的可能性。
第二十八章移植免疫及其免疫检测被移植的细胞、组织或器官称移植物，提供移植物的个体称为供体，接受移植物的个体称为受体或宿主。
根据移植物来源的不同，可将移植分为自体移植、同系移植、同种异体移植、异种移植；根据移植部位的不同，可分原位移植和异位移植；视移植物种类的不同，又有器官移植、支架组织移植和细胞移植之分。
第一节引起排斥反应的靶抗原由主要组织相容性复合体（MHC）编码的人类白细胞抗原（HLA），是不同个体间进行器官或组织移植时发生排斥反应的主要成分，这种代表个体特异性的同种抗原又称组织相容性抗原或移植抗原。
此外，与移植排斥反应相关的抗原还有：①其他血细胞抗原，如红细胞血型抗原ABO和白细胞的特有抗原等；②组织特异性抗原：特异地表达于构成某一组织器官的细胞表面抗原；③次要组织相容性抗原，男性特有的Y 染色体编码的某些蛋白质。
一、主要组织相容性抗原在同种异体移植时，HLA引起移植排斥反应最强烈。
在三类HLA分子中，主要由Ⅰ、Ⅱ类分子触发移植排斥反应，HLA－DR反应最强。
HLA－C与移植排斥反应无明显关系。
移植中，来自供体的强表达HLA的APC 和其他免疫细胞，即作为同种异体抗原介导宿主抗移植物反应（HVGR）；也作为过客细胞的重要膜分子参与移植物抗宿主反应（GVHR）。
在移植过程中，受体的免疫细胞对移植物表面HLA的识别存在着直接和间接两种方式。
直接识别：受体T细胞对移植物表面完整的同种异型HLA分子的识别，无须对其加工、处理和提呈。
活化以CD8+CTL为主的T细胞，参与强烈的急性排斥反应。
间接识别：受体T细胞对APC所加工、处理的移植物HLA抗原肽的识别。
识别则以CD4+Th为主，在慢性排斥反应中发挥重要作用。
二、其他组织相容性抗原（一）次要组织相容性抗原 mHA在某些组织或器官移植时发挥重要作用，特别是骨髓移植。
此外，在不同性别的个体间进行移植时，由Y染色体上的座位所编码的蛋白，可能是触发轻度移植排斥反应的mHA，这种与性别相关的mHA又称H－Y抗原，为男性所特有，可被HLA－B7分子结合。
第三章免疫原和抗血清的制备第一节免疫原的制备免疫原指能诱导机体产生抗体或致敏淋巴细胞，并能在体内外与抗体或致敏淋巴细胞发生特异性反应的物质。
一、颗粒性抗原的制备细胞、细菌、寄生虫等皆为颗粒性抗原。
细胞抗原（如绵羊红细胞）一般情况下经生理盐水或其他溶液洗净，配制一定浓度即可。
细菌抗原多用液体或固体培养物，经集菌后处理。
颗粒性抗原大多用静脉内注射免疫法。
二、可溶性抗原的制备和纯化（一）组织和可溶性抗原的粗提蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、酶、补体、细菌毒素、免疫球蛋白片段、核酸等皆为良好的可溶性抗原。
1组.织匀浆的制备（1）高速组织捣碎机法；（2）研磨法：组织匀浆液要离心沉淀，沉淀物为组织和细胞碎片，上清液为提取可溶性抗原的材料。
2细.胞的破碎（）反复冻融法：℃冷冻，〜7融化。
（2）超声破碎法（3）自溶法（4）酶处理法：胃蛋白酶或胰酶。
（5）表面活性剂处理法：十二烷基硫酸钠。
3免.疫球蛋白片段的制备（）非共价键解离法：改变环境或用变性剂。
（2）共价键解离法：还原法或氧化法解离二硫键。
（3）溴化氰裂解法：溴化氰裂解蛋白质肽链。
（4）酶解法：木瓜蛋白酶、胃蛋白酶或胰蛋白酶。
（二）可溶性抗原的提纯和纯化超速离心法：适用于少数大分子抗原或比重较轻的抗原，不适用于大多数中小分子抗原。
选择性沉淀法：（1）核酸去除法：核糖核酸降解法更简便。
（2）盐析法：常采用硫酸铵使蛋白抗原进行粗筛、提取丙种球蛋白及抗原浓缩。
（3）有机溶剂沉淀法：常采用乙醇或丙酮。
（）聚合物沉淀法：常用非离子型聚合物，如聚乙二醇（）G凝胶过滤法：根据分子大小进行分离纯化。
离子交换层析法：利用一些带电离子基团的凝胶或纤维素，吸附带有相反电荷的蛋白质抗原。
5亲.和层析法：与生物分子间不同的亲和性进行分离。
如抗原和抗体、酶和酶抑制物、酶蛋白和辅酶、激素和受体等。
电泳法：蛋白质在同一环境中，分子量和电荷不同，在电场中迁移速率不同进行分离。
（三）纯化抗原的鉴定蛋白质含量测定：常用的是紫外光吸收法，该法测定和的吸光度（）值。
第十三章免疫组织化学技术免疫组织化学技术又称免疫细胞化学技术，是指用标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项免疫检测方法。
第一节概述免疫组织化学的基本过程包括：①抗原的提取与纯化；②免疫动物或细胞融合，制备特异性抗体以及抗体的纯化；③将标志物与抗体结合形成标记抗体；④标本的处理与制备；⑤抗原抗体免疫学反应以及标志物呈色反应；⑥观察结果。
一、标本的处理（一）标本的主要来源1.活体组织：应取材于病变组织及病变与正常组织交界处，大小适中。
减少对组织标本的损伤与挤压。
2.体液、穿刺液：可直接涂片或经离心后取沉淀物涂片。
3.培养细胞：悬浮培养的细胞经离心沉淀后做细胞涂片，盖玻片上的单层培养细胞直接固定。
（二）标本的固定与保存1.标本固定的目的：使细胞内蛋白质凝固，细胞内分解酶反应终止，以防止细胞自溶，保持细胞形态和结构；保存组织细胞抗原性；防止标本脱落；除去妨碍抗体结合的类脂，便于保存；抑制组织中细菌的繁殖，防止组织腐败和在后续组织制备中的细胞结构和成分的改变。
标本的固定应以不损伤细胞形态，不干扰固定后抗原的识别和结合为原则。
2.固定剂的选择：蛋白质类抗原，可用乙醇或甲醇固定；微生物抗原可用丙酮或三氯化碳固定；如需除去病毒的蛋白质外壳，可使用胰蛋白酶；多糖类抗原用10%福尔马林固定或以微火加热固定；如有黏液物质存在，应用透明质酸酶等处理除去；类脂质丰富的组织进行蛋白、多糖抗原检测时，需用有机溶剂（乙醚、丙酮等）处理除去类脂。
组织标本常规固定液为中性缓冲甲醛。
3.制片方法的评价：冷冻和石蜡切片是免疫组化最常用的制片方法。
首选冷冻切片。
其操作简便，可避免石蜡切片因固定（甲醛）、脱水、浸蜡等对抗原所造成的损失，适用于不稳定的抗原。
石蜡切片是研究形态学的主要制片方法，它不但是观察组织细胞结构的理想方法，而且可用在陈旧石蜡包埋材料免疫组化的回顾性研究。
第九章酶免疫技术第一节酶免疫技术的特点第二节酶免疫技术的分类第三节酶联免疫吸附试验第四节酶免疫测定的应用第一节酶免疫技术的特点酶免疫技术是将抗原抗体反应的特异性和酶高效催化反应的专一性相结合的一种免疫检测技术。
它是将酶与抗体或抗原结合成酶标记抗体或抗原，此结合物既保留了抗体或抗原的免疫学活性，同时又保留了酶对底物的催化活性。
在酶标抗体（抗原）与抗原（抗体）的特异性反应完成后，加入酶的相应底物，通过酶对底物的显色反应，对抗原或抗体进行定位、定性或定量的测定分析。
它通过利用酶催化底物反应的生物放大作用，提高了抗原抗体反应的敏感性。
一、酶和酶作用底物（一）酶的要求1、酶的活性要强，催化反应的转化率高，纯度高。
2、易与抗体或抗原偶联，标记后酶活性保持稳定，且不影响标记抗原与抗体的免疫反应性。
3、作用专一性强，酶活性不受样品中其他成分的影响，受检组织或体液中不存在与标记酶相同的内源性酶或抑制物。
4、酶催化底物后产生的产物易于判断或测量，方法简单易行、敏感和重复性好。
5、酶、辅助因子及其底物对人体无害，酶的底物易于配制、保存，酶及其底物应价廉易得。
（二）常用的酶1.辣根过氧化物酶（HRP）HRP来源于蔬菜植物辣根中，分子量40kD，是由无色的糖蛋白（主酶）和亚铁血红蛋白（辅基）结合而成的复合物。
辅基是酶活性基团，最大吸收峰在波长403nm处；而主酶则与酶活性无关，最大吸收峰在275nm。
2.碱性磷酸酶（AP）AP是一种磷酸脂水解酶，可以从大肠杆菌或小牛肠黏膜提取，但两种来源的AP理化性质有所不同：菌源性AP分子量80kD，酶作用最适pH为8.0；肠黏膜AP分子量为100kD，最适pH为9.6；后一种AP的活性高于前者。
3.β-半乳糖苷酶（β-Gal）β-Gal来源于大肠杆菌，分子量540kD，最适pH6～8。
因人血中缺乏此酶，以其制备的酶标志物在测定时不易受到内源性酶的干扰，从而提高特异性，被用于均相酶免疫测定中。
第九章酶免疫技术第一节酶免疫技术的特点它是将酶与抗体或抗原结合成酶标记抗体或抗原，在酶标抗体（抗原）与抗原（抗体）的特异性反应完成后，加入酶的相应底物，通过酶对底物的显色反应，对抗原或抗体进行定位、定性或定量的测定分析。
一、酶和酶作用底物（一）酶的要求：一个酶蛋白分子每分钟可催化103～104个底物分子转变成有色产物。
用于标记的酶应符合：1.酶的活性要强，催化反应的转化率高，纯度高。
2.易与抗体或抗原偶联，标记后酶活性保持稳定，且不影响标记抗原与抗体的免疫反应性。
3.作用专一性强，酶活性不受样品中其他成分的影响，受检组织或体液中不存在与标记酶相同的内源性酶或抑制物。
用于均相酶免疫测定的酶还要求当抗体与酶标抗原结合后，酶活性可出现抑制或激活。
4.酶催化底物后产生的产物易于判断或测量，方法简单易行、敏感和重复性好。
5.酶、辅助因子及其底物对人体无害，酶的底物易于配制、保存，酶及其底物应价廉易得。
（二）常用的酶1.辣根过氧化物酶（HRP）：目前酶联免疫吸附试验中应用最广泛的标记用酶。
由无色的糖蛋白（主酶）和亚铁血红蛋白（辅基）结合而成的复合物。
辅基是酶活性基团，而主酶则与酶活性无关，HRP的纯度用RZ（HRP分别在403nm和275nm处的吸光度比值）表示，RZ值应大于3.0。
RZ值仅说明血红素基团在HRP中的含量，并非表示HRP制剂的真正纯度，而且RZ值高的HRP并不意味着酶活性也高，RZ值与酶活性无关。
酶活性以单位U表示：即1分钟将1μmol底物转化为产物所需的酶量。
酶变性后，RZ值不变但活性降低，因此使用酶制剂时，酶活性单位比RZ值更为重要。
2.碱性磷酸酶（AP）：大肠杆菌来源的AP分子量80kD，酶作用最适pH为8.0；小牛肠黏膜AP分子量为100kD，最适pH为9.6；后一种AP的活性高于前者。
3.β-半乳糖苷酶（β-Gal）：β-Gal来源于大肠杆菌。
因人血中缺乏此酶，以其制备的酶标志物在测定时不易受到内源性酶的干扰，从而提高特异性，被用于均相酶免疫测定。
第九章酶免疫技术第一节酶免疫技术的特点它是将酶与抗体或抗原结合成酶标记抗体或抗原，在酶标抗体（抗原）与抗原（抗体）的特异性反应完成后，加入酶的相应底物，通过酶对底物的显色反应，对抗原或抗体进行定位、定性或定量的测定分析。
一、酶和酶作用底物（一）酶的要求：一个酶蛋白分子每分钟可催化103～104个底物分子转变成有色产物。
用于标记的酶应符合：1.酶的活性要强，催化反应的转化率高，纯度高。
2.易与抗体或抗原偶联，标记后酶活性保持稳定，且不影响标记抗原与抗体的免疫反应性。
3.作用专一性强，酶活性不受样品中其他成分的影响，受检组织或体液中不存在与标记酶相同的内源性酶或抑制物。
用于均相酶免疫测定的酶还要求当抗体与酶标抗原结合后，酶活性可出现抑制或激活。
4.酶催化底物后产生的产物易于判断或测量，方法简单易行、敏感和重复性好。
5.酶、辅助因子及其底物对人体无害，酶的底物易于配制、保存，酶及其底物应价廉易得。
（二）常用的酶1.辣根过氧化物酶（HRP）：目前酶联免疫吸附试验中应用最广泛的标记用酶。
由无色的糖蛋白（主酶）和亚铁血红蛋白（辅基）结合而成的复合物。
辅基是酶活性基团，而主酶则与酶活性无关，HRP的纯度用RZ（HRP分别在403nm和275nm处的吸光度比值）表示，RZ值应大于3.0。
RZ值仅说明血红素基团在HRP中的含量，并非表示HRP制剂的真正纯度，而且RZ值高的HRP并不意味着酶活性也高，RZ值与酶活性无关。
酶活性以单位U表示：即1分钟将1μmol底物转化为产物所需的酶量。
酶变性后，RZ值不变但活性降低，因此使用酶制剂时，酶活性单位比RZ值更为重要。
2.碱性磷酸酶（AP）：大肠杆菌来源的AP分子量80kD，酶作用最适pH为8.0；小牛肠黏膜AP分子量为100kD，最适pH为9.6；后一种AP的活性高于前者。
3.β-半乳糖苷酶（β-Gal）：β-Gal来源于大肠杆菌。
因人血中缺乏此酶，以其制备的酶标志物在测定时不易受到内源性酶的干扰，从而提高特异性，被用于均相酶免疫测定。
（三）常用的底物1.HRP的底物（1）邻苯二胺（OPD）：是HRP最为敏感的色原底物之一。
OPD在HRP的作用下显橙黄色，加强酸如硫酸或盐酸终止反应后呈棕黄色，最大吸收峰在492nm波长。
OPD应用液稳定性差，易变色，需新配制后在1小时内使用，显色反应过程需避光，而且具有致癌性。
（2）四甲基联苯胺（TMB）：TMB经HRP作用后变为蓝色，加入硫酸终止反应后变为黄色，最大吸收峰波长450nm。
TMB稳定性好，成色无需避光，无致突变作用，是目前ELISA中应用最广泛的底物。
缺点是水溶性差。
（3）其他：5-氨基水杨酸（5-ASA）和2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS）。
2.AP的底物常用对-硝基苯磷酸酯（p-NPP），p-NPP经AP作用后的产物为黄色对硝基酚，最大吸收峰波长为405nm。
3.β-半乳糖苷酶（β-Gal）的底物常用4-甲基伞酮基-R-D半乳糖苷（4-MUU），酶作用后，生成高强度荧光物4-甲基伞形酮（4-MU），其敏度性较HRP高30～50倍，但测量时需用荧光计。
二、酶标记抗体或抗原（一）酶标记抗体或抗原的制备标记方法应符合：技术方法简单、产率高，且重复性好；标记反应不影响酶和抗原或抗体的活性；酶标志物稳定，应避免酶、抗体（抗原）以及酶标志物各自形成聚合物等。
1.戊二醛交联法：同源双功能交联剂。
（1）一步法：连接AP。
①优点：操作简便、有效，重复性好。
②缺点：交联时分子间比例不严格，大小不一，影响效果。
（2）二步法：连接HRP。
先将HRP与戊二醛作用，透析除去戊二醛，在pH9.5缓冲液中再与抗体作用而形成酶标抗体。
优点：酶标志物质量较均一，标记效率也较一步法高。
2.改良过碘酸钠法HRP标记抗体或抗原的最常用方法。
（二）酶标记物的纯化及鉴定常用的纯化方法有葡聚糖凝胶G-200/G-150过柱层析纯化和50%饱和硫酸铵沉淀提纯等。
常用免疫电泳或双相扩散法进行鉴定。
1.出现沉淀线表示酶标记物中的抗体（抗原）具有免疫活性。
2.沉淀线经生理盐水漂洗后，滴加酶的底物溶液，若沉淀线上显色，则酶标记物中的酶活性仍保留。
三、固相载体除均相酶免疫测定外，各种非均相酶免疫测定反应最后都需要分离游离和结合的酶标记物。
固相抗体或抗原就是把抗体或抗原结合到固相载体的表面上，是酶免疫技术中将游离和结合的酶标志物迅速分离的最常用方法。
（一）固相载体的要求结合抗体或抗原的容量大；可将抗体或抗原牢固地固定在其表面，经长期保存和多次洗涤也不易脱落；不影响所固定的抗体或抗原的免疫反应性，而且为使反应充分进行，最好其活性基团朝向反应溶液，固相方法简便易行，快速经济。
（二）固相载体的种类和选择1.塑料制品：聚苯乙烯塑料最常采用。
抗原或抗体以非共价或物理吸附方式结合到此载体上。
主要缺点是抗体（抗原）结合容量不高、固相抗体（抗原）脱吸附率较高且不均一，孔间变异大，重复性差，从而影响测定的灵敏度、精确度及检测范围。
目前采用非共价和化学偶联共价吸附方法进行抗原或抗体的固相化可改善上述缺点2.微粒：易与抗体（抗原）形成化学偶联，且结合容量大。
均匀地分散到整个反应溶液中，因此反应速度快。
可制成磁化微颗粒。
自动化检测中常用。
3.膜载体：常有硝酸纤维素膜（Nc）、玻璃纤维素膜及尼龙膜等通过非共价键吸附抗体（抗原），广泛用于定性或半定量斑点ELISA的固相载体。
（三）包被与封闭1.包被：将抗原或抗体结合在固相载体上的过程。
普遍使用的聚苯乙烯载体，将抗原或抗体溶于缓冲液（常用为pH9.6的碳酸盐缓冲液）中，加于ELISA板孔中4℃过夜。
包被好的固相载体在低温可放置一段时间而不失去免疫活性。
2.封闭：包被的蛋白质浓度过低，固相载体表面不能被此蛋白质完全覆盖，其后加入的血清标本和酶结合物中的蛋白质也会部分地吸附于固相载体表面，最后产生非特异性显色致本底偏高，在这种情况下，需用1%～5%的牛血清白蛋白或5%～20%小牛血清再包被一次，消除此干扰，此过程称为封闭。
第二节酶免疫技术的分类包括两种：酶免疫组织化学技术：用于组织切片或其他标本中抗原的定位。
酶免疫测定技术（EIA）：用于液体标本中抗原或抗体的定性和定量。
根据抗原抗体反应后是否需将结合和游离的酶标志物分离，EIA一般可分为均相和异相两种类型。
一、均相酶免疫测定利用酶标志物与相应的抗原或抗体结合后，标记酶的活性会发生改变的原理，可以在不将结合和游离酶标志物分离的情况下，通过测定标记酶的活性的改变，而确定抗原或抗体的含量。
该法主要用于小分子激素和半抗原（如药物）的测定，均相法的优点是适合于自动化测定，但反应中被抑制的酶活力较小，需用灵敏的光度计测定，反应的温度也需严格控制。
（一）酶放大免疫测定技术（EMIT）EMIT的基本原理是半抗原与酶结合成酶标半抗原。
当与抗体结合后，所标的酶与抗体密切接触，使酶的活性中心受到影响而活性被抑制。
反应后酶活力大小与标本中的半抗原量呈一定的比例，从酶活力的测定结果就可推算出标本中半抗原的量。
（二）克隆酶供体免疫分析（CDEIA）DNA重组技术可分别合成某种功能酶（如β-D半乳糖苷酶）分子的两个片段，大片段称为酶受体（EA），小分子称作酶供体（ED），两者单独均无酶活性，一定条件下结合形成四聚体方具酶活性。
克隆酶供体免疫测定（CDEIA）的反应模式为竞争法。
标本中的抗原和酶供体（ED）标记的抗原与特异性抗体竞争结合，形成两种抗原抗体复合物。
ED标记的抗原与抗体结合后由于空间位阻，不再能与酶受体（EA）结合，而游离的ED标记的抗原上的ED可和EA 结合，形成具有活性的酶，加入底物测定酶活性，酶活力的大小与标本中抗原含量成正比。
二、异相酶免疫测定是目前应用最广泛的一类标记免疫测定技术。
（一）异相液相酶免疫测定主要用于检测样品中极微量的短肽激素和某些药物等小分子半抗原。
酶标志物具有更好的稳定性，且无放射性污染。
1.平衡法：将待测样品抗原、酶标抗原及特异性抗体进行一次性温育，待反应达平衡后，测定离心沉淀物（酶标抗原抗体复合物）中加入酶底物液后的呈色吸光度值。
2.非平衡法：先将样品（或标准品）与抗体混合反应达平衡，然后加入酶标记抗原继续温育一段时间，测定离心沉淀物（酶标抗原抗体复合物）中加入酶底物液后的呈色吸光度值。
（二）固相酶免疫测定酶联免疫吸附试验（ELISA）。
第三节酶联免疫吸附试验一、基本原理把抗原或抗体结合到固相载体表面，测定时将受检样品和酶标记抗原或抗体与结合在固相载体上的抗原或抗体反应形成抗原抗体复合物；洗去未结合成分；加入底物后，底物被固相载体上的酶催化变成有色产物。
故：①固相的抗原或抗体；②酶标记的抗原或抗体；③酶反应的底物三种试剂为反应必备。
二、方法类型及反应原理（一）检测抗原的方法1.双抗体夹心法：属于非竞争结合，检测抗原最常用的方法，检测含有至少两个抗原决定簇的多价抗原。
原理是先将特异性抗体与固相载体连接；加入待测标本，形成固相抗原抗体复合物；再加入酶标抗体形成双抗体夹心，洗涤；加底物显色，根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量检测。
如血清标本中有类风湿因子（RF）存在，则可出现假阳性反应，因为RF是一种抗变性IgG的自身抗体，它能与多种动物的变性IgG的Fc部分结合，因此RF就可作为固相抗体和酶标抗体之间的桥接抗原。
双抗体夹心法只适用于二价或以上的较大分子抗原的测定，不能用于小分子半抗原的检测。
2.双位点一步法：针对抗原分子上两个不同且空间距离较远的决定簇，包被使用一种单抗，酶标记使用另一种单抗。
测定时将待测抗原和酶标抗体同时加入，温育、洗涤，加入底物显色。
若待测抗原浓度过高时，过量的抗原可分别同固相抗体和酶标抗体结合而抑制夹心复合物的形成，出现钩状效应，显色降低，甚至假阴性。
必要时可将标本经过适当稀释后重复测定。
3.竞争法用于测定小分子抗原，如药物、激素等。
原理为先用抗小分子的特异性抗体包被固相，然后同时加入待测样本和酶标记的小分子，两种小分子竞争与固相上的抗小分子的特异性抗体结合，温育一定时间后洗涤，加入酶底物显色。
特点是：①酶标记抗原与样品或标准品中的非标记抗原具有相同的与固相抗体结合的能力；②反应体系中，固相抗体和酶标抗原是固定限量，且前者的结合位点少于酶标记和非标记抗原的分子数量和；③免疫反应后，结合于固相载体上复合物中被测定的酶标抗原的量（酶活性）与样品或标准品中非标记抗原的浓度成反比。
（二）检测抗体的方法1.间接法：最常用的方法，属非竞争性结合试验。
原理：将抗原包被在固相载体上，加入待测样本形成固相抗原-受检抗体复合物；经温育洗涤后，加入酶标二抗，常用羊抗人IgG，在固相上即形成固相抗原-待测抗体-酶标抗抗体复合物，加入底物后根据显色的深浅确定待测抗体含量。
