下载文档原格式
K 0K t 吸光度A实验二乙酰胆碱酯酶抑制法快速测定果蔬中的残留农药目前有机磷、氨基甲酸酯类农药是我国大量使用的杀虫剂，虽然这类农药与过去使用的有机氯农药相比，降解速度较快，但在果蔬中的残留仍然较为严重。
由于该类农药能抑制人体内乙酰胆碱酯酶的生理活性，神经传导因此受阻，引起神经麻痹乃至死亡，对人类健康造成极大危害。
对于果蔬中的农药通常采用气相色谱等方法进行分析，但分析时间长，操作步骤烦琐，适用于实验室分析。
长期以来在大部分果蔬市场中，通常采用乙酰胆碱酯酶抑制法进行快速检测，即以乙酰胆碱酯酶作为检测试剂，采用农药残留检测仪，根据乙酰胆碱酯酶活性变化的程度来测定果蔬样品中的残留农药。
一、 实验目的1． 了解果蔬中残留农药的分析方法；2． 掌握酶抑制分析方法的原理及操作方法； 3． 理解农药残留性评价的意义。
二、 实验原理有机磷和氨基甲酸酯类农药能抑制昆虫中枢和周围神经系统中乙酰胆碱酯酶的活性，造成神经传导介质乙酰胆碱的积累，影响正常传导，使昆虫中毒致死，酶抑制法就是根据这一昆虫毒理学原理，对农药残留进行检测。
以乙酰胆碱为底物，在乙酰胆碱酯酶（ACHE ）的作用下，乙酰胆碱水解成胆碱和乙酸，胆碱和二硫双对硝基苯甲酸（DNTB ）产生显色反应，使反应液呈黄色（于410nm 处有最大吸收峰）。
根据酶促反应动力学原理，在没有有机磷和氨基甲酸酯类农药存在时，底物在酶的催化作用下发生水解，反应速率可以用吸光度值随时间的变化率K 0来表示。
当有机磷和氨基甲酸酯类农药加入到酶的显色体系中时，农药抑制了酶的活性，影响显色体系的反应速度，此时体系吸光度随时间的变化率为K t ，则有机磷和氨基甲酸酯类农药对酶的活性的抑制率Y 的计算公式如下：%10000⨯-=K K K Y tK 0：空白样品的吸光度随时间变化曲线的斜率值K t ：样品溶液的吸光度随时间变化曲线的斜率值其中K 0和K t 都可通过以下过程进行推导和计算。
有机磷农药对海洋动物乙酰胆碱酯酶(AChE)的毒性效应研究
进展
何东海;孟范平;朱小山
【期刊名称】《海洋通报》
【年(卷),期】2003(022)006
【摘要】近几十年来,农业和海水养殖业所使用的有机磷农药(OPs)造成沿岸海水的严重污染,威胁到海洋动物的生存.有机磷农药的海洋生态毒理学研究已经成为海洋环境科学中的热门领域之一.作为动物神经传导过程中的关键酶,乙酰胆碱酯酶(AChE)能够被有机磷农药专一性抑制,因此,有机磷农药对海洋动物AChE的影响受到更多的关注.本文以近年来该领域的研究成果为基础,综述了有机磷农药对海洋动物乙酰胆碱酯酶的毒性效应.
【总页数】8页(P71-78)
【作者】何东海;孟范平;朱小山
【作者单位】中国海洋大学海洋生命学院,山东,青岛,266003;中国海洋大学海洋生命学院,山东,青岛,266003;中国海洋大学海洋生命学院,山东,青岛,266003
【正文语种】中文
【中图分类】X171.5
【相关文献】
1.鲫鱼脑乙酰胆碱酯酶(AChE)的活性测定及对有机磷农药的敏感性研究 [J], 刘晓宇;郝强;吴谋成;杨健;徐盈
2.南海海港疏浚淤泥悬浮物对海洋动物的急性毒性效应 [J], 李纯厚;林燕棠
3.天津港口疏浚淤泥悬浮物对海洋动物的急性毒性效应 [J], 陈永平;王娟娟;李兆千;王宝峰;易伟;缴建华
4.三唑磷对中华乌塘鳢乙酰胆碱酯酶毒性效应及在环境评价中的应用研究 [J], 何东海;叶慧明;沈锡权;王晓波;朱志清;张志伟
5.沙蚕暴露于石油烃、Cu^(2+)和Cd^(2+)毒性效应及乙酰胆碱酯酶活性的响应[J], 王晶;周启星;张倩茹;张颖
因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
有机磷杀虫剂中毒与标志酶有机磷杀虫剂是我国目前使用最广泛的农业杀虫剂，其对人畜的急性毒性主要是对乙酰胆碱酯酶(AChE)的抑制，引起乙酰胆碱(ACh)积蓄，导致先兴奋后衰竭的一系列毒蕈碱样、烟碱样和中枢神经系统等症状，严重患者可因昏迷和呼吸衰竭而死亡。
AChE被认定为有机磷杀虫剂中毒的标志酶，尚有神经病靶酯酶、羧酸酯酶、丁酰胆碱酯酶(BChE)和芳香酯酶被认定为有机磷杀虫剂中毒的标志酶。
1.AChE：AChE活力被抑制，失去分解ACh的能力，造成ACh 堆积，引起神经功能紊乱是有机磷杀虫剂中毒的公认的机制。
有机磷杀虫剂中毒后，机体内胆碱酯酶(ChE)发生自发复活和不可逆的老化两个过程，这两个过程的发生率取决于有机磷杀虫剂的磷酰基与AChE 的活性基团的自然结合情况，主要是活性基团上的丝氨酸磷酰化。
机体内不同部位的AChE受有机磷杀虫剂抑制的灵敏度不同，位于红细胞、胃、脑和肝上的AChE容易被抑制［1］，故可测定全血或红细胞的AChE被抑制的程度来判断机体中毒的程度。
但要指出的是:Genc等［2］指出血清AChE受年龄、怀孕、产褥期、肥胖和一些药物如可卡因以及肝脏疾病等多种生理和病理因素的影响。
Kenneth等［3］报道在欧洲人群中有4%的人先天性AChE缺乏。
一项对127名不接触有机磷的人群调查显示有5人(3.9%)AChE低于正常，其中有4人(3.1%)为ChE缺乏的杂合子［3］，故在以患者血清AChE水平作为有机磷杀虫剂中毒的依据时应考虑这种情况。
AChE除可用作有机磷杀虫剂中毒的诊断依据外，还可用来治疗有机磷杀虫剂中毒。
Saxena等［4］指出:AChE可以有效地用来治疗老鼠和恒河猴的有机磷杀虫剂中毒。
与AChE氨基端第200位的活性丝氨酸相邻的第199位谷氨酰胺被谷氨酸取代后，AChE 的老化速度减慢，这种经过改造的E202QAChE的活力比原型AChE大2～3倍，可用来治疗有机磷杀虫剂中毒。
酶抑制法检测蔬菜中有机磷农药残留分析作者：赵阳来源：《乡村科技》2016年第30期[摘要] 目前对于蔬菜中有机磷农药残留检测的研究有很多，传统的气相色谱分析和液相色谱分析技术由于设备和操作方法的限制，不能大规模推广。
酶抑制法具有检测快速、设备简单、精度较高等优势，近年来发展很快。
[关键词] 酶抑制法；有机磷农药；检测技术；植物酯酶[中图分类号] S481.8 [文献标识码] A [文章编号] 1674-7909（2016）30-93-1有机磷农药最早在20世纪30年代开始研制使用，1944年世界范围内就出现了100多种有机磷杀虫剂。
目前，有机磷农药在我国农业生产中应用较广，过量使用及清洁不完全造成的农药残留严重威胁着人们的身体健康。
酶抑制法是一种简便、灵敏、经济的快速检测方法，其是基于有机磷农药对酶活性的抑制作用。
用酶抑制法测定有机磷农药的毒性最为直接、最为专一，且方法灵敏，对前处理步骤要求低，在较短的时间就能得到检测结果。
1 酶抑制法检测蔬菜中有机磷农药残留1.1 样品前处理技术检测样品的前处理过程包含提取过程和净化过程。
提取是指将蔬菜中的农药溶解分离出来的操作步骤，现阶段使用效果较好的提取剂有乙酸、甲醇、乙醇等，而采用辅助设备能有效提高提取效率。
净化指的是取出样品中无关成分干扰的过程，对于农产品来说，有机分子的成分复杂，特别是大分子的蛋白质和氨基酸严重影响提取结果，对于目标农药的检测会造成较大的影响。
SPE萃取技术是现阶段应用较广的有机磷农药检测前处理技术，先进的SPE萃取技术是一种结合了液固萃取和色谱技术的新型有机磷农药检测萃取技术。
萃取柱是一种以氧化铝、硅胶等具有较强吸附能力的物质为主的离子交换柱，该项技术具有溶剂使用量小、重复性高、环境友好等诸多优点，在实际应用中与高压液相色谱技术相结合，能有效检测有机磷农药残留。
1.2 乙酰胆碱酯酶检测有机磷农药残留乙酰胆碱酯酶检测技术所依据的昆虫毒理学原理是：有机磷农药对于昆虫中枢神经和周围神经系统有一定影响，主要体现在乙酰胆碱酯酶的活性方面，导致乙酰胆碱的传输障碍并积累，昆虫中毒致死。
实验三杀虫剂对乙酰胆碱酯酶活性的抑制作用一、试验原理和目的在昆虫中枢神经系统的兴奋性突触中，乙酷胆碱是主要神经递质，它通过生物合成、释放以及与受体的结合，使得神经传导能正常进行。
当神经接受到某一刺激时，冲动传导到突触处，就由突触前膜释出含有乙胆碱的小囊胞，一次冲动可释出小囊胞100-150个，每个小囊胞含有乙酰胆碱(ACh)分300-2000个。
在突触后膜上约有乙酰胆碱分子900个就可产生局部膜电位的去极化，致神经传导正常进行。
多余的乙酰胆碱分子及完成刺激受体后而解离的乙酰胆碱分子应立即被突触间隙的乙酰胆碱酯酶(AChE)所水解，使神经又处于静止状态而有利于迎接下一个刺激。
因此，比较乙酰胆碱酯酶的活力和性质，可以作为测定神经递质的一个指标。
有机磷酸酯和氨基甲酸酯类杀虫剂在昆虫体内主要作用于神经系统，抑制胆碱酯酶的活性，导致神经传导的阻抑而引起昆虫中毒死亡。
研究其毒理机制，胆碱酯酶活力是重要指标之一。
其活力测定方法较多，发展较快，有测压和测pH法、比色法、电化学法、荧光法、放射法等。
其中比色法中由于应用的底物和显色剂不同，又有不同的测定方法。
本实验主要介绍一种常用的比色测定方法乙酰硫代胆碱一二硫双对硝基苯甲酸法(ASCh一DTNB法)。
该法是Ellmanl961年创制的方法，其原理是应用乙酰硫代胆碱(ASCh)为底物，在胆碱酯酶作用下水解为硫代胆碱及乙酸，然后以二硫双对硝基苯甲酸(DTNB)为显色剂，形成黄色产物，在412nm处有最大吸收峰。
生成物浓度和光密度在一定范围内密切相关，故用分光光度计可以进行定量测定，以此代表AChE的活性。
本实验通过测定有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂对昆虫乙酰胆碱酯酶活力的影响，以理解该两类杀虫剂的作用机理，并熟练掌握该酶活性测定方法。
二、仪器、试剂和材料1. 仪器721型分光光度计、冰箱、离心机、恒温水浴、匀浆器、具筛刻度试管、吸管等。
2. 供试昆虫5或6龄的粘虫或家蝇成虫。
