人类Kras基因突变检测试剂盒说明书

肿瘤NGS第一证丨燃石4基因突变联合检测试剂盒的产品说
明书！
2018年7月23日，CFDA批准了广州燃石医学检验所有限公司的高通量检测创新产品“人EGFR/ALK/BRAF/KRAS基因突变联合检测试剂盒（可逆末端终止测序法）”的三类医疗器械产品的注册。

此试剂盒是中国首个基于高通量测序技术（NGS）以及伴随诊断标准审批的多基因肿瘤突变联合检测试剂盒，将用于帮助非小细胞肺癌患者精准选择靶向药物治疗的方式。

在我国肿瘤NGS基因检测领域（体外诊断领域）具有里程碑式的意义。

此产品可检测突变类型如下表所示：
下面，我们一起来了解下中国首个肿瘤NGS检测试剂盒的产品说明书：
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人类K-ras基因突变检测试剂盒（PCR-熔解曲线法）说明书【产品名称】通用名：人类K-ras基因突变检测试剂盒（PCR-熔解曲线法）英文名：Diagnostic kit for Mutations of Human K-ras Gene(PCR-Melting Curve Analysis)【包装规格】20测试/盒【预期用途】K-ras基因位于12号染色体短臂上，是重要的癌基因之一，编码一种21kD 的kras蛋白，参与细胞内的信号传递，主要包括PI3K/PTEN/AKT 和RAF/MEK/ERK信号转导途径，这些转导途径是当前肿瘤靶向药物研究的热点，靶向药物通过抑制这些途径发生药理作用。

K-ras基因第12和13密码子发生突变，将导致kras蛋白变异并处于持续激活状态，使药物失效。

据中国2010版《肿瘤学临床实践指南》，在一项包含101例肺腺癌亚型细支气管肺泡癌患者的回顾性研究中，所有患者均接受厄洛替尼单药一线治疗。

K-ras突变者无一例缓解（0/18），而无K-ras突变者则有20例缓解（20/62，32%），差别有统计学意义（P <0.01）。

因此，指南建议，非小细胞肺癌和结直肠癌患者使用靶向药物前应进行K-ras基因突变状态的检测。

本试剂盒以人非小细胞肺癌、结直肠癌肿瘤组织切片提取的基因组DNA为检测样本，用于检测肿瘤组织K-ras基因第12，13密码子的12种体细胞突变（表1），提供突变状态的定性结果。

为临床肿瘤靶向药物的个体化用药提供辅助诊断依据，本品适用于进入个体化靶向治疗疗程前的患者使用。

表1 本品可检测的K-ras基因突变K-ras基因12密码子突变K-ras基因13密码子突变Gly12Ser GGT > AGT Gly13Ser GGC > AGCGly12Arg GGT > CGT Gly13Arg GGC > CGCGly12Cys GGT > TGT Gly13Cys GGC > TGCGly12Asp GGT > GAT Gly13Asp GGC > GACGly12Ala GGT > GCT Gly13Ala GGC > GCCGly12Val GGT > GTT Gly13Val GGC > GTC【检验原理】本试剂盒基于实时PCR平台，结合了特异引物、荧光探针和熔解曲线技术，定性检测DNA样品中K-ras 基因12，13密码子是否存在突变。

人类K-ras基因突变检测试剂盒（PCR-熔解曲线法）说明书【产品名称】通用名：人类K-ras基因突变检测试剂盒（PCR-熔解曲线法）英文名：Diagnostic kit for Mutations of Human K-ras Gene(PCR-Melting Curve Analysis)【包装规格】20测试/盒【预期用途】K-ras基因位于12号染色体短臂上，是重要的癌基因之一，编码一种21kD 的kras蛋白，参与细胞内的信号传递，主要包括PI3K/PTEN/AKT 和RAF/MEK/ERK信号转导途径，这些转导途径是当前肿瘤靶向药物研究的热点，靶向药物通过抑制这些途径发生药理作用。

K-ras基因第12和13密码子发生突变，将导致kras蛋白变异并处于持续激活状态，使药物失效。

据中国2010版《肿瘤学临床实践指南》，在一项包含101例肺腺癌亚型细支气管肺泡癌患者的回顾性研究中，所有患者均接受厄洛替尼单药一线治疗。

K-ras突变者无一例缓解（0/18），而无K-ras突变者则有20例缓解（20/62，32%），差别有统计学意义（P <0.01）。

因此，指南建议，非小细胞肺癌和结直肠癌患者使用靶向药物前应进行K-ras基因突变状态的检测。

本试剂盒以人非小细胞肺癌、结直肠癌肿瘤组织切片提取的基因组DNA为检测样本，用于检测肿瘤组织K-ras基因第12，13密码子的12种体细胞突变（表1），提供突变状态的定性结果。

为临床肿瘤靶向药物的个体化用药提供辅助诊断依据，本品适用于进入个体化靶向治疗疗程前的患者使用。

表1 本品可检测的K-ras基因突变【检验原理】本试剂盒基于实时PCR平台，结合了特异引物、荧光探针和熔解曲线技术，定性检测DNA样品中K-ras 基因12，13密码子是否存在突变。

用一对K-ras基因特异引物，该引物可扩增12种突变型和野生型的K-ras目标序列，利用标记了FAM荧光基团和淬灭基团的双标记探针一方面抑制野生型基因的扩增，提高突变基因的检测灵敏度，另一方面在扩增后用熔解曲线法实现对扩增产物的分析，荧光探针在未杂交时因荧光基团和淬灭基团相互接近而被淬灭，不发荧光，杂交状态时，二者相互离开而产生荧光。

人类KRAS基因7种突变检测试剂盒（荧光PCR法）说明书【产品名称】通用名称：人类KRAS基因7种突变检测试剂盒（荧光PCR法）英文名称：Human KRAS Gene 7 Mutations Fluorescence Polymerase Chain Reaction (PCR) Diagnostic Kit【包装规格】12测试/盒【预期用途】KRAS基因是人体肿瘤中常见的致癌基因。

该基因的突变常见于多种恶性肿瘤，在肺癌患者中的突变率为15～30%，在结直肠癌患者中的突变率为20～50%。

导致KRAS处于激活状态的突变主要位于第12和13密码子上。

KRAS 基因突变一般会使肺癌患者对EGFR酪氨酸激酶抑制剂产生耐药，使结直肠癌患者对抗EGFR抗体类药物产生耐药。

但是，2010年10月的最新研究发现第13密码子上的Gly13Asp（G13D）突变亦对抗EGFR抗体类药物有治疗反应性（参见：De Roock. W. JAMA. 2010;304(16):1812-1820）。

因此，KRAS基因突变检测能提高肿瘤临床治疗的针对性，降低治疗费用，节省宝贵的治疗时间。

大部分肿瘤的突变都是体细胞突变，突变细胞往往与野生型细胞混杂在一起，因此所提取的DNA常带有大量野生型DNA，所以对体细胞突变检测需要较高的特异性，而目前广泛使用的直接测序法检测能力有限，不能完全满足临床需要。

本试剂盒用于检测人类KRAS基因的12和13密码子上7种热点体细胞突变（见表1），试剂盒以DNA为检测样本，提供突变状态的定性评估。

辅助临床医生筛选出可受益于肿瘤靶向药物的大肠癌等癌症患者。

该产品用于组织中提取DNA的KRAS基因7种突变的检测，为临床医生对大肠癌或肺癌患者选择肿瘤靶向药物治疗提供参考。

表1 人类KRAS基因的12和13密码子上7种热点体细胞突变突变名称氨基酸变化碱基变化Cosmic ID 公司命名Gly12Asp 甘氨酸到天门冬氨酸GGT>GAT 521 12-2-A Gly12Ala 甘氨酸到丙氨酸GGT>GCT 522 12-2-C Gly12Val 甘氨酸到缬氨酸GGT>GTT 520 12-2-T Gly12Ser 甘氨酸到丝氨酸GGT>AGT 517 12-1-A Gly12Arg 甘氨酸到精氨酸GGT>CGT 518 12-1-C Gly12Cys 甘氨酸到胱氨酸GGT>TGT 516 12-1-T Gly13Asp 甘氨酸到天门冬氨酸GGC>GAC 532 13-2-A 【检测原理】本试剂盒基于实时PCR平台结合了特异引物和双环探针两种技术，检测DNA样品中含有的突变基因。

【产品名称】通用名称：人类KRAS基因7种突变检测试剂盒（荧光PCR法）英文名称：Human KRAS Gene 7 Mutations Fluorescence Polymerase ChainReaction (PCR) Diagnostic Kit【包装规格】12测试/盒【预期用途】KRAS基因是人体肿瘤中常见的致癌基因。

该基因的突变常见于多种恶性肿瘤，在肺癌患者中的突变率为15～30%，在结直肠癌患者中的突变率为20～50%。

导致KRAS处于激活状态的突变主要位于第12和13密码子上。

KRAS基因突变一般会使肺癌患者对EGFR酪氨酸激酶抑制剂产生耐药，使结直肠癌患者对抗EGFR抗体类药物产生耐药。

但是，2010年10月的最新研究发现第13密码子上的Gly13Asp（G13D）突变亦对抗EGFR抗体类药物有治疗反应性（参见：De Roock. W. JAMA. 2010;304(16):1812-1820）。

因此，KRAS基因突变检测能提高肿瘤临床治疗的针对性，降低治疗费用，节省宝贵的治疗时间。

大部分肿瘤的突变都是体细胞突变，突变细胞往往与野生型细胞混杂在一起，因此所提取的DNA常带有大量野生型DNA，所以对体细胞突变检测需要较高的特异性，而目前广泛使用的直接测序法检测能力有限，不能完全满足临床需要。

本试剂盒用于检测人类KRAS基因的12和13密码子上7种热点体细胞突变（见表1），试剂盒以DNA为检测样本，提供突变状态的定性评估。

辅助临床医生筛选出可受益于肿瘤靶向药物的大肠癌等癌症患者。

该产品用于组织中提取DNA的KRAS基因7种突变的检测，为临床医生对大肠癌或肺癌患者选择肿瘤靶向药物治疗提供参考。

表1 人类KRAS基因的12和13密码子上7种热点体细胞突变突变名称氨基酸变化碱基变化Cosmic ID 公司命名Gly12Asp 甘氨酸到天门冬氨酸GGT>GAT 521 12-2-A Gly12Ala 甘氨酸到丙氨酸GGT>GCT 522 12-2-C Gly12Val 甘氨酸到缬氨酸GGT>GTT 520 12-2-T Gly12Ser 甘氨酸到丝氨酸GGT>AGT 517 12-1-A Gly12Arg 甘氨酸到精氨酸GGT>CGT 518 12-1-C Gly12Cys 甘氨酸到胱氨酸GGT>TGT 516 12-1-T Gly13Asp甘氨酸到天门冬氨酸GGC>GAC 53213-2-A【检测原理】本试剂盒基于实时PCR平台结合了特异引物和双环探针两种技术，检测DNA样品中含有的突变基因。

KRAS基因突变及BMP3/NDRG4基因甲基化和便隐血联合检测试剂盒（PCR 荧光探针法-胶体金法）产品审评摘要一、产品概述（一）产品主要组成成分表 1 试剂盒组成、规格各组分的主要成分详见说明书。

该产品配套使用的样本采集装置和核酸提取试剂为杭州诺辉健康科技有限公司生产的粪便检验预处理装置（浙杭械备20160367号）和核酸提取或纯化试剂（浙杭械备20180059号）。

（二）产品预期用途本试剂盒用于体外定性检测人粪便样本中的KRAS基因突变（包括但不区分G12D、G12A、G12V、G12S、G12R、G12C、G13D）、BMP3和NDRG4基因甲基化及血红蛋白，各个指标的检测值通过“KRAS基因突变及BMP3/NDRG4基因甲基化和便隐血联合检测分析软件”计算综合评分，用于对肠镜依从性差的结直肠癌高风险人群的筛查。

综合评分大于或等于阳性判断值的样本为阳性，表示受检者体内可能有结直肠癌和/或进展期腺瘤，需要进一步接受肠镜检查；反之，如果综合评分低于阳性判断值，表示受检者体内有结直肠癌和/或进展期腺瘤的可能性低，但并不能完全排除疾病风险。

鉴于受试者为高风险人群，因此在必要时仍应建议进行肠镜检查。

该产品适用人群为年龄40-74岁的结直肠癌高风险人群（高风险人群判定参照中国结直肠肿瘤早诊筛查相关专家共识）。

本产品不能替代肠镜，不能用于普通人群的肿瘤筛查，临床诊断过程中不应以本产品检测结果作为临床诊断的唯一依据。

（三）产品包装规格48测试/盒（四）产品检验原理本试剂盒基于荧光PCR技术和胶体金技术，对粪便样本中可能含有的脱落肠道癌变细胞中的变异核酸物质及粪便中可能潜隐的血红蛋白进行检测。

本试剂盒基因检测部分针对粪便DNA中的KRAS基因点突变及BMP3和NDRG4基因中CpG岛胞嘧啶甲基化。

其中KRAS检测采用TaqMan探针及ARMSPCR达到对KRAS基因第二外显子12和13编码子上7种点突变的特异性检测。

艾德⼈类10基因突变联合检测试剂盒（可逆末端终⽌测序法）受理号：CSZ1700127体外诊断试剂产品注册技术审评报告产品中⽂名称：⼈类10基因突变联合检测试剂盒（可逆末端终⽌测序法）产品管理类别：三类6840申请⼈名称：厦门艾德⽣物医药科技股份有限公司国家⾷品药品监督管理总局医疗器械技术审评中⼼⽬录基本信息 (3)⼀、申请⼈名称 (3)⼆、申请⼈住所 (3)三、⽣产地址 (3)产品审评摘要 (4)⼀、产品概述 (4)⼆、临床前研究摘要 (7)三、临床评价摘要 (15)四、收益-风险评估 (24)综合评价意见 (28)基本信息⼀、申请⼈名称厦门艾德⽣物医药科技股份有限公司⼆、申请⼈住所厦门市海沧区⿍⼭路39号三、⽣产地址厦门市海沧区⿍⼭路39号产品审评摘要⼀、产品概述（⼀）产品主要组成成分表1 试剂盒主要组成成分试剂盒具体组成成分、配套试剂及软件见说明书。

（⼆）产品预期⽤途本试剂盒⽤于定性检测⾮⼩细胞肺癌（NSCLC）、结直肠癌（CRC）患者经中性福尔马林固定的⽯蜡包埋（FFPE）的组织样本中EGFR/ALK/ROS1/RET/KRAS/NRAS/PIK3CA/BRAF/HE R2/MET基因变异。

其中，针对NSCLC，EGFR基因中：19号外显⼦缺失（19del）、L858R点突变⽤于吉⾮替尼⽚的伴随诊断检测，T790M点突变⽤于甲磺酸奥希替尼⽚的伴随诊断检测；AL K基因重排（融合）和ROS1基因重排（融合）⽤于克唑替尼胶囊的伴随诊断检测；针对CRC，KRAS基因野⽣型⽤于西妥昔单抗注射液的伴随诊断检测；如表2所⽰。

表2 伴随诊断⽤途的基因变异类型及相应的靶向药物表3中为本试剂盒可以检出，但未经伴随诊断验证的基因变异类型。

表3 未经伴随诊断⽤途验证的基因变异类型其检测结果仅供临床参考，不应作为患者个体化治疗的唯⼀依据。

临床医⽣应结合患者病情及其他实验室检测指标等因素对检测结果进⾏综合判断。

（三）产品包装规格24测试/盒（四）产品检验原理本试剂盒通过构建样本DNA测序⽂库，并使⽤特异探针对⽂库进⾏⽬标区域捕获富集，捕获后的⽂库通过⾼通量测序，可实现多个基因多个突变的⼀次性检测。

上海澳斯泰医学检验所KRAS基因检测报告姓名：性别：年龄：科别：床号：就诊卡号：住院号：送检日期：送检人：刘春萍临床诊断：收到日期：2013.08.20 样本种类：切片样本编号：13MK0283检测项目及使用仪器：1. 送检目的：检测KRAS基因是否存在突变。

2. 检测方法：ARMS 法。

3. 主要设备：ABI 7300荧光PCR仪。

检测结果：检测项目检测数据结果K-ras 阳性突变型K-ras G13D 阴性野生型结论：经检测患者速成丽 KRAS基因为突变型说明K-ras基因是人体肿瘤中的致癌基因，常见于多种恶性肿瘤，在肺癌患者中突变率为15-30%，在结直肠癌患者中为20-50%[1-2]。

KRAS 基因突变与NSCLC对吉非替尼、厄罗替尼等靶向治疗药物的原发性耐药有关[3]。

K-ras基因的突变还使结直肠癌患者对西妥昔单抗的治疗产生耐药性。

美国国家癌症综合网络（NCCN）2009年版的临床指南[4]中明确指出：肿瘤患者接受EGFR靶向药物治疗之前，必须进行K-ras基因突变检测，根据检测结果决定是否使用EGFR靶向药物作为临床治疗措施。

1.Amado RG et al. J. Clin. Oncol.2008;26:1626-3.42.Eberhard DA et al. J. Clin. Oncol.2005;23:5900-93.Lièvre A et al. J. Clin. Oncol.2008;26:374-94.NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology for NSCLC. V2.2009检测日期：2013.08.20报告日期：2013.08.21 检验者：常京审核者：陆孟超附件：K-ras 基因内参基因阳性对照标本KRAS阴性对照标本KRAS G13D。

人类基因有效DNA 浓度检测操作流程1.目的介绍使用实时PCR 技术对基因有效DNA 浓度进行定量、质控。

辅助EGFR/KRAS/BRAF 基因突变检测试剂盒的使用。

2.实验材料试剂供应商人类基因有效DNA 浓度定量检测试剂盒(荧光PCR 法)厦门艾德生物医药科技有限公司实时荧光PCR 仪–PCR96孔板或八联PCR 反应管–3.方法注意：每次实验均使用新鲜配制的基因组DNA 标准品。

3.1制备2.5ng/μL 标准DNA ：吸取2μL 基因组DNA （40ng/μL ）至30μL 超纯水中，振荡混匀。

3.2用20μL 标准DNA 和20μL 超纯水中制备2倍梯度稀释的标准品，每次加样后都应混匀。

浓度（ng/µL ）每反应加入总DNA 量（ng ）2.512.51.25 6.250.6253.1250.3121.56253.3按照表1制备预混液。

所有样品(DNA 样品、标准品、阴性对照)应当做两复孔或三复孔以提高标准曲线和定量结果的准确性。

3.4分装45µL 预混液至八联PCR 反应管中。

3.5加入5µLDNA 样品、标准品、水(NTC ，/阴性对照)至八联PCR 反应管内。

表1预混液配制各组份名称体积/反应(µL)反应混合液45Taq 酶0.25DNA53.6上qPCR 仪(MX3000P/MX3005P 或其它品牌)打开MXPro 软件，选择Quantitative PCR(Multiple Standards)输入样品编号4.数据分析4.1在Setup界面将标准品设置成“Standard”。

4.2输入相应的浓度值。

如下图：4.3选择“Analysis ”，“Standard Curve ”。

标准曲线的相关系数R 2应大于0.95。

4.4选择“Text report ”。

4.4导出定量结果。

4.5阴性对照收集到荧光信号，说明实验中发生了交叉污染，数据无效，需重复实验。