哺乳动物精子顶体反应检测方法研究进展

1、哺乳动物精子获能的分子机制雄性排出的精子处于不同成熟阶段，未成熟精子是在雌性生殖道内获能的，精子一开始是不成熟的，未成熟精子是在雌性生殖道内获能，称为精子获能。

哺乳动物精子获能有以下特点：精子细胞膜上的胆固醇被去除，使得与受精有关的受体脂阀集中到精子头部。

获能时，精子表面的一些糖和蛋白丢失细胞膜电位超级化，有助于细胞膜融合一些蛋白磷酸化，一些分子伴侣集中到精子头部，对形成受精时的受体有帮助顶体膜与细胞膜靠的更紧，更有助于顶体反应的发生。

具体分子机制有以下几点：1）蛋白酪氨酸磷酸化.许多试验证实, 人、牛、猪、小鼠及猫等物种的精子获能与蛋白酪氨酸磷酸化(PTP)相关。

小鼠、人、牛和猪的精子中, PTP 受PKA/cAMP 信号途径调节, PKA 对精子PTP 的作用主要是通过对酪氨酸激酶或磷酸化酶的直接或间接调控来实现, 而PKA 的活性有赖于cAMP 的数量。

2）胆固醇外流精子获能与胆固醇外流密切相关, 实验表明获能过程中胆固醇外流引起精子膜流动性改变、精子膜脂类发生重排及胆固醇/磷脂比率下降, 这些引起精子膜去稳定性的变化有利于获能的完成。

随着对获能机制的深入研究, 发现β-环状糊精能代替BSA 引起精子膜上胆固醇外流, 并通过KA/cAMP 途径增加PTP , 促进精子获能。

3）活性氧的产生试验证实活性氧(ROS)的产生是精子获能过程中最早发生的事件之一。

获能过程伴随O2-的产生, O2-的产生在获能初期(孵育开始后15 min—20 min)较高, 随后缓慢降低至较低水平, 甚至比非获能精子水平还低。

而且超氧化物歧化酶的延迟加(孵育开始后30 min 和60 min 时加入)不阻止精子获能, 提示O2-在获能初期就启动精子获能。

实验证明证实由外源性黄嘌呤和黄嘌呤氧化酶产生的超氧化物阴离子能引起人精子超激活和精子获能，这是由于精子中含有大量不饱和脂肪酸和低的抗氧化酶, 从而对氧化作敏感。

常用哺乳动物精子质量检测方法经济动物2004,8(4):198～201,204JournalofEconomicAnimal常用哺乳动物精子质量检测方法'田恒玖,刘志平,白玉妍(东北林业大学野生动物资源学院,哈尔滨150040)摘要:根据精子的特性,利用光学显微镜,荧光显微镜,流式细胞记数仪等仪器,结合常规染色技术或荧光探针技术,通过检测精子染色质的状态,运动能力,质膜的完整性,顶体的状态,线粒体的活性,获能,顶体反应以及与卵子的结合能力等指标来评价精子的功能状态,以便准确预测精子的受精能力.关键词:精子:顶体;获能;线粒体;精子质量中图分类号:$814.8文献标识码:A文章编号:1007—7448(2004)04—0198—04 TheMethodsoftenUsedforEvaluatingtheMammalianSpermQuality TINAHeng—jiu,LIUZhi—ping,BAIYu—yan(CollegeofWild.elifeResources,NortheastForestryUnivers,Harbin150040,China) Abstract:Inordertoaccuratelypredictspermfertilizingpotential,spermqualityisestimatedt houghchromatinstructure,motility,integatyofplasmamembrane,acrosomalstatus,mitoehondria activity,Ca—pacitation,acrosomereactionandbindingooc~emainlybylightmicroscopy,fluorescentmic roscopyorflowc)rt0metrycombiningwithclassicstainingorfluorescentprobetechnology.. Keywords:spermatozoa;acrosome;capacitation;mitoehodfia;spermquality随着人工授精和体外受精技术的不断发展,以及这些技术在生产实践中的应用,如各种哺乳动物的繁育,濒危野生动物的拯救,人类不孕症的解决等,使得精子质量的评价方法也在不断改善.客观,准确的评价精子的功能状态,对于科研和生产实践具有重要的意义.它不仅可以预测雄性动物的繁殖力,而且可以节约精子的用量,使雄性动物的遗传资源得到充分利用,优良的基因得到最广泛传播.评价精液质量的目的就是要快速准确地预测精子的受精能力.在过去的几十年里,主要是通过光学显微镜来评价精子的常规指标,如精液量,精子的密度,精子的运动能力,形态和活力等.这些方法虽然比较简单,但准确性不高.随着生物学的不断发展,精子质量的评价方法不断被改进.现在主要是利用光学显微镜,荧光显微镜,流式细胞记数仪(flowcytometry)等仪器,应用常规染色技术或荧光染色技术来分析精子的功能状态.评价的指标主要是染色质的状态,运动能力,质膜的完整性,顶体的状态,线粒体的活性,获能,顶体反应以及与卵子的结合能力等.这些方法是现在实验室和生产中常用的方法,下面对这些方法进行简单概述.1染色质的结构许多因素可以导致畸形精子的产生,如各种有毒的药剂以及阴囊内温度的偏差等.异常染色质的结构会导致精子的核材料在包装过程中产生差错,这可能与畸形精子的产生有关.牛精子不基金项目:农业科技成果转化资金项目资助(020～413218)作者简介:田恒玖(1978.).男,在读硕士,主要从事野生动物繁殖研究. 收稿日期:2004.08.28第8卷第4期田恒玖等:常用哺乳动物精子质量检测方法正常的染色质结构与精子核的形态之间就有着重要的联系.但在光学显微镜下,通过视觉检查精子的形态并区分精子是否正常,所得的畸形精子数要低于染色质结构试验所得的结果.畸形精子的染色质结构,可以通过染色质结构试验来评价(SCSA).因为DNA的变性位点具有感光性,用异源性的染料吖啶桔(AO)染色,通过流式细胞记数仪,可以看到插入没变性的双链DNA的AO染料发绿色荧光,而与变性的单链DNA结合的AO染料发红色荧光.用SCSA来确定DNA的变性程度,可以准确的预测各种雄性动物精子的受精能力包括人类的精子'.与显微镜观察作比较,SCSA是一种比较灵敏的试验.Karabinus等的研究表明,与阴囊隔离3d的荷斯坦牛的精子经过加热处理后,就可以观测到其染色质结构的变化,而用光学显微镜观察要等到隔离lld后.2质膜的完整性精子的质膜是最易损伤的部位.功能完整的质膜是精子能够新陈代谢,完成获能和顶体反应,以及与透明带(ZP)结合并穿过ZP的基础.在过去的几十年间,人们就已经意识到精子的质膜功能是否完整是区分精子死活的一个重要特征.因而在此基础上发展了许多评价精子质量的方法.2.1常规染色法由于活精子的质膜是完整的,所以不易被台盼兰(typanblue),碘化丙锭(PI)等染料染色.用这些染料来孵育精子,可以使死精子着色,而活精子不着色或只吸收了少量的染料.一些复合的染料像台盼兰一吉姆萨(trypanblue—giemsa),伊红一苯胺蓝(eosin—anilineblue)以及其他一些常规的染料被广泛的用来区分精子的死活.这些染料通常只能为新鲜的精液染色,而冷冻的精液中含有甘油,会影响这些染料的作用.所以,现在常用荧光染料来对冷冻精液进行染色,用荧光显微镜或流式细胞记数仪来分析精子质膜的完整性.用流式细胞记数仪进行评价,可在很短时间内检测大量的精子,比用荧光显微镜检查快得多,但该方法耗资较高,限制了其在实际中的应用.2.2荧光探针染色法荧光探针染色技术的发展,为评价精子的功能状态提供了新的工具.单一或复合的荧光探针都可以被用来评价精子质膜的完整性.使用最多的核酸荧光探针是Hoechst33258(H258),Hoechst33342(H342)以及菲啶类染料,如溴化乙锭(EtBr),碘化丙锭(PI)和溴乙菲啶二聚体(EthD.1).这些染料对于质膜完整的精子不具有渗透性,因此,他们被用来作为死精子的标记,并且在多种荧光染料结合分析时作为对比染料. H258被广泛用来进行核的体外活体染色,现已应用于人类,山羊,绵羊,牛,猪等动物.H258,H342非常适用于多种染料混合时的标记试验.通常这两种染料与具有更长发射波长的染料结合使用. 但H258,H342对于质膜完整的精子具有半渗透性,并且具有广泛的发射光谱易与其他染料的发射光谱重叠,所以在与其他染料结合使用时需要使用过滤器.另外,紫外光对精子和分析人员还具有损害作用.因此在实际中,这些染料不被经常使用.精子的质量也可以用各种双重荧光标记来评价,如用非特异性酯酶基质羧基荧光素双醋酸盐(CFDA)或钙黄绿素乙酰基甲基酯(CAM)与没有膜渗透性的核酸染料结合使用.这两种探针结合使用不但可以测定出精子活力的2个参数——精子内酯酶的活性以及质膜的完整性,同时还可以测定出精子的死活.现已被用来评价多种动物的精子活力,如牛,羊,猪,马等.目前,一种新的具有膜渗透性的核染料SYBR一14被用于活精子的染色.其只能鉴定活精子,一般要与PI结合起来用以评价精子的活力.这2种探针结合起来使用具有染色速度快,染色稳定等一些优点.另外,这2种染料用可见光就可以激发,避免了用紫外光激发对精子和操作者带来的伤害.在可见光的照射下,与活精子结合的SYBR一14发绿色荧光,而与死精子结合的PI发红色荧光.这2种探针结合使用评价精子的活率非常有效,目前认为,SYBR—l4一PI是最适合于各种动物精子死活鉴定的荧光探针. 2.3低渗肿胀试验精子质膜的功能完整性也可以通过低渗肿胀试验(HOST)来测定.精子的细胞膜允许水分子选择性通过,以使精子内外的渗透压达到平衡.在低渗环境中,水分子通过细胞膜流入精子内,为了达到细胞内外的平衡,质膜完整的精子发生肿经济动物2OO4焦胀.由于质膜的肿胀而使精子的尾部发生弯曲, 这种变化在相差显微镜下就可以很容易观察到, 而质膜不完整的精子没有这种现象发生.因此发生肿胀的精子数越多,精子的质量越好.HOST 简单,迅速,对于检验质膜的完整性非常实用.所以被用于人,狗,牛,羊,猪,小鼠和马等动物精子质膜完整性的检测.3精子膜的去稳定精子膜的去稳定可以通过精子内的ca2分布来评价,目前有两类ca2指示剂.一类主要是金霉素(CTC),它能够在ca2浓度高的细胞器内沉积,并与Ca2结合;另一类主要是一些能够进入细胞液等液体环境内的分子颗粒,这些颗粒与ca2结合后会使他们的光谱发生改变.中性的CTC可以很容易的穿过细胞膜,在那里它可以电离出1个阴离子并与ca2结合成螯合物.ca螯合物易与疏水部位优先结合,如膜部位,并能够使其荧光性增强.由于精子质膜状态的不同,精子的功能状态可以区分为几种不同的染色类型.许多研究者发现,人类,小鼠,牛,猪以及其它一些动物具有相同的CTC染色类型.这些染色类型共有3种:①F型,精子的头部具有相同的荧光,为未获能,顶体完整的精子;②B型,在顶体后区无荧光或有非常弱的荧光,为获能且顶体完整的精子;③AR型,整个精子头部无荧光,只在赤道区域有一条荧光带,为顶体反应的精子.可见,CTC不但可以检测精子获能的比例,还可以检测顶体反应的比例.为了证明精子膜的去稳定以及去稳定的程度与受精力成负相关,已进行了许多研究.现已证明,牛精子中F型的发生率与受精力之间负相关.4线粒体的活性线粒体能够不断产生精子运动所需要的ATP来提供能量,因此,线粒体的功能状态是精子质量的一个关键指标.由于活精子的线粒体上存在着跨膜电位,所以阳离子成分的染料若丹明(Rh123) 能在其上沉积.Rh123的吸收速度快,平衡时间短,对温度依赖性小,而且冲洗时无残留,因此一直与EtBr结合使用来评价精子的线粒体的活性. 用Rh123培养精子,活精子的线粒体鞘会被染成绿色,而死精子可以用EtBr或其他荧光染料来区分.在试验中Rh123并不是十分合适的探针,用其染色时,精子必须用乙醛或其他药剂固定,这会影响线粒体的活性.分子探针可以解决这个问题,如已发展的线粒体示踪探针,可以选择性的对有活性的线粒体进行染色,并且精子固定时线粒体的活性也不受影响.虽然Rh123和线粒体示踪探针可以证明线粒体膜电位的存在,但另一种染料JC一1具有独特的特性,能够区分膜电位的高低.用其染色膜电位高的线粒体发桔红色荧光,膜电位低的线粒体发绿色荧光.这些染料经常被用来研究马,牛,羊,猪和大鼠等动物精子的线粒体功能和活性.研究表明,用荧光法测定线粒体的活性与SYBR一14以及显微观察法之间正相关.5顶体的状态哺乳动物精子的顶体反应是受精过程中非常重要的一个过程.具有完整顶体的精子是受精成功的关键.目前,有2类常规的荧光探针可以评价顶体的状态.一类主要是CTC以及一些与细胞外暴露的抗原结合的抗体;另一类主要是外源植物凝集素及一些与精子内顶体抗原结合的抗体,其中的外源植物凝集素常被用来评价顶体的状态.现在用的最多的是异硫氰荧光素(FITC)与豌豆凝集素(PSA),花生凝集素(PNA)或伴刀豆凝集素(ConA)结合使用.这些凝集素被用来评价人类,马,猪,牛,羊等动物精子的顶体状态.用FITC—PSA,FITC—PNA,FITC—ConA来评价顶体的状态简单,迅速,但不能区分精子的死活.因此在用凝集素进行体外活体染色时,一些荧光性的核染料像H258,PI或EthD一1等也被用来结合使用.Ozaki等用H258和FITC—PSA结合使用来评价人类精子的活力以及顶体反应.染色后用荧光显微镜观察,可以看到4种类型的精子:①活的,顶体完整的精子;②活的,顶体反应的精子;③死的,顶体完整的精子;④死的,顶体反应的精子.通过这种方法可以很容易的评价精子的活力和顶体的状态,对评价精子的受精力有着重要意义.FITC—PSA与PI也经常结合起来使用,同时评价质膜的完整性和顶体的完整性H...对于没有渗透性的精子FITC—PSA能够提供精子顶体完整性的信息:顶体完整的精子没有荧光.顶体缺失第8卷第4期田恒玖等:常用哺乳动物精子质量检测方法或发生顶体反应的精子发绿色荧光.PI可以用来作为死精子的标记.用这两种染料来评价精子的活力和顶体的完整性,对于新鲜的,体内获能的精子非常可靠,但不适用于冷冻精液,因为冷冻精液中有蛋黄颗粒,而影响了分析结果的准确性.为了克服蛋黄颗粒的影响,SzabolcsNagy等研究了一种三重染色技术,他们用SYBR一14/PI与藻红素(PE)花生凝集素的结合染料PE—PNA来同时评价质膜的完整性和顶体的完整性, 并结合流式细胞记数仪来检测,分析结果非常准确,还减少了洗去蛋黄颗粒带来的损伤和不便,是一种非常简单,实用的方法,此法将对哺乳动物精子的低温保存的研究有着重要的影响.6精卵之间的相互关系受精过程的各个步骤以及胚胎发育的情况都可用来评价精子的质量,这些或许能对精液的受精能力提供一些有价值的信息.我们知道一个成功的受精过程包括一系列连续的步骤.即:①精子在雌性生殖道内获能;②获能的精子与zP的结合;③精子顶体反应;④精子穿过ZP;⑤精子与卵子质膜融合.受精过程的一个关键步骤就是精子与ZP的结合能力.由于在动物排卵过程中ZP外的多层基质没有了,ZP就成了精子进入卵子的第一道屏障.获能的精子与ZP以一种十分精确的方式相互作用.大量的研究表明,精子与zP的结合分为2个步骤.第一步精子变疏松并不断地转动与卵子的ZP黏附;第二步精子不再转动而与zP紧密的结合.许多精子都可以与ZP黏附并进入ZP,但只有1个精子能够穿透ZP与卵子质膜融合.在透明带结合试验(ZBA)中,精子与同源zP结合的本质特征已经被用来评价精液的受精能力.实际上在ZBA可以用完整的ZP,也可以用半透明带即半透明带结合试验(HZA)来与精子结合.因为要考虑卵子各个不同的结合部位, 所以在ZBA中需要大量的卵子,才能测出精子的受精能力.但有些动物不易获得大量的卵子,反而影响了最后结果的可靠性.在HZA中,卵子被分为两半,用每半来评价精子的结合能力.但对卵子进行等份分割具有一定的难度,目前已经应用于人,马和猪精子能力的分析".就实际操作而言,ZBA和HZA都比较繁琐,而且对操做者的熟练程度依赖性高.用溶解的ZP来评价精子,需要相对少的卵子,是一种非常有前景的方法.其可以克服ZP结合位点的变化所带来的结合精子数目不准确的问题.并且可以用流式细胞计数仪来进行大量精子的检测.总之,精液的质量检测在生产实践中具有重要作用,其首要目的就是要快速,准确的确定精子的受精能力.常规的检测方法可重复性差,准确性低,易受操作者的主观影响,不能准确的反应精子的功能状态.而以上所提到的检测染色质结构,顶体完整性,线粒体活性,以及获能的荧光探针染色技术具有简单,易行和可靠等特点.在精液的质量评价中具有很高的应用价值.如能结合流式细胞记数仪来分析,则能更为客观,准确的评价精子的质量,但流式细胞记数仪价格昂贵,限制了其在实际生产中的应用.准确的预测精子的受精能力,是受精成功的关键.随着动物精子体外保存技术的不断发展,体外评价精子质量的方法吐王在不断的进步.尽管人们做了许多努力来提高预测精子受精能力的准确性,但到目前为止还没有单一的方法或技术能准确的预测精子的受精能力,必须几种方法结合使用,这些方法也只应用人,家畜及试验动物,在野生动物方面还有待进一步研究.参考文献:lIjEvensonDP.Lossoflivestockbreedingefficiencyduetoutleonl—pensablespermnucleardefects[J].ReproductionFertilityandDe velopment,1999,11:1—152jKarabinusDS,V olgerCJ,SaackeRG,eta1.Chromatinstruetural changesinspermafterscrota]insulationofHolsteinbulls[J].Jour—nalofAndrolo~v,1997,18:549555.13jHammerstedtRH,GrahamJK.NolariJP.Cryopreservation0f mammaliansperm:Whatweaskthemtosurvive[J].Journal0f Andrology,1990,11:73—88l4]KrogenesA,Andersen—BergK,HafneAL.et31.Membranealter—ationsnbullspermatozoaafterfreezingandthavdngandafterin vitrofertilization[J].ActaV eterinarySeandinavia,1994,35:17.26?[5]ChengFP,GadellaBM.V oorhoutWF.eta1.Progesterone,in—ducedacrof~mereactioninstMlionspermatozoaismediatedbya plasmamembraneprogesteronereceptor[】].BiologyofReproduc. tion.1998.59:733.7426jNieGJ,WenzelJGWAdaptationofthehypoosmoticswelling testtoasses$functionalintegrityofstallionspermatozoalplasma membranes[J].Theriogenolo~v,2001.55(4):1005.1018.(下转第204页)204经济动物2004矩(TD—PCR)才能扩出目的片段来,但产量甚微,于是决定放弃此对引物,又重新设计并合成了1对新引物(RPN.,RPN).应用新引物扩增时多次扩增出1条约750bp的片段,而"目的片段不出现".针对上述问题,对4种引物进行了分析,发现PN.,PN可作为套式PCR的外引物,而PN,作为内引物,并且3个引物之间无交叉错配现象,不能形成发卡结构和引物二聚体,故此决定采用半嵌套式PCR进行扩增,研究也因此得到了意外的收获,即当产物用EB染色检测不到,而产物中又存在大量的假象带时,应用套式引物来检测目的片段是否已经被扩增出.这合理地解释了为什么第1轮仅扩增出1条约750bp的片段,在第2轮扩增时才出现目的片段.但不可否认第1轮就已经扩增出目的片段,只是产物量少,用EB检测不到(上接第201页)[7]GarnerDL,ThomasCA,JoergHW,eta1.Fluorometricassess—ment~ofmitoehondrialfunctionandviabilityincryopreservedbo? vinespermatozoa[J].BiologyofReproduction,1997,57(6):l40l—l4O6.[8]霍立军,杨增明.哺乳动物精子质量的评价方法[J].动物学杂志,2002,37(2):89—93.[9]OzakiT,TakabashiK,KanasakiH,eta1.Evaluationofacrosome reactionandviabilityofhumanspermwithtwofluorescentdyes【JJ. 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小鼠中的精卵结合：透明带糖蛋白对顶体反应的诱导及一系列事件摘要：在这个研究中，小鼠精子与未受精卵及胚胎，从卵和胚胎中分离出来的溶解的透明带和纯化过的透明带糖蛋白ZP1,2和3（JDBleil和PM Was-sarman，（1989b）Den Bid 76,185-202）的相互作用都已经通过光学、电子显微镜在体外进行了检验。

所述实验是为了确定体外精卵互作过程中事件的短时顺序并且鉴定出诱导小鼠精子发生顶体反应的透明带中的成分。

精卵互作系列的“脉冲追踪”分析揭示了小鼠精子首先疏松接触然后才会紧密地结合到未受精卵的透明带上。

精子与卵子透明带的结合之后紧接着是对顶体反应的诱导。

顶体反应的诱导可以通过透明带介导，因为从未受精卵中分离出的溶解的透明带被发现和钙离子载体A23187在体外诱导顶体反应时同样有效。

此外，从未受精卵而不是二细胞胚胎中分离出来的透明带中纯化的ZP3也和卵中分离的溶解的透明带以及钙离子载体A23187 一样在诱导顶体反应中十分有效。

卵子和排太重ZP1,2以及胚胎中的ZP3和对照组相比对顶体反应几乎没有影响。

这些实验及其他实验（JDBleil和PMWassarman，（1980b）Cell 20,873-882）的结果强烈表明，至少在体外，小鼠精子识别并结合到卵子透明带的ZP3上，并有道顶体反应。

受精后的ZP3的修饰减少了精子和透明带的结合，最终导致对顶体反应的诱导接触、、解除。

引言对于几乎所有的卵细胞，他们都又不止一层的保护层完全包裹质膜。

在棘皮动物中，卵子具有卵黄膜和凝胶膜，而在哺乳动物卵子中则存在透明带。

因为精子必须结合并遗物中特异性方式渗透到外层膜中，他们参与调控了受精前后的精卵互作。

为了使得精子渗透到卵子的外层膜并抵达质膜，他们必须经历“顶体反应”。

该反应包括精子质膜以及顶体膜的融合和大量的膜泡形成，导致内部顶体膜暴露在外(Gwatkin, 1976,1977; Epel 和 Vacquier, 1978; Yanagimachi, 1978; Shapiro 等 1981)。

猪人工授精新技术与操作安全朱士恩（中国农业大学动物科技学院北京 100193）摘要：人工授精的效果与精液质量、输精方法及输精剂量等方面均具有重要相关性。

精液的质量检测是人工授精过程中必不可少的程序。

精液检测的主要目的就是快速、准确地鉴定精子质量，以提高受精能力。

精液常规检测方法虽然已被广泛应用，但其在预测精子受精能力方面仍存在着主观性、误差高等缺点。

因此，客观、准确的评价精子的状态及其受精潜能，对于科研和生产实践具有重要的意义。

本文主要从精液质量的快速检测、检测指标与受精能力的相关性、人工输精方法的改进及操作安全等方面进行介绍，为实验室研究及生产安全操作提供理论与技术参考。

关键词：精液；精液检测；人工授精；操作安全；猪国际上猪人工授精技术始于20世纪30年代，迄今为止其应用已有70多年的历史，我国在上世纪50年代初期也在生产中推广应用。

人工授精不仅可以充分发挥优秀公猪的遗传潜力，也是选种选育的不可或缺的重要手段，同时还可以减少性传播疾病，加快繁殖速度，提高生产效率，获得更高的经济效益。

但随着精液保存技术的发展，尤其是冷冻保存、低温保存及性控精液技术的发展，传统的输精方法及精液品质评价方法已不能够满足人工授精的需要，急需进行更新与改进，以进一步提高人工授精技术在养猪生产中所发挥的重要作用。

客观、准确的评价精子的状态与受精潜能，对于科研和生产实践具有重要的意义。

精子检测的主要目的是快速、准确地确定其受精能力。

常规检测指标有：精液的颜色、气味、pH、精液量、精子的密度、精子的运动能力、形态和活率等，虽然这些指标的检测很重要，但其在预测精子受精能力方面受主观和客观因素的影响，误差很大。

近年来，随着新的技术应用于精液品质检测，可以更加细致地对精子的特征进行评估。

利用荧光染色技术可以对精子的微观功能进行检测，包括质膜完整性、获能状态和顶体状态等。

而联合使用荧光染料，则可以同时检测精子几种功能指标。

而流式细胞仪（flow cytometry，FCM）的应用，可以在短时间内分析大量的经荧光标记的精子，促进了荧光染色技术在精子质量评估中的应用。

《动物生殖与生理学》课程论文（2011-2012学年第一学期）论文题目：顶体反应及其研究进展指导教师：朱士恩等院系：动物遗传育种与繁殖学号：S*********名：***顶体反应及其研究进展摘要顶体反应是动物受精过程不可或缺关键过程，了解并掌握顶体反应的机理有利于我们对受精过程的调控，从而达到控制动物授精率的高低。

本文介绍了精子顶体的结构、顶体反应结构变变化及其机制、顶体反应的调控，而且还阐述了评估检测顶体反应的一些基本方法。

Acrosome reaction is essential for animal fertilization process，the key process to understand and grasp the mechanism of the acrosome reaction will help us control the process of fertilization，so as to achieve the level of control of animal fertilization rate。

This article describes the structure of the sperm acrosome，acrosome reaction structural changes and its mechanism，the regulation of the acrosome reaction，but also describes the assessment of acrosome reaction test some of the basic methods.关键词:顶体反应结构变化机制检测Key words: acrosome reaction structural changes mechanism detect顶体是精子特化的结构，动物精子进入雌性生殖道以后，并不能立即获得受精能力而是需要在雌性生殖道内停留一段时间。

主题策划F E A T U R E1 了解猪冷冻精液1.1 猪冷冻精液应用的优点猪精液冷冻保存的最大优势是可以延长猪精液的使用期限。

常温下新鲜精液使用时间有限，只能在1 d 内使用。

在17℃下用常温稀释液处理的精液，猪精子的存活时间可达2周以上。

利用液氮等为冷源，保存用冷冻稀释液处理的精液，只要精液处于液氮内，理论上可以无限期保存。

从经济效益方面考虑，猪精液冷冻保存可以降低引种及饲养管理成本。

以2022年末为例，全年能繁母猪4 400万头，按年产2.2窝，受胎率80%计算，如果采用本交（公母比例1:30），大约需要150万头的公猪，如果全部使用冷冻精液，按每头公猪年提供4 000头份计算，只需要约3万头公猪，与本交相比，可减少98%的公猪饲养量，极大降低了公猪养殖成本，增加了经济效益。

使用猪冷冻精液精的另外一个优点是提高了优秀种公猪的利用率。

采用本交的配种方式，优秀种公猪的利用率极低，满负荷配种每年可配母猪数仅为100余头，而使猪冷冻精液研究应用进展及问题分析与展望张志彬，于永生，钱芙蓉，李兆华 *（吉林省农业科学院，吉林 长春 130000）项目基金：猪安全高效繁殖技术研发与应用，项目编号：CXGC2021TD009作者简介：张志彬（1982—），男，助理研究员，研究方向为猪遗传育种与繁殖技术*通信作者：李兆华（1973—），男，博士，研究员，研究方向为猪遗传育种与繁殖技术，E-mail:********************用冷冻精液每头优秀种公猪每年可配4 000头以上的母猪。

高性能的种公猪与更多数量的母猪配种，可迅速提高优质基因的覆盖面，再加上冷冻精液便于储存、便于运输、便于使用，不受地域、时间的限制，便于跨区域、跨国引入优秀的种质资源，辐射区域可全球化，打破了鲜精使用区域辐射小的限制，促进品种改良，提高生产性能。

另外，公猪冷冻精液可以在后裔测定或疾病检测后再开始大量供应，为稳定的遗传进展和严格的生物安全提供保障。