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肿瘤NGS第一证丨燃石4基因突变联合检测试剂盒的产品说
明书！
2018年7月23日，CFDA批准了广州燃石医学检验所有限公司的高通量检测创新产品“人EGFR/ALK/BRAF/KRAS基因突变联合检测试剂盒（可逆末端终止测序法）”的三类医疗器械产品的注册。
此试剂盒是中国首个基于高通量测序技术（NGS）以及伴随诊断标准审批的多基因肿瘤突变联合检测试剂盒，将用于帮助非小细胞肺癌患者精准选择靶向药物治疗的方式。
在我国肿瘤NGS基因检测领域（体外诊断领域）具有里程碑式的意义。
此产品可检测突变类型如下表所示：
下面，我们一起来了解下中国首个肿瘤NGS检测试剂盒的产品说明书：
孩子，无论你做什么爸爸妈妈都爱你
我想学生物
找个好人家
一入生物深似海，从此奋斗到天明
基因Talks
微信ID：Precision_Medical。
Bradford蛋白质浓度定量试剂盒产品说明书（中文版）主要用途Bradford蛋白质浓度定量试剂是一种旨在使用考马斯亮蓝染色剂G－250与可溶性蛋白质特异性结合产生色彩差异变化，通过比色测定其最大吸收转换来定量蛋白质浓度的权威而经典的技术方法。
该技术由大师级科学家精心研制、成功实验证明的。
其适用于各种蛋白质（动物、人体、植物、微生物等）的含量检测。
产品即到即用，操作简捷，性能稳定，检测敏感，定量精确。
技术背景考马斯亮蓝染料G－250（Coomassie Brilliant Blue G－250）是一种与蛋白质结合的化学染料。
它的三苯甲烷（triphenylmethane）基团，主要与蛋白质的非极性结构结合。
而它的阴离子磺酸盐（anion sulfonate）基团与蛋白质分子的阳离子和芳香类氨基酸，尤其是精氨酸和赖氨酸侧链的结合。
在酸性环境下，其最大吸收波长从465nm转换为595nm。
Bradford提出的方法的最大优点在于不受样品中各种化学成分的干扰。
较之Lowry，Hartree-Lowry和 BCA技术，更为敏感。
产品内容反应液（Reagent A）毫升标准液（Reagent B）毫升补充液（Reagent C）毫升产品说明书1份保存方式保存标准液（Reagent B）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里，反应液（ReagentA），避免光照；有效保证6月用户自备48孔板：用于样品比色的容器比色杯：用于样品比色的容器分光光度仪或酶标仪：用于比色分析实验步骤一、48孔板微量测定A．建立标准样品曲线1．将－20℃冰箱里试剂盒中的标准液（Reagent B）置入冰槽里融化2．准备1个48孔板，做好相应的标记3．按下表配制标准样品反应液1）分别移取适量的标准液（Reagent B）到48孔板里指定序号的样品孔里2）分别移取适量的补充液（Reagent C）到48孔板里指定序号的样品孔里3）最后分别加入100微升反应液（Reagent A）序号标准液（Reagent B）补充液（Reagent C）反应液（Reagent A）标准样品蛋白质含量（微克）1 25微升 375微升 100微升252 12.5微升 387.5微升 100微升12.53 10微升 390微升 100微升104 5微升 395微升 100微升 55 2.5微升 397.5微升 100微升 2.56 1.25微升 398.75微升 100微升 1.257 0 400微升 100微升04．轻轻摇动48孔板，混匀反应物5．室温下暗室里孵育5分钟6．即刻放进分光光度酶标仪测定：波长为595nm7．绘制蛋白质浓度标准曲线：纵座标（Y）为吸光值OD595，横座标（X）为蛋白质含量（微克）B．样品测定1．将待测样品置入冰槽里融化2．分别移取100微升待测样品到48孔板里指定序号的样品孔里（注意：参见注意事项4）3．分别移取300微升补充液（Reagent C）到48孔板里指定序号的样品孔里4．最后分别加入100微升反应液（Reagent A）5．轻轻摇动48孔板，混匀反应物6．室温下暗室里孵育5分钟7．即刻放进分光光度酶标仪测定：波长为595nm8．根据上述标准曲线，测出待测样品的检测含量，再除以100微升（样品量），获得待测样品的实际浓度（微克/微升）（注意：参见注意事项5）二、比色杯标准测定A．建立标准样品曲线1．将－20℃冰箱里试剂盒中的标准液（Reagent B）置入冰槽里融化2．准备好1毫升比色杯3．按下表配制标准样品反应液1）分别移取适量的标准液（Reagent B）到1毫升比色杯2）分别加入适量的补充液（Reagent C）3）最后分别加入200微升GENMED反应液（Reagent A）序号标准液（Reagent B）补充液（Reagent C）反应液（Reagent A）标准样品蛋白质含量（微克）1 50微升 750微升 200微升502 25微升 775微升 200微升253 20微升 780微升 200微升204 10微升 790微升 200微升105 5微升 795微升 200微升 56 2.5微升 797.5微升 200微升 2.57 0 800微升 200微升04．轻轻上下倾倒比色杯，混匀反应物5．室温下暗室里孵育5分钟6．即刻放进分光光度酶标仪测定：波长为595nm7．绘制蛋白质浓度标准曲线：纵座标（Y）为吸光值OD595，横座标（X）为蛋白质含量（微克）B．样品测定1．将待测样品置入冰槽里融化2．移取200微升待测样品到1毫升比色杯里（注意：参见注意事项4）3．加入600微升补充液（Reagent C）4．加入200微升反应液（Reagent A）5．轻轻上下倾倒比色杯，混匀反应物6．室温下暗室里孵育5分钟7．即刻放进分光光度酶标仪测定：波长为595nm8．根据上述标准曲线，测出待测样品的检测含量，再除以200微升（样品量），获得待测样品的实际浓度（微克/微升）（注意：参见注意事项5）三、玻璃管大量测定（注意：参见注意事项2）A．建立标准样品曲线1．将－20℃冰箱里试剂盒中的标准液（Reagent B）置入冰槽里融化2．准备好5毫升玻璃管3．按下表配制标准样品反应液1）分别移取适量的标准液（Reagent B）到5毫升玻璃管2）分别加入适量的补充液（Reagent C）3）最后分别加入1毫升反应液（Reagent A）序号标准液（Reagent B）补充液（Reagent C）反应液（Reagent A）标准样品蛋白质含量（毫克）1 4毫升0 1毫升 42 2.5毫升 1.5毫升1毫升 2.53 2毫升2毫升1毫升 24 1毫升3毫升1毫升 15 0.5毫升 3.5毫升1毫升0.56 0.25毫升 3.75毫升1毫升0.257 0 4毫升1毫升0 4．涡旋震荡，混匀反应物5．室温下暗室里孵育30分钟6．即刻放进分光光度酶标仪测定：波长为595nm7．绘制蛋白质浓度标准曲线：纵座标（Y）为吸光值OD595，横座标（X）为蛋白质浓度（毫克）B．样品测定1．将待测样品置入冰槽里融化2．移取250微升待测样品到5毫升玻璃管里30030.23．加入3.75毫升补充液（Reagent C ） 4．加入1毫升反应液（Reagent A ）5．涡旋震荡，混匀反应物 6．室温下暗室里孵育30分钟7．即刻放进分光光度酶标仪测定：波长为595nm8．根据上述标准曲线，测出待测样品的检测含量，再除以0.25毫升（样品量），获得待测样品的实际浓度（毫克/毫升）注意事项1． 本产品为200次（96孔板测定），100次操作（48孔板测定），50次操作（比色杯测定）包括标准曲线 2． 玻璃管大量测定须另购 Bradford 大量蛋白质浓度定量试剂盒（）3． 操作时，须戴手套4． 建议用户使用48孔板微量测定时样品和试剂的用量，以及在最后浓度计算时的除数 序号待测样品补充液（Reagent C ）反应液（Reagent A ）蛋白浓度计算的除数 1 5微升 395微升 100微升 5 2 50微升 350微升 100微升 50 3 100微升 300微升 100微升 100 4250微升 150微升 100微升250如果是96孔板测定：待测样品、补充液（Reagent C ）和反应液（Reagent A ）的用量是48孔板测定的二分之一如果是比色杯测定：待测样品、补充液（Reagent C ）和反应液（Reagent A ）的用量是48孔板测定的2倍 5． 样品浓度计算公式：标准曲线求得蛋白含量（微克）÷样品量（微升）＝微克/微升6． 加样后即刻比色测定7． 比色测定后，比色杯须清洗彻底 8． 强碱性样品将会干扰比色检测9． 下列化学成分和浓度范围不会干扰比色检测：Acetate0.6 M KCI1.0 M AcetoneMalic acid0.2 MAdenosine 1 mM MgCl 2 1.0 M Amino Acids Mercaptoethanol 1.0 M Ammonium sulfate 1.0 M MES 0.7 M Ampholytes Methanol 0.5％ AcidMOPS 0.2 M ATP 1 mM NaCl 5 M Barbital NAD 1 mM BES2.5 M NaSCN3 MBoric acidPeptonesCacodylate-Tris 0.1 M Phenol 5% CDTA 0.05 M Phosphate 1.0 MCitrate 0.05MM PIPES 0.5acid 1mM Deoxycholate 0.1% Polyadenylic（MW<3000）PolypeptidesMDithiothreitol 1M0.2mg/ml PyrophosphateDNA 1mg/ml EDTA 0.1M rRNA 0.25mg/mlM tRNA 0.4 EGTA, 0.05mg/ml0.30RNAEthanol totalEagle’s MEM SDS 0.1%phosphatesolution SodiumsaltEarle’s20%sulfateacid 1.0M StreptomycinFormicX-100 0.1% FructoseTritonGlucose TricinemM Glutathione Tyrosine 1mMThymidine 1 Glycerol99%Glycine 0.1 M Tris 2.0 MGuanidine-HCI Urea 6 Msaltsolution VitaminsHank'sHEPES buffer 0.1 M10．建立微量测定的标准曲线，建议使用的蛋白质浓度范围为0至50微克11．本公司提供系列蛋白定量检测产品质量标准1．本产品经鉴定性能稳定2．本产品经鉴定检测敏感。
B-raf基因突变检测试剂盒(荧光PCR-毛细管电泳法)标准化操作流程1、预期用途该产品用于定性检测确诊的结直肠癌患者石蜡包埋病理组织切片DNA的B-rafV600E 基因突变。
B-raf 基因是一种癌基因，编码一种丝/ 苏氨酸特异性激酶，是RAS/RAF/MEK/ERK/MAPK 通路重要的转导因子，参与调控细胞内多种生物学事件，如细胞生长、分化和凋亡等。
B-raf 基因位于7p34，长约190kb，转录mRNA 长2.5kb，编码783 氨基酸的蛋白，相对分子质量为94000-95000 Da。
研究表明，在多种人类恶性肿瘤中，如恶性黑色素瘤、结直肠癌、肺癌、甲状腺癌、肝癌及胰腺癌等均存在不同比例的B-raf 突变，B-raf 突变主要发生在Exon15 上的激活区的第1799 氨基酸上(T 突变为A)，导致编码的氨基酸由谷氨酸变成缬氨酸(V600E)，该突变能使B-raf 激酶活性提高，V600E 突变能模拟T598 和S601 两个位点磷酸化作用，使BRAF 蛋白激活。
近来研究表明，对于野生型Kras、但存在B-raf 基因V600E 突变患者，抗EGFR 单抗治疗无效。
2010 年版《NCCN 结直肠癌临床实践指南》中已明确指出“如K-ras 基因无突变时，需检测B-raf 基因突变，如果后者存在V600E突变，则不应该给予抗EGFR 单抗治疗。
”2、仪器配置要求移液器，振荡器，微型离心机，生物安全柜，高速冷冻离心机，定性PCR仪，荧光定量PCR仪（ABI7500，LightCycler® 480，MX3000P，CFX-96等），微量紫外分光光度计，基因分析仪（ABI3130，ABI3500DX）。
3、耗材要求无菌带滤芯吸头、吸水纸，离心管（1.5ml，0.5ml，0.2ml）、PCR反应管（配套荧光定量PCR仪型号）及无粉一次性乳胶手套，基因分析板。
4、责任人基因扩增实验室室长负责技术指导和质量监督。
B-raf基因突变检测试剂盒(荧光PCR-毛细管电泳法)标准化操作流程1、预期用途该产品用于定性检测确诊的结直肠癌患者石蜡包埋病理组织切片DNA的B-rafV600E 基因突变。
B-raf 基因是一种癌基因，编码一种丝/ 苏氨酸特异性激酶，是RAS/RAF/MEK/ERK/MAPK 通路重要的转导因子，参与调控细胞内多种生物学事件，如细胞生长、分化和凋亡等。
B-raf 基因位于7p34，长约190kb，转录mRNA 长2.5kb，编码783 氨基酸的蛋白，相对分子质量为94000-95000 Da。
研究表明，在多种人类恶性肿瘤中，如恶性黑色素瘤、结直肠癌、肺癌、甲状腺癌、肝癌及胰腺癌等均存在不同比例的B-raf 突变，B-raf 突变主要发生在Exon15 上的激活区的第1799 氨基酸上(T 突变为A)，导致编码的氨基酸由谷氨酸变成缬氨酸(V600E)，该突变能使B-raf 激酶活性提高，V600E 突变能模拟T598 和S601 两个位点磷酸化作用，使BRAF 蛋白激活。
近来研究表明，对于野生型Kras、但存在B-raf 基因V600E 突变患者，抗EGFR 单抗治疗无效。
2010 年版《NCCN 结直肠癌临床实践指南》中已明确指出“如K-ras 基因无突变时，需检测B-raf 基因突变，如果后者存在V600E突变，则不应该给予抗EGFR 单抗治疗。
”2、仪器配置要求移液器，振荡器，微型离心机，生物安全柜，高速冷冻离心机，定性PCR仪，荧光定量PCR仪（ABI7500，LightCycler® 480，MX3000P，CFX-96等），微量紫外分光光度计，基因分析仪（ABI3130，ABI3500DX）。
3、耗材要求无菌带滤芯吸头、吸水纸，离心管（1.5ml，0.5ml，0.2ml）、PCR反应管（配套荧光定量PCR仪型号）及无粉一次性乳胶手套，基因分析板。
4、责任人基因扩增实验室室长负责技术指导和质量监督。
β-地中海贫血基因检测试剂盒（荧光PCR法）说明书【产品名称】通用名称:β-地中海贫血基因检测试剂盒（荧光PCR法）【包装规格】24人份/盒【预期用途】本试剂盒用于定性检测β-地中海贫血基因突变情况，以EDTA抗凝全血为检测样本，适用于临床β-地中海贫血基因突变的诊断。
β-地中海贫血是一组遗传性疾病，其临床表现多样，由轻到重，甚至危及生命，导致患者在未成年即夭折甚至胎死腹中，给家庭和社会带来巨大的负担。
且目前尚无根治手段，国内外都没有疗效标准。
因此控制和降低β-地中海贫血患儿的出生率才能有效地监控该病的发生，通过人群筛查和遗传咨询，对有携带β地贫基因的孕龄夫妇所孕胎儿实施产前诊断，是目前最有效的控制重症β-地中海贫血患儿出生的方法。
【检验原理】本试剂盒能够检测24种β-地中海贫血基因类型（具体信息见附表1），采用八联PCR管进行检测，12管一人份，共12支扩增液（扩增液检测突变类型及对应的荧光通道信息详见附表2），每个反应管检测两种突变型和两种野生型，分别通过四个不同的荧光通道读取信息。
根据文献，我们参照人类β-地中海贫血基因情况以包括突变情况的一段基因序列作为靶序列，设计特异性突变检测引物探针、特异性野生型检测引物探针，采用基因扩增技术对核酸特异性基因进行检测。
突变型情况由FAM、HEX指示，野生型情况由ROX、CY5指示，对β-地中海贫血基因进行特异性检测，为临床检验提供实验室辅助诊断的依据。
本试剂盒使用核酸提取试剂提取基因组DNA。
试剂盒添加了防污染成分UNG酶，UNG酶可将反应体系中已有的U-DNA污染物中的尿嘧啶碱基降解，并在随后变性这步的条件下DNA链断裂,消除由于污染DNA产生的扩增，保证扩增结果的特异性，准确性。
【主要组成成分】试剂盒1：编号扩增液类型规格数量引物探针类型1 β地贫1 扩增液24人份/支1支41-42M引物探针，IVS-Ⅱ-5M引物探针2 β地贫2扩增液24人份/支1支654M引物探针，43M引物探针3 β地贫3扩增液24人份/支1支26M引物探针，30M引物探针4 β地贫4扩增液24人份/支1支27-28M引物探针，IVS-1-1M(T)引物探针5 β地贫5扩增液24人份/支1支31M引物探针，-28M引物探针6 β地贫6扩增液24人份/支1支17M引物探针，-29M引物探针7 β地贫7扩增液24人份/支1支IVS-1-1M(A)引物探针，71-72M（A）引物探针8 β地贫8扩增液24人份/支1支14-15M引物探针，41M引物探针9 β地贫9扩增液24人份/支1支IVS-1-5M引物探针，71-72M（T）引物探针10 β地贫10扩增液24人份/支1支-31M引物探针，CAP40-43M引物探针11 β地贫11扩增液24人份/支1支IntM引物探针，-32M引物探针12 β地贫12扩增液24人份/支1支CAP-1M引物探针，-30M引物探针组成成分生化组成规格数量H-2应缓冲液4-羟乙基哌嗪乙磺酸、氯化钾、氯化镁、硫酸铵、甲酰胺、脱氧核糖核苷三磷酸1.5mL/支4支A酶混合液Taq DNA聚合酶、尿嘧啶糖基化酶、酶储存液A 50μL /支3支稀释缓冲液三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、三羟甲基氨基甲烷 1.5mL/支6支TE缓冲液三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸二钠盐1.5mL/支2支石蜡油 1.5mL/支5支试剂盒2：组成成分生化组成规格数量β地贫阴性对照生理盐水500μL/支1支β地贫阳性对照质粒500μL/支1支注：本试剂盒由试剂盒1和试剂盒2组成。
艾德⼈类10基因突变联合检测试剂盒（可逆末端终⽌测序法）受理号：CSZ1700127体外诊断试剂产品注册技术审评报告产品中⽂名称：⼈类10基因突变联合检测试剂盒（可逆末端终⽌测序法）产品管理类别：三类6840申请⼈名称：厦门艾德⽣物医药科技股份有限公司国家⾷品药品监督管理总局医疗器械技术审评中⼼⽬录基本信息 (3)⼀、申请⼈名称 (3)⼆、申请⼈住所 (3)三、⽣产地址 (3)产品审评摘要 (4)⼀、产品概述 (4)⼆、临床前研究摘要 (7)三、临床评价摘要 (15)四、收益-风险评估 (24)综合评价意见 (28)基本信息⼀、申请⼈名称厦门艾德⽣物医药科技股份有限公司⼆、申请⼈住所厦门市海沧区⿍⼭路39号三、⽣产地址厦门市海沧区⿍⼭路39号产品审评摘要⼀、产品概述（⼀）产品主要组成成分表1 试剂盒主要组成成分试剂盒具体组成成分、配套试剂及软件见说明书。
（⼆）产品预期⽤途本试剂盒⽤于定性检测⾮⼩细胞肺癌（NSCLC）、结直肠癌（CRC）患者经中性福尔马林固定的⽯蜡包埋（FFPE）的组织样本中EGFR/ALK/ROS1/RET/KRAS/NRAS/PIK3CA/BRAF/HE R2/MET基因变异。
其中，针对NSCLC，EGFR基因中：19号外显⼦缺失（19del）、L858R点突变⽤于吉⾮替尼⽚的伴随诊断检测，T790M点突变⽤于甲磺酸奥希替尼⽚的伴随诊断检测；AL K基因重排（融合）和ROS1基因重排（融合）⽤于克唑替尼胶囊的伴随诊断检测；针对CRC，KRAS基因野⽣型⽤于西妥昔单抗注射液的伴随诊断检测；如表2所⽰。
表2 伴随诊断⽤途的基因变异类型及相应的靶向药物表3中为本试剂盒可以检出，但未经伴随诊断验证的基因变异类型。
表3 未经伴随诊断⽤途验证的基因变异类型其检测结果仅供临床参考，不应作为患者个体化治疗的唯⼀依据。
临床医⽣应结合患者病情及其他实验室检测指标等因素对检测结果进⾏综合判断。
（三）产品包装规格24测试/盒（四）产品检验原理本试剂盒通过构建样本DNA测序⽂库，并使⽤特异探针对⽂库进⾏⽬标区域捕获富集，捕获后的⽂库通过⾼通量测序，可实现多个基因多个突变的⼀次性检测。
人类基因有效DNA 浓度检测操作流程1.目的介绍使用实时PCR 技术对基因有效DNA 浓度进行定量、质控。
辅助EGFR/KRAS/BRAF 基因突变检测试剂盒的使用。
2.实验材料试剂供应商人类基因有效DNA 浓度定量检测试剂盒(荧光PCR 法)厦门艾德生物医药科技有限公司实时荧光PCR 仪–PCR96孔板或八联PCR 反应管–3.方法注意：每次实验均使用新鲜配制的基因组DNA 标准品。
3.1制备2.5ng/μL 标准DNA ：吸取2μL 基因组DNA （40ng/μL ）至30μL 超纯水中，振荡混匀。
3.2用20μL 标准DNA 和20μL 超纯水中制备2倍梯度稀释的标准品，每次加样后都应混匀。
浓度（ng/µL ）每反应加入总DNA 量（ng ）2.512.51.25 6.250.6253.1250.3121.56253.3按照表1制备预混液。
所有样品(DNA 样品、标准品、阴性对照)应当做两复孔或三复孔以提高标准曲线和定量结果的准确性。
3.4分装45µL 预混液至八联PCR 反应管中。
3.5加入5µLDNA 样品、标准品、水(NTC ，/阴性对照)至八联PCR 反应管内。
表1预混液配制各组份名称体积/反应(µL)反应混合液45Taq 酶0.25DNA53.6上qPCR 仪(MX3000P/MX3005P 或其它品牌)打开MXPro 软件，选择Quantitative PCR(Multiple Standards)输入样品编号4.数据分析4.1在Setup界面将标准品设置成“Standard”。
4.2输入相应的浓度值。
如下图：4.3选择“Analysis ”，“Standard Curve ”。
标准曲线的相关系数R 2应大于0.95。
4.4选择“Text report ”。
4.4导出定量结果。
4.5阴性对照收集到荧光信号，说明实验中发生了交叉污染，数据无效，需重复实验。
人类B-raf基因V600E突变检测试剂盒（荧光PCR法）说明书【产品名称】通用名：人类B-raf基因V600E突变检测试剂盒（荧光PCR法）英文名：Diagnostic kit for V600E Mutation of Human B-raf Gene(Fluorescence PCR Analysis)【包装规格】20测试/盒【预期用途】B-raf基因位于7号染色体长臂上，是一种癌基因，属RAF基因家族，有18个外显子，编码一种含783个氨基酸的B-raf蛋白，是EGFR通路RAS/RAF/MEK/MRK/MAPK中重要的转导因子，参与调控细胞生长、分化和凋亡等多种生理过程。
针对EGFR的肿瘤靶向药物通过抑制该途径发生药理作用。
研究表明在非小细胞肺癌、结直肠癌等多种恶性肿瘤中存在B-raf基因突变，其中第15外显子上V600E点突变最常见，约占所有突变的90%以上，该突变导致B-raf蛋白被异常激活，从而使患者接受EGFR-TKI药物和EGFR单抗类药物治疗失效。
据中国2010版《肿瘤学临床实践指南》建议，对K-raf基因检测正常的非小细胞肺癌和结直肠癌患者，应进一步检查B-raf基因的突变状态，以指导靶向药物治疗方案。
本试剂盒以人非小细胞肺癌、结直肠癌肿瘤组织切片提取的基因组DNA为检测样本，用于肿瘤组织B-raf 基因V600E点突变的定性检测，为临床肿瘤靶向药物的个体化用药提供依据。
本公司尚无临床实例证实B-raf 基因突变与靶向药物的相关性，其相关性主要来自文献报道，因此本试剂盒检测结果仅用于辅助临床医生对肿瘤患者制定用药方案。
【检验原理】本试剂盒基于实时荧光PCR平台，结合等位基因特异性扩增（ARMS）技术、野生型基因扩增抑制技术和多重PCR技术检测B-raf基因V600E突变。
ARMS技术是指PCR引物的3’端末位碱基必须与其模板DNA互补才能有效扩增，通过设计特异性ARMS引物，对存在V600E突变的B-raf基因靶序列进行PCR扩增放大，并利用FAM基团标记的Taqman 探针对扩增产物进行检测。
因为采用了野生型基因扩增抑制剂，使ARMS体系能够耐受更高浓度的背景野生型B-raf基因，降低了试剂盒对基因组样本的DNA浓度要求，提高了检测灵敏度。
为质控扩增体系的有效性，试剂盒设置了内质控和外质控，内质控基因是人类基因组的一个保守片段，长度与B-raf目标片段相似，均为100bp左右，内控探针采用标记ROX基团的Taqman 探针对内控基因扩增产物进行检测。
内控引物、探针及内控基因对ARMS体系的扩增效率无影响。
阳性对照品是B-raf基因V600E突变质粒与野生型人类基因组DNA的混合物，用于PCR扩增的外质控。
【主要组成成份】（20次检测）本试剂盒包含PCR反应液I、PCR反应液Ⅱ和阳性对照品等3管试剂。
PCR反应液I体积350μl，包含相应的B-raf基因突变和内控检测引物和探针，V600E突变探针由FAM荧光指示，内控探针由ROX荧光指示。
PCR反应液I包含一对B-raf基因V600E突变检测引物和一对内控引物、标记FAM基团的用于检测突变B-raf基因的Taqman探针和标记ROX基团的用于检测内控基因的Taqman探针，各引物和探针浓度均为20-100pM；野生型基因扩增抑制物，浓度为1200pM；PCR反应液Ⅱ体积100μl，包含0.1U/μl Taq酶和50nM dNTP、750nM Mg2+ 等；阳性对照品体积20μl，包含300copies/μl的B-raf基因V600E突变质粒和10ng/μl的野生型人类基因组（3000copies/μl）检测必须但试剂盒中不包含的组分：1.5ml 离心管（用于配制PCR反应液和DNA提取）；0.2ml PCR管或8联PCR管或96孔PCR板；带滤塞的吸头（1ml、200μl和10μl）；DNA提取试剂盒ReliaPrep™ FFPE gDNA Miniprep System（货号：A2352）【贮存条件及有效期】置于-20℃条件下储存，有效期6个月。
4-10℃避光条件下储存或运输不得超过7天。
【适用仪器】适用于ABI7500、Linegene FQD-96型号的Real-time PCR扩增仪。
【样本要求】1.适用样本为非小细胞肺癌、结直肠癌石蜡包埋病理组织切片，切片厚度10μm，数量1片，所用切片样品保存不超过3年。
2.由于肿瘤的复杂性，所采集的临床样品往往会混有正常组织细胞，石蜡包埋病理切片样品肿瘤病变细胞应不低于10 %，所取部分应尽量在蜡块中部；3.使用商业化的试剂盒来提取人类基因组DNA，推荐使用Promega公司的ReliaPrep™ FFPE gDNAMiniprep System（A2352）提取石蜡包埋组织切片样品，所提DNA需用紫外分光光度计测定浓度和纯度，其DNA OD260/OD280的值应在1.8~2.0，浓度应在3~300ng/μl之间，样本DNA质量不合格者不得用于检测，建议重新取切片进行核酸提取，提取完的DNA建议立即进行检测，否则请于-20℃以下保存，保存时间不要超过6个月。
【检验方法】一、核酸提取（样本处理室）使用ReliaPrep™ FFPE gDNA Miniprep System进行核酸提取，提取步骤如下。
1.用矿物油去除石蜡加矿物油500µl到装有组织切片样本的1.5ml离心管内，80℃孵育1min，振荡混匀；2.组织样本裂解，消化组织蛋白质1)离心管内加入200µl裂解液，室温10,000g离心15s,形成水油两相溶液，下层为水相，上层为油相；2)向离心管水相加入20µl蛋白酶K, 用移液枪吸打混匀；3)56℃孵育1h；4)80℃孵育1h；5)冷却到室温，离心15s；3.去除RNA向离心管水相加入10µl RNase A，吸打混匀。
室温（20-25℃）孵育5min；4.用核酸提取柱提取基因组DNA1)加入220µl BL Buffer到含裂解样品的离心管中，再加入240µl乙醇（95-100%），震荡混匀，室温10,000g离心15s，形成水油两相溶液，下层为水相，上层为油相；2)将结合柱置于收集管内，小心吸取离心管下层水相（包括可能形成的沉淀）转移到结合柱内，盖上管盖，将离心管丢弃。
3)收集管室温10,000g离心30s，弃去管中的滤出液。
4)把柱子重新装入收集管中，加入500μl 1 洗涤液至柱内，室温10,000g离心30 s，弃去滤出的洗涤液。
5)重复步骤4）再洗涤一次；6)打开结合柱盖子，室温条件下16,000g离心3 min以甩干柱内残余的液体；7)把柱子转移至一个干净的自备1.5ml离心管中，向柱内加入50μl Elution Buffer，室温16,000 g 离心1 min洗脱基因组DNA，丢弃提取柱。
注意事项：1.操作提取柱和收集管时应戴好一次性手套；2.收集基因组DNA前的16,000g离心3 min操作必须开盖，以除净乙醇，乙醇残留过量将严重影响基因组的收集质量。
二、试剂准备（试剂准备室）将试剂从冰箱取出，室温融化，混匀，1000rpm快速离心20秒，备用；三、反应体系配制（试剂准备室）1.根据检测样本数计算所需反应数，如样本数为n，则需做n+2个反应（包含一个阳性对照反应和一个无模板对照反应）；2.根据表3计算所需各反应液的体积，并配制反应体系，反应体系混匀后3000rpm快速离心30秒，分装至PCR管中，每管18μl；表3 加样表四、加样（样本处理室）取2μl提取的样品DNA加入PCR反应管，盖上管盖，1000rpm离心或轻甩，排除管底气泡；阳性对照反应所用模板为试剂盒中对照品，空白对照反应所用模板为超纯水（自备）。
五、上机检测（扩增室）1.将PCR管按顺序放入PCR仪，按表4设置反应程序；表4 反应程序注：在循环段2的56℃时检测FAM、ROX两个通道的荧光。
2.运行PCR反应程序，保存文件。
六、结果获取荧光定量PCR仪运行结束后，使用配套软件对本次试验的结果进行分析。
【参考临界值】以扩增过程前3-15循环的荧光值的10倍标准差为阈值，以荧光值超过阈值的循环数为阈值循环数（Ct值）。
【检验结果的解释】1.空白对照应在FAM和ROX通道均无Ct值或无典型的S型扩增曲线升起；若空白对照管在至少一个通道有典型的S型扩增曲线升起，可能为试剂受到污染或操作过程中的污染，请排除污染源后重新检测；2.阳性对照应在FAM和ROX通道均有典型的S型扩增曲线升起，且Ct值在12～25间；若对照品有至少一个通道无典型的S型扩增曲线升起或Ct值≤12或Ct值≥25，该批次样本需重新检测，请确认所使用的试剂是否仍在有效期内，确定操作是否严格按照说明书进行；3.若满足1和2要求，表明此次实验成功，对样品管进行分析：（1）内控（ROX通道）应有典型的S型扩增曲线升起，且Ct值10~22之间，表明所加样本DNA 质量正常，若Ct值≤10，表明所加样本过量，请将样本稀释后再次检测；若Ct≥22或无扩增（无Ct），表明所加样本DNA含有PCR抑制剂或DNA量不够，可能影响低突变率样本的检测结果，请重新提取DNA后检测；（2）样本突变信号（FAM通道）有典型的S型扩增曲线升起，且Ct值≤32，则判定该样本B-raf 基因V600E突变阳性；（3）样本突变信号（FAM通道）无典型的S型扩增曲线升起，或Ct值大于32，则判定该样本B-raf 基因V600E突变阴性。
【检验方法的局限性】本试剂盒仅适用于规定的仪器和检测系统，检测结果仅供临床参考，不得作为临床诊治的唯一依据。
【产品性能指标】1.经1050例非小细胞肺癌和结直肠癌肿瘤组织样本临床试验，本品与测序法作对照，阳性符合率为97.9%，阴性符合率为96.8%，总符合率为97.1%。
2.试剂盒应外观清洁、无泄漏、无破损，标志、标签字迹清楚；各组分融化后应澄清透明，无色，无沉淀。
3.检测10份阳性参考品，阳性参考品符合率应为100%。
4.检测10份阴性参考品，阴性参考品符合率应为100%。
5.可以检出10ng野生型基因组DNA背景下，含量低至1%的B-raf基因V600E突变。
6.用2份企业内部精密性参考品分别作10次平行检测，结果均为阳性且Ct值变异系数CV≤5%。
【注意事项】1.本试剂盒仅用于体外研究。
实验前请仔细阅读说明书。
2.PCR检测应在有资质的临床PCR实验室进行，实验室应严格按照卫生部《医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法》卫办医政发〔2010〕194号文件规定进行资质认定和管理。
3.实验过程中必须使用专用的移液枪和一次性带滤塞的加样吸头。
