三种检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌方法的比较

三种鉴定葡萄球菌凝固酶方法的比较目的评价3种鉴定葡萄球菌凝固酶方法的敏感性和特异性。

方法临床分离的110株葡萄球菌，经过革兰染色，显色培养基显色培养，触酶试验，VITEK32鉴定后，用试管法、玻片法、商品乳胶血凝法（slidex staph-kit），鉴定葡萄球菌和评价凝固酶试验方法。

3种方法结果不一致的菌株进行重复试验。

用兔血浆试管法作为标准，比较其它凝固酶方法的敏感性、特异性。

结果兔血浆试管法检测到65株阳性菌株，以此为标准，兔血浆玻片法有3株假阳性，人血浆玻片法和乳胶血凝法的假阳性分别为8株和2株。

人血浆试管法的鉴定符合率为100%，其余各种方法的敏感性均为100%，而特异性（兔血浆和人血浆玻片法，乳胶凝集试验）分别为95.6%，88%，和98.5%。

结论人血浆凝固酶试管法敏感性特异性均较高，是鉴定葡萄球菌凝固酶试验的好方法，适合于各基层临床实验室对葡萄球菌的鉴定。

标签：金黄色葡萄球菌；血浆凝固酶；乳胶试剂耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）是医院内感染的重要病原菌，然而临床标本中金黄色葡萄球菌鉴定中往往困扰者广大检验工作者，血浆凝固酶试验是鉴定金黄色葡萄球菌的重要方法之一。

鉴定的准确性直接关系到进一步上机鉴定及药敏试验判断及MRS纸片法筛选判断。

凝固酶分为两种：游离性凝固酶，结合型凝固酶，游离型凝固酶常用试管法鉴定，结合型凝固酶常用玻片法鉴定。

随着现代微生物技术的不断发展，许多医院开始选用法国梅里埃公司生产的葡萄球菌乳胶凝集试剂作为检出金黄色葡萄球菌的常规筛选试验试剂，虽然乳胶试剂盒简便，快速，但是易出现假阳性且价格昂贵。

为寻找一种适合广大基层医院实验室对葡萄球菌鉴定经济，简便的鉴定方法。

本文以兔血浆试管法为标准[1]，对110株临床分离的葡萄球菌凝固酶分别进行兔血浆，人血浆凝固酶试验和乳胶凝集试验。

评价其敏感性，特异性。

1 材料与方法1.1材料1.1.1菌株来源110株葡萄球菌均来自于我院2011年12月～2013年9月临床分离菌株，保存于-20℃低温冰箱，实验前接种于5%羊血基础平板，取对数生长期菌落进行试验。

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌三种筛查方法比较目的: 以PCR检测的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的mecA基因为金标准，比较耐甲氧西林金葡菌快速胶乳凝聚检测法、头孢西丁纸片法、苯唑西林纸片法三种检验方法在MRSA筛查中的特异性和敏感性。

方法：采用NCCLS 推荐的30 μg头孢西丁纸片法和苯唑西林纸片法，以及快速乳胶法检测。

结果：苯唑西林纸片法检测MRSA阳性47株，阴性36株，敏感性94%，特异性94.7%。

头孢西丁纸片法检测MRSA阳性49株，阴性38株，敏感性98%，特异性100%。

快速胶乳检测法检测MRSA阳性49株，阴性37株，敏感性98.0%，特异性97.4%。

结论：头孢西丁纸片法、快速胶乳检测法与PCR法这个金标准有很高的一致性。

标签：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）；头孢西丁纸片法；快速乳胶检测法；苯唑西林纸片法；筛查耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA) 的临床院感率不断上升，在世界各地医院都有感染流行，甚至发生暴发流行，几乎在所有使用抗生素的地方都有MRSA 存在，已引起全球范围内的广泛关注[1]。

PCR法检测MRSA特异的青霉素结合蛋白2α（PBP2α）的mecA 基因，是国际公认的金标准，但因为设备、试剂费用高，实验要求严格等因素临床实验室难以常规开展。

本实验通过检测已经经过PCR法检测过的菌株88例，探讨苯唑西林纸片法、头孢西丁纸片法、快速乳胶检测法三种方法的敏感性、特异性和临床实用性。

现报道如下：1 材料与方法1.1 实验材料和试剂1.1.1 菌株来源实验菌株为2003年5月来本院微生物实验室从临床标本分离出的金黄色葡萄球菌88株，标准参考菌株ATCC 25923来自军事医学科学院微生物流行病研究所。

1.1.2 材料和试剂MRSA快速胶乳检测试剂由英国Oxoid公司生产。

头孢西丁纸片（30 μg）、苯唑西林纸片（1 μg）购自北京天坛药物生物技术公司。

水解酪蛋白（M-H）琼脂为杭州天和微生物试剂有限公司产品。

mrsa定义及判断标准
MRSA（Methicillin-Resistant Staphylococcus Aureus），即耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，是一种对甲氧西林和其他类似药物具有耐药性的金黄色葡萄球菌菌株。

判断MRSA的标准包括以下几个方面：
1. 临床症状：与常规的金黄色葡萄球菌感染相似，可能包括红肿、疼痛、渗出液等。

但MRSA感染较常规金黄色葡萄球菌感染更难治疗。

2. 细菌培养：从感染部位的样本中进行培养，并鉴定是否为金黄色葡萄球菌。

通过抗生素敏感性试验判断细菌是否耐甲氧西林。

3. 分子生物学检测：通过PCR等分子生物学技术检测细菌的基因，确认是否为MRSA。

4. 抗生素敏感性检测：对细菌进行抗生素敏感性测试，确定其对常用抗生素的耐药性情况。

5. 判断耐药基因：通过检测细菌的耐药基因，确定其是否携带了与甲氧西林耐药相关的基因。

需要注意的是，MRSA的判断需要进行细菌培养和特殊检测方法，不能只依靠临床症状诊断。

金黄色葡萄球菌检测方法1.纸片法目前广泛应用的一种方法，用纸片、膜、胶片等作为培养基载体，将特定的培养基和显色物质附着在上面，通过观察微生物在测试片上面的生长、显色来测定食品中微生物。

采用快速测试片检测具有显著的优点：可测定少量检品，不需要配制试剂，不需要大量的玻璃器皿，操作简便迅速；易于消毒保存，便于运输携带方便，价格低廉；除纸片外无其他任何废液废物，大大减少了工作量；可以在取样时同时接种，结果更能反映当时样本中真实细菌数，防止延长接种时间时细菌繁殖造成的污染。

技术优点：操作简单使用方便，避免了繁琐的操作。

技术缺点：用时间比较长，无法准确定性及计数。

此方法现在应用于快速检测领域，美国3M公司Petrifilm为载体的测试片应用最为广泛。

但其也存在一些问题：Petrifilm测试片上覆盖了一层薄膜，当样品粘液过多时会出现菌落的扩散和融合，影响计数；Petrifilm测试片面积较小，当菌量大于250cfu时，准确计数较困难；待测样品中含有的某些有机物可能使显色减缓。

使目视效果下降，导致计数偏低。

2.免疫学方法各种免疫学方法的基本原理都是抗原抗体反应。

抗原抗体反应是指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应。

金黄色葡萄球菌特异的抗原能激发机体产生相应的特异性抗体。

在免疫检测中，可利用单克隆抗体检测金黄色葡萄球菌的特异抗原，也可利用金黄色葡萄球菌抗原检测体内产生的特异抗体，两种方法均能判断机体的感染状况。

目前对于金黄色葡萄球菌的测定主要进行了肠毒素的测定，方法以酶联免疫吸附实验为主，有胶体金方法，也有用亲和素一生物素乳胶凝集实验和免疫荧光实验，但都有一定的局限性。

免疫学方法包括下面两个部分：（1）抗原抗体技术分析：抗原抗体技术是免疫技术中的核心部分，对于金黄色葡萄球菌检测全菌免疫筛选抗体是很困难的事情，现在目前市场有的大多都是对金黄色葡萄球菌毒素类进行免疫得到的抗体，金黄色葡萄球菌毒素有12种，军事医学科学院生产的金黄色葡萄球菌毒素A、B、C的抗体。

辽宁大学学报自然科学版第40卷第3期2013年J oU R N A L oF uA oN I N G U N r vE R sl T YN at u r al Sci enc es Edi t i onV ol_40N o．32013。

耐甲氧西林葡萄球菌临床检测方法评价陈烨+，王蕊，卢红，邓晶晶，刘晶，王洋，刘举(辽宁大学药学院辽宁省新药研发重点实验室，辽宁沈阳110036)摘要：目的评价三种方法检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(M R SA)和耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌(M R C N S)的可靠性和临床实用性．方法根据N C C I_s的判定标准，采用m ecA基因PC R扩增法检测临床分离的85株金黄色葡萄球菌和80株凝固酶阴性葡萄球菌，并与苯唑西林琼脂稀释法和头孢西丁纸片扩散法进行比较．结果苯唑西林琼脂稀释法筛选M R SA(M R C N S)的检出率分别93．75％(95．35％)、95．24％(54．05％)；头孢西丁纸片扩散法筛选M R SA(M R C N S)的检出率分别为98．43％(95．35％、)、90．48％(64．86％)．结论对于M R S A的检测，选用PC R扩增法，该法具有快速、灵敏和特异性强的特点，且纸片法与PC R扩增法检测结果符合率很高；对于M R C N S的检测，通过表型法筛选后，最好能得到m eeA基因的确证．关键词：M R SA；琼脂稀释法；纸片扩散法；m e cA基因；PCR中图分类号：R378．1文献标志码：A文章编号：1000-5846(2013)03-0278-06E val uat i on of C l i ni cal Tes t i ng M et hod f or D et eet i on ofM et hi ci H i n-r esi s t ant St aphyl ococcusC H E N Y e+，W A N G R ui，L U H ong，DE N G Ji ng-j i ng，LI U Ji ng，W A N G Y ang，L I U J u(School of Pha r m a c y，L i a oni ng U ni ve r s i t y，N ew D r ug R&D K ey Labor a t or y ofL i a oni ng Pr ovi nc e，S henya ng110036，C hi na)A bs t ract：O bj ect i ve：T o eva l ua t e t he cl i ni cal r el i abi l i t y and appl i cat i on of t he t hr ee m et hodsf or det ect i on of m et hi ci l l i n r es i s t ant st aph)7l oc occus a ur eus(I V l R S A)a nd m et hi ci l l i n r es i s t antc oa gul a se negat i ve s t aphyl ococci(M R C N S)．M et hods：A ccor di ng t o t he st andard of N C C LS，at ot a l of85s t r ai ns of SA U and80s t r ai ns of C N S w hi ch w e r e i s ol at ed f r om cl i ni cal s peci m ens w erede ce t e d by m ecA PC R as say，and com p ar i ng w i t h oxaci l l i n aga r di l u t i on m et hod and cef oxi f i ndi sks di f f usi o n m et hod．R es ul t s：The s ens i t i vi t y and s peci fi ci ty of oxaci l l i n agar di l u t i on m et hodf or det ect i ng M R SA(M R C N S)w er e93．75％(95．35％)and95．24％(54．05％)respect i vel y．收稿日期：2013—03—29基金项目：国家“十二五”规划“重大新药创制”重大科技专项资助项目(2011Z X09102一007—02)；辽宁大学“211工程”三期建设重点资助项目+作者简介：陈烨(1965一)，男，汉族，沈阳人，副研究员，硕士生导师，主要从事抗肿瘤药物、抗微生物病原菌药物的研制，Tcl：139********E—m ai l：．s y-che nye@163．t om ．第3期陈烨，等：耐甲氧西林葡萄球菌临床检测方法评价279T he s ens i t i vi t y and s peci f i ci t y of cef oxi t i n di sk di f f usi o n f or det ect i ng M R S A(M R C N S)w er e 98．43％(95．35％、)and90．48％(64．86％)respect i vel y．Concl us i on：Sel ect ed PC R m et hod f or det ect i on of M R SA，beca us e i t s f as t，s ens i t i vi t y and speci f i cit y，and hi曲l oadi ng r at e of t he di s k di f f usi o n m et hod．D et ect i on of M R C N S，af t er phe not ypi c s cr eeni ng，i t i s bes t t O be concl usi vee vi de nce Of t he m ecA ge ne．K ey w or ds：M R SA；agar di l u t i on m et hod；di sk di f f usi o n m et hod；m ecA gene；PC R自从耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(M R SA)于1961年首次被发现后，其在医院感染患者中所占的比例逐年攀升，目前已被列为临床三大感染源之一…．在美国，临床分离的金葡菌中M R SA的比例从1975年的2．4％上升到2003年的59．5％【2'31；目前美国分离率约50％～70％[4J；而我国，2001年M R SA的分离率为37．4％，2008年达到62．3％”J．同时，由耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌(M RC N S)引起的导管相关感染以及与置人人工假体引起的相关感染的发病率逐年上升．因此，快速准确的检测M R SA和M R C N S对于医院预防和治疗由这两种耐药菌引起的感染具有现实意义．本实验采用苯唑西林琼脂稀释法、头孢西丁药敏纸片法和PC R扩增法对临床分离的85株金黄色葡萄球菌和80株凝固酶阴性葡萄球菌进行测定，并对实验结果进行了评价．1仪器与材料1．1仪器设备PCR扩增仪(德国ana l yt i k l er a com pany)；琼脂糖凝胶电泳(北京君意东方电泳设备有限公司，JY一600C)；凝胶成像分析仪(北京君意东方电泳设备有限公司，J Y04S一3C)；T G L一20M高速台式冷冻离心机(湘潭湘仪仪器有限公司)．1．2菌株及来源85株金黄色葡萄球菌和80株凝固酶阴性葡萄球菌，来自中国人民解放军沈阳军区总医院临床分离的菌株；标准菌株金葡菌(A T C C29213)和金葡菌(A TC C25923)作为阴性对照，M R SA(A TC C 43300)作为阳性对照，均购自卫生部临床检验中心．1．3主要试剂头孢西丁(30pg／片)和M H培养基购自北京天坛生物制品公司；苯唑西林购自中国药品生物制品检定所；PC R试剂：Taq酶、10X buf f er、dN TPs为T aK aR a公司产品；D N A M a r ke r为北京天根生化科技有限公司产品；溶菌酶、蛋白酶K、％s(pH=8．0)、ED TA、SD S、酚混合液购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司．1．4寡核苷酸引物m ec A基因扩增引物：上游引物pl：5'-TG G C T AT C GT G T C A C恕盯C G一3’，下游引物p2：5’一C T GG A AC T T G，丌G A G C A G A G-3’由北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司合成．2实验方法2．1菌悬液制备挑取单个菌落于M H培养基中，于37℃恒温孵育16—18h，用生理盐水稀释菌悬液至终浓度为280辽宁大学学报自然科学版2013正0．5麦氏比浊度(1．5×108cf u／m L)．2．2琼脂稀释法将苯唑西林倍比稀释成12个浓度，浓度范围在1280—0．6仙g／m L．将稀释好的不同浓度的苯唑西林分别再与灭菌的M H琼脂液以1：9的比例混匀．用多头接种器将菌液(约107c f u／m L)接种在培养基上，每接种点细菌量为104cf u／m L，置35℃恒温箱中孵育16～24h后菌落生长被完全抑制的最低浓度为苯唑西林对此菌的M I C根据N C C LS的M I C常规标准的规定，对于金黄色葡萄球菌，苯唑西林M I C≤2斗g／m L为耐药，M I C≥4斗g／m L为敏感；对于凝固酶阴性葡萄球，苯唑西林M I C≤0．251乩g／m L为耐药，M IC，>0．5“g／m L为敏感．2．3纸片扩散法用无菌棉签蘸取菌悬液，挤出多余水分后均匀涂布于含4％N a C l的琼脂表面，然后将含30斗g 头孢西丁的药敏纸片贴于其上，每株菌涂两个琼脂平板，置35℃恒温箱中孵育24h后记录抑菌圈直径．根据N C C LS判定标准N o：对于金黄色葡萄球菌，头孢西丁抑菌圈直径妒≤19m／n为耐药，妒≥20m m为敏感；对于凝固酶阴性葡萄球菌，头孢西丁抑菌圈直径t p，<24m l T l为耐药，q够>25t oni为敏感．2．4PC R扩增法2．4．1D N A模板的制备取0．5麦氏浊度的菌悬液1m L置于E P管中，以2500r／m i n的转速离心15m i n，弃去上清液，加入20斗g／m L溶菌酶100I xL，振荡，在37℃水浴中放置30m i n；于15000r／m i n(4℃)离心10m i l l；弃上清，加入1m g／m L蛋白酶K40止、T E一10％SD S100止，在55℃水浴中放置1h，煮沸5m i n；加入生理盐水300止、N aCl溶液(5m oV L)5止和400w E酚的混合液(酚一氯仿一异戊醇，体积比=25：24：1)，均匀混合，于15000r／m i n离心10m i n．取400止水相，加l m L冷无水乙醇，再于15000r／m i n离心10m i n，弃去上清液，加75％酒精400止，洗涤沉淀1次，10000r／m i n离心5m i n．干燥后加入50止TE缓冲溶液，即制得细菌的D N A模板【6]．2．4．2PC R扩增扩增反应的总体积为25止：10×buf f e r(20m M M92+)2．5止、dN TPs(10m m oV L)2止、引物1和引物2(10斗m ol／L)各1止、T aq酶(2U／止)1．5斗L、模板2曲、无菌双蒸水15止．扩增参数：94℃预变性5m i n，94℃变性30S，52．5℃退火30S，72oC退火100s，30个循环后，72℃再延伸5m i n，14oC终止反应．2．4．3扩增产物的鉴定取扩增产物10“L，加入5止l oadi ng buf fer染色，经1．5％琼脂糖进行电泳，100V电压下电泳1h，溴化乙锭染色后于紫外凝胶成像仪上观察结果．3结果3．1三种方法的阳性检出率采用苯唑西林琼脂稀释法、头孢西丁纸片扩散法、PC R扩增法检测了85株金黄色葡菌球菌和80株凝固酶阴性葡萄球菌中的M R SA和M R C N S，其阳性检测结果见表1．结果显示，三种方法检出M R S A的阳性率并无差别；而P C R扩增法检出M R C N S的阳性率低于其他两种方法，两种表型法检测M RC N S的阳性率无差别，但阳性率明显低于PC R扩增法．第3期陈烨，等：耐甲氧西林葡萄球菌临床检测方法评价281表1M R SA和M R C N S的阳性检出率苯唑西林琼脂稀释法与PC R扩增法相比，检测M RSA的检出率分别为93．．75％、95．24％、94．12％；检测M R C N S的检出率分别为95．35％、54．05％、77．25％．实验结果见表2．此种方法检测M R SA的灵敏性和特异性较高；检测M R CN S的敏感性较高，但特异性较低．3．2琼脂稀释法与PC R扩增法比较M R SA和M R C N S的m ec A基因扩增产物一致，即在分子量为310bp处出现D N A条带，如图1．’I■。

金黄色葡萄球菌根据其对甲氧西林的耐药性可分为MRSA(耐甲氧西林金黄色葡萄球菌)和MSSA(甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌)。

自从19世纪60年代发现第一株MRSA以来，MRSA在全球的分离率逐年升高。

菌株分型是医院获得性感染的流行病学研究的重要方法之一，在过去的五年里，细菌分型的方法有了突飞猛进的发展，我们就目前常用于MRSA分子分型的技术进行比较。

1 SCCmec分型1.1 SCCmec的定义和结构SCCmec是一个可移动的复合体结构，大小从21~67 kb不等，可以整个地从染色体中自发剔除，也可从一个菌细胞转移整合到另一个菌细胞染色体中。

根据目前的研究结果推测：SCC是一个基因交换的载体，SCCmec只是SCC家族中携带有mecA 基因的一个特例，?MRSA的产生，是对甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌(methicillin-suseeptible staphylococcus aureus MSSA)通过SCC从其他菌株中获得mecA 的结果，它同样可以使其他抗生素耐药基因在葡萄球菌间传递，这可能是MRSA容易获得多重耐药的根本原因。

SCCmec的结构复杂，因外来基因整合数量不同其大小也不同。

总体来说，它由两部分组成：第1部分是特征性结构，存在于所有的MRSA中，包括：保守的末端正序重复序列(direct repeat sequence，DR)和(或)反序重复序列(inverted repeat sequence，IR)、mec操纵子、在mecA基因左右存在的保守的基因结构以及负责SCCmec移动的ccr基因;第2部分是功能未明确或无功能区。

1.2 以下是近几年来发展的几种SCCmec分型的PCR方案：1)Boye等人[1]应用四对引物的多重PCR可以进行MRSA菌株Ⅰ型到Ⅴ型的简单快速分型，但不能区分亚型，适于实验室快速初筛。

2)Zhang等人[2]多重PCR方法可同时检测Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳa、Ⅳb、Ⅳc、Ⅳd、Ⅴ8个主要的型和亚型，还扩增mecA基因作为阳性内参。