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三种鉴定葡萄球菌凝固酶方法的比较目的评价3种鉴定葡萄球菌凝固酶方法的敏感性和特异性。
方法临床分离的110株葡萄球菌，经过革兰染色，显色培养基显色培养，触酶试验，VITEK32鉴定后，用试管法、玻片法、商品乳胶血凝法（slidex staph-kit），鉴定葡萄球菌和评价凝固酶试验方法。
3种方法结果不一致的菌株进行重复试验。
用兔血浆试管法作为标准，比较其它凝固酶方法的敏感性、特异性。
结果兔血浆试管法检测到65株阳性菌株，以此为标准，兔血浆玻片法有3株假阳性，人血浆玻片法和乳胶血凝法的假阳性分别为8株和2株。
人血浆试管法的鉴定符合率为100%，其余各种方法的敏感性均为100%，而特异性（兔血浆和人血浆玻片法，乳胶凝集试验）分别为95.6%，88%，和98.5%。
结论人血浆凝固酶试管法敏感性特异性均较高，是鉴定葡萄球菌凝固酶试验的好方法，适合于各基层临床实验室对葡萄球菌的鉴定。
标签：金黄色葡萄球菌；血浆凝固酶；乳胶试剂耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）是医院内感染的重要病原菌，然而临床标本中金黄色葡萄球菌鉴定中往往困扰者广大检验工作者，血浆凝固酶试验是鉴定金黄色葡萄球菌的重要方法之一。
鉴定的准确性直接关系到进一步上机鉴定及药敏试验判断及MRS纸片法筛选判断。
凝固酶分为两种：游离性凝固酶，结合型凝固酶，游离型凝固酶常用试管法鉴定，结合型凝固酶常用玻片法鉴定。
随着现代微生物技术的不断发展，许多医院开始选用法国梅里埃公司生产的葡萄球菌乳胶凝集试剂作为检出金黄色葡萄球菌的常规筛选试验试剂，虽然乳胶试剂盒简便，快速，但是易出现假阳性且价格昂贵。
为寻找一种适合广大基层医院实验室对葡萄球菌鉴定经济，简便的鉴定方法。
本文以兔血浆试管法为标准[1]，对110株临床分离的葡萄球菌凝固酶分别进行兔血浆，人血浆凝固酶试验和乳胶凝集试验。
评价其敏感性，特异性。
1 材料与方法1.1材料1.1.1菌株来源110株葡萄球菌均来自于我院2011年12月～2013年9月临床分离菌株，保存于-20℃低温冰箱，实验前接种于5%羊血基础平板，取对数生长期菌落进行试验。
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌三种筛查方法比较目的: 以PCR检测的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的mecA基因为金标准，比较耐甲氧西林金葡菌快速胶乳凝聚检测法、头孢西丁纸片法、苯唑西林纸片法三种检验方法在MRSA筛查中的特异性和敏感性。
方法：采用NCCLS 推荐的30 μg头孢西丁纸片法和苯唑西林纸片法，以及快速乳胶法检测。
结果：苯唑西林纸片法检测MRSA阳性47株，阴性36株，敏感性94%，特异性94.7%。
头孢西丁纸片法检测MRSA阳性49株，阴性38株，敏感性98%，特异性100%。
快速胶乳检测法检测MRSA阳性49株，阴性37株，敏感性98.0%，特异性97.4%。
结论：头孢西丁纸片法、快速胶乳检测法与PCR法这个金标准有很高的一致性。
标签：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）；头孢西丁纸片法；快速乳胶检测法；苯唑西林纸片法；筛查耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA) 的临床院感率不断上升，在世界各地医院都有感染流行，甚至发生暴发流行，几乎在所有使用抗生素的地方都有MRSA 存在，已引起全球范围内的广泛关注[1]。
PCR法检测MRSA特异的青霉素结合蛋白2α（PBP2α）的mecA 基因，是国际公认的金标准，但因为设备、试剂费用高，实验要求严格等因素临床实验室难以常规开展。
本实验通过检测已经经过PCR法检测过的菌株88例，探讨苯唑西林纸片法、头孢西丁纸片法、快速乳胶检测法三种方法的敏感性、特异性和临床实用性。
现报道如下：1 材料与方法1.1 实验材料和试剂1.1.1 菌株来源实验菌株为2003年5月来本院微生物实验室从临床标本分离出的金黄色葡萄球菌88株，标准参考菌株ATCC 25923来自军事医学科学院微生物流行病研究所。
1.1.2 材料和试剂MRSA快速胶乳检测试剂由英国Oxoid公司生产。
头孢西丁纸片（30 μg）、苯唑西林纸片（1 μg）购自北京天坛药物生物技术公司。
水解酪蛋白（M-H）琼脂为杭州天和微生物试剂有限公司产品。
mrsa定义及判断标准
MRSA（Methicillin-Resistant Staphylococcus Aureus），即耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，是一种对甲氧西林和其他类似药物具有耐药性的金黄色葡萄球菌菌株。
判断MRSA的标准包括以下几个方面：
1. 临床症状：与常规的金黄色葡萄球菌感染相似，可能包括红肿、疼痛、渗出液等。
但MRSA感染较常规金黄色葡萄球菌感染更难治疗。
2. 细菌培养：从感染部位的样本中进行培养，并鉴定是否为金黄色葡萄球菌。
通过抗生素敏感性试验判断细菌是否耐甲氧西林。
3. 分子生物学检测：通过PCR等分子生物学技术检测细菌的基因，确认是否为MRSA。
4. 抗生素敏感性检测：对细菌进行抗生素敏感性测试，确定其对常用抗生素的耐药性情况。
5. 判断耐药基因：通过检测细菌的耐药基因，确定其是否携带了与甲氧西林耐药相关的基因。
需要注意的是，MRSA的判断需要进行细菌培养和特殊检测方法，不能只依靠临床症状诊断。
金黄色葡萄球菌检测方法1.纸片法目前广泛应用的一种方法，用纸片、膜、胶片等作为培养基载体，将特定的培养基和显色物质附着在上面，通过观察微生物在测试片上面的生长、显色来测定食品中微生物。
采用快速测试片检测具有显著的优点：可测定少量检品，不需要配制试剂，不需要大量的玻璃器皿，操作简便迅速；易于消毒保存，便于运输携带方便，价格低廉；除纸片外无其他任何废液废物，大大减少了工作量；可以在取样时同时接种，结果更能反映当时样本中真实细菌数，防止延长接种时间时细菌繁殖造成的污染。
技术优点：操作简单使用方便，避免了繁琐的操作。
技术缺点：用时间比较长，无法准确定性及计数。
此方法现在应用于快速检测领域，美国3M公司Petrifilm为载体的测试片应用最为广泛。
但其也存在一些问题：Petrifilm测试片上覆盖了一层薄膜，当样品粘液过多时会出现菌落的扩散和融合，影响计数；Petrifilm测试片面积较小，当菌量大于250cfu时，准确计数较困难；待测样品中含有的某些有机物可能使显色减缓。
使目视效果下降，导致计数偏低。
2.免疫学方法各种免疫学方法的基本原理都是抗原抗体反应。
抗原抗体反应是指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应。
金黄色葡萄球菌特异的抗原能激发机体产生相应的特异性抗体。
在免疫检测中，可利用单克隆抗体检测金黄色葡萄球菌的特异抗原，也可利用金黄色葡萄球菌抗原检测体内产生的特异抗体，两种方法均能判断机体的感染状况。
目前对于金黄色葡萄球菌的测定主要进行了肠毒素的测定，方法以酶联免疫吸附实验为主，有胶体金方法，也有用亲和素一生物素乳胶凝集实验和免疫荧光实验，但都有一定的局限性。
免疫学方法包括下面两个部分：（1）抗原抗体技术分析：抗原抗体技术是免疫技术中的核心部分，对于金黄色葡萄球菌检测全菌免疫筛选抗体是很困难的事情，现在目前市场有的大多都是对金黄色葡萄球菌毒素类进行免疫得到的抗体，金黄色葡萄球菌毒素有12种，军事医学科学院生产的金黄色葡萄球菌毒素A、B、C的抗体。
三种检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌方法的比较赵自云牟晓峰江秀爱(山东省青岛市中心医院，青岛266042)【摘要l目的比较苯唑西林纸片扩散法、微量琼脂稀释法(M I C)和聚合酶链反应(t K I R)法检测甲氧西林耐药金黄色葡萄球茵(M磁滤)的差异。
方法用上述3种方法同时检测86株临床分离的金黄色葡萄球茼。
结果3种方法同时辁测出53株M R SA和33株甲氧西林敏感金黄色葡萄球茵，一致性为100％。
结论三种方法都适于临床实验室准确检测M R SA，尤其是纸片扩散法和M I C法可作为不同级别临床常规实验室确证M R SA检测方法。
【关键词】金黄色葡萄球茵；甲氧西林；苯唑西林纸片扩散法；微量琼脂稀释法；聚合酶链反应C om par e t hr ee m e t hods t o de t ect l V l R SA Z b．a o zi yun，M u X m of ezl g，扭l ng xi t塘i(Q iD gc ho cen t r al h盎pi t al，Q m gdao，266042)【A b st m et】O bj ec啦ve T o co m p ar e t he di f fer ences of t he ox aci ll i n dis k dif fus ion m e t hod，m i cr o—agar di l ut i on(m c)and r m l ym er ase chai n r ea ct i on(P CR)t o det ect i on t he m ethi ei l li n—res i s t ant St aphyr l ococcm aul-el l8(M R SA)。
M e t hods t hr ee m e t h ods w eFe per f or m ed t o1y ze86c l i ni cal i sol a t es of St aphyl o coccus al al℃1．t S．Ih爆咄s53M R SAa nd33m et hi ci U i n—s ens i t i veSt aphyl ococcusaun吣w e陀det ect ed by t het hr ee m et hod s，s peci fi ci t y w a d00％，s em d t i v i t y w as l oo％。
C ondus i on T h esem ethods勰s ui tabl e f or c li nic al l abor ator ies t o a ee tt r at el y det ect M RSA．es peci al l y t he dis k dif f usi on m et hod a nd M I C coul d be us ed f or di ff e rent l eve ls0【f m u l i n e c l i ni cal l ab or at o r y con f i r m ed M1t SAdet ec t ion．【K ey words]St aphyl赫'ns aureus；M et hiei l li n；T he ox aci ll i n di sk dif fus ion4m et h od；M i er e—agar di l u t i on；P ol ym eras e chai n r eact ion金葡菌是临床最常见的病原菌之一，在临床分离菌中分离率位居前列，其中以m et hi ei l l i n—r esi st ant St a phyl ococc us aur eus(M R SA)临床意义尤为重要。
由于其多重耐药性和易造成医院感染的暴发流行，已成为临床抗感染治疗的一大难题Ll。
2J。
M R SA对抗生素的耐药性日趋严重且对多种抗生素耐药，因此M R SA引起的医院感染一旦发生，常难以控制。
为了解我院医院感染的M R SA耐药表型与基因型之间的关系，进一步加强对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的快速、及时检出，有效控制M R S A造成的感染，指导临床用药，限制其传播，本文对我院目前常用的检测方法进行了比较。
I材料与方法1．1菌株来源黄色葡萄球菌标准株(A TC C25923)、金黄色葡萄球菌A T C C43300、大肠埃希菌标准株(A T C C25922)为本室保存；m ecA基因阳性标准M R SA菌株(SA0129)由美国Pf i zer公司研究所提供。
临床标本由青岛大学医学院第二附属医院检验科提供，共86株，包括甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(M SSA)和株M R S A。
标本主要来源于创面分离物、引流液、痰、血、中段尿等送检标本。
1．2试剂和仪器基因组D N A提取试剂盒购自美国Pr om ega公司；PC R试剂(Taq D N A聚合酶、4X dN TPs、10×buff er等)购自加拿大M B I公司；D N A M ar ker购自大连T akar a公司；利用D N A S t ar软件设计的引物由上海生工公司合成。
苯唑西林为英国O xoi d公司产品。
4800型D N A扩增仪为美国PE R K IN公司产品；M i cr os can半自动细菌鉴定仪为美国D at e B蛐公司生产。
1．2实验方法1．2．1纸片扩散法1．2．1．1将待测细菌用0．45％N aC I溶液制成0．5麦氏单位(1．5×10C FU／m1)的菌悬液。
用接种环将茵悬液划种在和M ul l er—H i nt on平板，然后贴苯唑西林纸片，将种好的平板放入37℃培养箱孵育24小时。
金黄色葡萄球菌A TC C25923作为苯唑西林阴性质控菌株、金黄色葡萄球菌A TC C43300作为苯唑西林阳性质控菌株。
1．2．1．2结果判断标准：苯唑西林纸片扩散试验抑菌圈直径≤11m m为耐药；抑菌圈≥12r am为敏感。
1．2．2微量琼脂稀释法：用M i er os ea n细菌鉴定仪测定苯唑西林M I C，判断标准遵循临床实验室标准一化委员会(C Ls I)制定的法规：M I C>4u∥I nl为M R．SA。
1．2．3聚合酶链反应法检测m ec A基因：1．2．3．1引物的设计在G eneB ank中收集m eeA基因的序列，用P r i m er Pr i m i e z5．0软件设计m e cA、基因扩增引物。
耐甲氧西林葡萄球菌m ecA基因的引物如下P1：5—1A G-I-r C TA G T I G T C G G G T一3，P2：5一TA TC G G A C G Tr cA G TC A T一3，扩增产物为165bp片断；1．2．3．2细菌D N A的提取按美国P r om ega公司生产的基因组D N A提取试剂盒(W i za r d G enom i c D N A Pur i f i cat i on K i t)操作说明书操作。
1．2．3．3目的基因的PC R扩增，取上述提取的M SS A、M R SA及大肠埃希氏菌标准株(A TC C25922)对照菌株的D N A各1肛l作为扩增的模板，加入PC R反应体系，引物、M gC L2、dN T P终浓度分别为2弘M、250pt M、250nM，1×PCR buf f er，0．6u以L T aq酶，反应总体积25出。
PC R反应参数94c|C预变性6m i n，(94℃60s，500C30s，72℃45s)×35个循环，72℃延伸10rai n。
1．2．3．4扩增完毕后每管各取3／dPC R产物，D N A M ar ker2．5t d，经1．2％琼脂糖凝胶电泳后，在紫外灯下观察结果。
2结果2．1纸片扩散法法结果苯唑西林抑菌圈直径≥12m m的敏感菌33株，抑菌圈<1l m m的耐药菌株53株。
2．2微量琼脂稀释法法结果苯唑西林M I C≤4ug／m l的敏感菌33株，苯唑西林M I C>4ug／r nl的耐药菌53株。
2．3PC R法检测m ecA未出现165bpm e cA条带的敏感菌33株，出现165bpm ecA条带的耐药菌56株。
2．4三种检测方法结果比较3种方法检测金黄色葡萄球菌的结果敏感株333333耐药株535353三种方法经x!检验X2=0．P=1．检测结果差异无显著性。
以m ecA基因检测呈阳性为“金标准”，共检出53株M R SA，阳性率为61．6％。
苯唑西林纸片扩散法法敏感性100％，特异性100％；苯唑西林微量稀释法敏感性100％，特异性100％。
图1m ee A基因PE R扩增扩增产韧琼脂糖凝胶电泳结果l为黄色葡萄球菌标准株(A TC C25923)．2为大肠埃希菌标准株(A TC C25922)．3为·m ec A基因阳性标准M R SA菌株(S A0129)．4为标本M R S A．M为M ar ker3讨论耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(M R SA)是医院感染的重要病原菌之一，自1961年在英国首次被报道以来，其感染率不断上升，目前医院正面临着M I L SA 感染日益严重和多重耐药的挑战。
M R SA对包括甲氧西林在内的多种抗菌药物耐药，由它所致的感染易呈流行或暴发流行，治疗困难且病死率高，成为临床治疗的一大难题。
因此，快速、尤其是准确的的检测M R S A已成为各医院临床微生物室的重要任务。
M R S A检测方法常采用的有临床实验室标准化委员会(C L SI)推荐的苯唑西林纸片扩散法和头孢西丁纸片扩散法，还有应用自动细菌鉴定仪测定最低抑菌浓度(M IC)筛选方法，以及分子生物学方法检测m ecA基因等方法。
本文利用苯唑西林纸片扩散法，最低抑菌浓度(M I C)筛选方法，以及检测m ecA 基因三种方法同时进行检测，对各方法之间结果进行比较，以便不同医院根据自己的实际情况选择合适的方法进行M R SA的筛选。
m eeD N A是耐甲氧西林葡萄球菌特有的D N A序列，长约30．45kb，位于细菌染色体上，通常在pur—nov—hi s基因族附近，m ee基因由m ea A、m ec I、m ec m 及20—40kb的m ec相关D N A组成。
m ecA为结构基因，主要编码PB P2a蛋白，决定菌株是否对甲氧西林耐药。
现已经明确，由m eeA基因编码的PB P2a是葡萄球菌对甲氧西林耐药的主要原因，因此m ecA 基因被作为耐甲氧西林葡萄球菌(m et hi ei l l i n r es i s t an t s t aphyl ococci，M R s)的分子标志，(下转34页)胞之间的窦周间隙，胞浆内含有脂滴为其特征，可贮存，脂肪与维生素A，能产生多种胶原与非胶原基质成分，在肝纤维化过程中，贮脂细胞在多种因子作用下增生活化，并转化为肌纤维母细胞及合成纤维细胞，产生大量胶原及基质，对肝纤维化的发生具有重要作用E9]。
