第五章 第二、三节凝胶过滤与高效液相色谱

度)、4B(4％)和6B(6％)。Sepharose 6B的机械
强度大于2B，但是筛孔小于2B。
琼脂糖凝胶的机械强度和筛孔的稳定性都比葡聚
糖凝胶好，用琼脂糖凝胶进行柱层析时，流速可
以快些。
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（三）聚丙烯酰胺凝胶
商品名Bio-gel。是以甲撑双丙烯酰胺（双体） 作为交联剂，以过硫酸胺为催化剂， N,N,N’,N’-四甲基乙二胺（TEMED）为加速剂， 将丙烯酰胺（单体）聚合而成的。当改变单体浓 度时，就可得吸水率不同的产物，商品型号有 Bio-gel P-2到P-300。
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以床体积Vt（公式算）和测得值Vo来计算分配系 数的值为Kav（计算法）。 若以床体积Vt(等于Vo十Vi)和测得值Vo来计算分 配系数的值为Kd（测量法）。 同一层析条件下、对同一物质计算出的Kav和Kd 仅尽管有一定的差异性，但那是有效的。只因 Kav计算方便，所以目前使用Kav较多。分离物在 凝胶过滤层析时的行为，还可用Ve／Vo或Vo／ Ve(R值)表示。
离物分子量大，Kav值小，反之则大。
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因此，在同一凝胶过滤柱上分离分子量不同的
物质时，由于流动相的作用，这些分离物质将 发生排阻和扩散效应。若缓冲液连续的倾入柱 中，柱中物质的排阻和扩散效应也将连续的发 生，其级终结果是分子量大的物质先从柱中流 出，分子量小的物质则后从柱中流出，流出物 用部分收集器分管等量或等时的收集起来，检 测后分段合并相同组分的各管流出物，即等于 把分于量不同的物质相互筛分开了。
第二节
凝胶过滤层析
是本世纪60年代发展起来的一种分离纯化方法。
又叫分子筛层析，其原因是，凝胶具有网状结构， 小分子物质能进入其内部，而大分子物质却被排 阻在外部。当一混合溶液通过凝胶过滤层析柱时， 溶液中的物质就按不同分子量筛分开。
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凝 胶
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优点：设备简单、操作方便、重复性好和样品 回收率高等特点。
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Vo和Vi可通过实验测得：分子量不同的混合液在凝胶中 的内水体积和外水体积中的分布不同。溶液中的分子大 于凝胶孔径上限者，不能进入凝胶网孔内，而被排阻在 外水体积的溶液中。凝胶床的洗脱体积Ve刚好等于外水 体积。即Ve=Vo(Kav=0)。溶液中的分子小于凝胶孔径下 限者，能自由进入凝胶网孔内，凝胶床的洗脱体积Ve应 等于凝胶床总体积、即Ve=Vt=Vo十Vi(Kav=1)。而溶液 中的分子大小介于凝胶孔径上限和下限之间者，则有一 部分能进入凝胶网孔、故其洗脱体积Ve是在Vo和Vt之间 (Kav在0-1之间)。
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Sephacryl能用于分离蛋白质、核酸，多糖和蛋白聚
糖(Proteoglycans)。也可用硕大的病毒颗粒(直径
›300-400) 的分离。层析时，用细颗粒凝胶分辨率高。
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二、基本原理
凝胶过滤层析的基质是具有立体网状结构、筛 孔直径一致，且呈珠状颗粒的物质。这种物质 可以完全，或者部分排阻某些大分子化合物于 筛孔之外。而对某些小分子化合物则不能排阻。 但可让其在筛孔中自由地扩散、渗透。任何一 种被分离的化合物在凝胶层析柱被排阻的范围 均在0-100％之间。
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三、操 作
（一）凝胶的选择和处理 1．凝胶的选样 (1)型号 凝胶型号很多。型号不同，筛分范围也不同。 市售的Sephadex的分离范围，常用高聚糖或球蛋 白测定。Sephadex G型一般适宜于分离蛋白质。 如果用于分离核酸时、则限于其空间结构和所带 基团的影响，选用高于它们分子量范围的型号， 或者选用适当型号的生物胶和Sephacryl。
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2．稳定性 耐酸、耐碱、耐高温
葡聚糖凝胶在水溶液、盐溶液、碱溶液、弱酸溶液和 有机溶剂中稳定，不溶解，很少产生化学降解。 在中性条件下，葡聚糖凝胶悬浮液可置高温(120℃)
消毒30分钟，其性质并不改变。在0.1mol/L HCl溶液
中浸泡1-2小时，甚至在0.02mol/L HCl溶液中浸泡6 个月以上，对分离效果无明显的影响。
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在去除蛋白质溶液中的盐类时，可选用凝胶 Sephadex G-25。当溶液通过G-25柱时、蛋白质 被排阻在凝胶外面先流出来，而盐类扩散到凝 胶网孔里后流出来。这样蛋白质就得到纯化。 一般来说，在规定的筛分范围内，混合物之间 分子量差别越大，分离的效果越好。
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(2)粒度
凝胶的粒度有粗有细(与交联度无关)。细颗粒 凝胶之间空间小、装柱易均一，因此分离效果 好(与粗颗粒凝胶相比、但是由于细颗粒凝胶 流速慢，故宜用大直径的层析柱。这类凝胶用 于小型试验，能得到满意结果；而粗颗粒凝胶 流速快宜用小直径的层析柱，如操作得当可得 到较满意的结果。
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影响筛分效果的因素：
1）操作条件：如基质的颗粒大小、均匀度、筛 孔直径和床体积的大小、洗脱液的流速以及样 品的种类等； 2）Kav值的差异性。Kav值差异性大，分离效 果好；Kav值差异性小，乃至等于1或等于零(即 使样品个各组分的分子量相差很大)，则分离效 果相差，或根本不能分开。
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分配系数(Kav)既是判断分离效果的一个参数，
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2．凝胶用量的计算
根据层析柱的体积和干凝胶的膨胀度，公式可 计算出所需干凝胶的用量： 干凝胶用量（g）=∏r2 h / 膨涨度（床体积/克 干胶） 用此法计算出的干凝胶用量还需增加10%-20％， 因为凝胶在处理过程会有一部分损失。
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3．凝胶的处理
将所用的干凝胶缓慢的倾入5-10倍的蒸馏水中，根据凝 胶溶涨所需的时间进行充分浸泡，用倾斜法除去表面悬 浮的小颗粒，
剂能改变分离物质的结构时，则会影响分级效
果。葡聚糖凝胶的型号不同，其性质亦不同。
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1）以G型葡聚糖凝胶(经水溶液膨胀)作 为固定相，以水溶液作为流动相，对水 溶性物质进行分离的层析方法称为葡聚 糖凝胶过滤层析。 2）以LH型葡聚糖凝胶(经乙醇或二甲亚 砜甲酰胺或N,N-二甲基甲酰胺等有机溶 剂膨胀)作为固定相，以有机溶剂为流动 相，对脂溶性物质进行分离的层析方法 称为葡聚糖凝胶渗透层析。
聚的凝胶等。
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（一） 葡聚糖凝胶
商品名：Sephadex，它是由葡聚糖[右旋糖酐(G
型)；和3-氯-1,2-环氧丙烷（交联剂)以醚链相
互交联而成的。在交联葡聚糖G-25和G-50中分
别加入羟丙基基团反应，即可构成LH型烷基化
葡聚糖凝胶。
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1．理化性质
葡聚糖凝胶：白色珠状颗粒，在显微镜下可见 其表面的网状皱纹。它带有大量的羟基，亲水 性好，在水溶液或电解质溶液中极易膨胀。不 同型号的葡聚糖凝胶的交联度(交联剂在葡聚糖 凝胶中占的百分数)不同，使其在水中的膨胀度 (床体积)、吸水量(每克干凝胶在水中充分膨胀 时所需的水量。但不包括颗粒间所带的水量)、 筛孔的大小和分组范围有明显的差异。
凝胶床总体积时，须精确的分段测量，以防内
径不均匀造成误差，另外还须注意到，在层析
过程中，尤其是软胶操作压力要小，以防凝胶
床的高度降低。
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2）测量法：
由凝胶床的组成可知，床体积Vt等于外水体体 积Vo、内水体积Vi,与凝胶颗粒实际占有体积Vg 之和。 即 Vt=Vo+Vi+Vg
Hale Waihona Puke 因Vg与Vt相比是很小的。可忽略不计，故 Vt＝ Vo十Vi
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新葡聚糖凝胶对蛋白质往往有不可逆的吸附力
了。虽然吸附的数量较少，但是在制作测定蛋
白质分子量的标准曲线时，或者分离纯化极难
得到的物质时，需先用易得到的蛋白质进行预
层析，以便消除其影响。
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此外，葡聚糖凝胶对芳香族化合物或杂环化合 物以及某些凝集素具有较强的吸附作用，若采 用凝胶过滤层析分离它们时，往往利用的是吸 附原理，而不是排阻原理。
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但当暴露于强酸或氧化剂溶液时，易使糖苷键
水解断裂，要避免与其接触。葡聚糖凝胶欲在
室温下长期保存时，应加入适量的防腐剂如氯
仿、叠氮化钠等。否则，微生物将生长。
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3．吸附性
葡聚糖凝胶系弱酸性物质,由于其每克干胶中含 10-20微克当量的羧基基团所致。该基团能与分 离物中电荷基团(尤其是碱性蛋白质)发生吸附作 用。但这种吸附作用可用提高洗脱液的离子强度 解决。当离子强度大于0.05时，一般对弱碱性蛋 白质就无吸附力了。因此葡聚糖凝胶层析时,常 用含有NaCl的缓冲液作洗脱液。
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例如，Sephadex G-25比G-100交联度大。而
膨胀度、吸水量和筛孔直径前者小于后者。
另外，前者对球形蛋白质的分级范围较窄，
即在1000(下限)-5000(上限)之间，而后者的
分级范围较宽，即在4000-150000之间。
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本质：
葡聚糖凝胶置盐溶液或清洁剂中引起的膨胀程
度并不影响样品的分级效果。但盐溶液或清洁
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其被排阻的程度可以用分配系数Kav(分离化合 物在内水和外水体积中的比例关系)表示。Kav 值的大小依赖于凝胶床的总体积(Vt)、外水体
积(V。)以及分离物本身的洗脱体积(Ve)。 即 Kav=（Ve-Vo）/（Vt-Vo）
在限定的层析条件下，Vt和Vo都为恒定值，而
Ve则是随着分离物分子量的变化而变化的。分
再用0.5mol/L NaOH-0.5mol NaCl溶液在室温下浸泡半
个小时，以抽滤法除去碱液，用蒸馏水洗至中性，为了 除去凝胶颗粒中空隙中的气泡，可把处理过的凝胶浸泡 于蒸馏水和平衡液中用抽气方法实现。有时采用加热煮 沸方法，不仅能达到此目的，而且还能加快凝胶的溶胀
又是测定蛋白质分子量的一个依据。从公式
Kav=（Ve-Vo）/（Vt-Vo）看出，只要测出床
体积Vt和外水体积Vo以及洗脱体积Ve。即可计
算出Kav，而凝胶床总体积Vt可用二种方法得