人类K-ras基因突变检测试剂盒说明书

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癌组织K-ras基因突变、术前血清CEA水平与结直肠癌临床病理特点的关系

Ｋｒｓ —ａ基因突变者３９例（９％）其中１３．０，２号密码子突变３例，３号密码１１
子突变８。有淋巴结转移者Ｋｍｓ例 — 基因突变率（７８）５．明显高于无淋巴结转移者（３６）有肝脏％２．％，转移者Ｋｒ —舾基因突变率（２％）６．明显高于无肝转移者（４５）ＴＭ分期 Ⅲ 、５３．％，Ｎ Ⅳ期Ｋｒｓ因突变 —ａ基率（６５明显高于Ｉ、５．％） Ⅱ期（４１。Ｋｒ基因突变率与肿瘤大小、２．％） —ａｓ部位、肿瘤浸润深度、分化程度无密切关系。４９例ＣＡ水平超出正常范围（９％）Ｅ４．。有淋巴结转移或肝转移患者ＣＡ水平显著高于０Ｅ无淋巴结或肝转移患者（＜Ｏ５）在肿瘤不同的临床病理分期（ｕｅ、ＮＰ．。０Ｄｋ’ ＴＭ分期）ＣＡ水平差异ｓ间Ｅ有统计学意义，ｕｅ和ＴＭ１期出现高阳性率。ＣＡ水平在肿瘤不同浸润深度、Ｄｋ’Ｄ期ｓＮｍ、ｖＥ体积及分化程度上无明显差异。结论癌组织Ｋｒｓ因突变和血清ＣＡ水平超出正常水平预示结直肠癌可能合 —ａ基Ｅ
・
论著・
癌组织Ｋｒｓ因突变、术前血清ＣＡ —ａ基Ｅ水平与结直肠癌临床病理特点的关系
吴文辉汤友珍肖隆斌蔡世荣何裕隆詹文华
【摘要】目的观察结直肠癌组织中Ｋｒ基因突变情况， —ａｓ术前检测患者血清ＣＡ水平，Ｅ探讨两
中华普通外科学文献（子版）００月第４电２１年８卷第４］ｈＡｃＧｎｕ（ｌｔｎＥｉｎ，Ａｇｔ０，ｏ，ｏ￣ＣｉｒｅｒＥｃｏｉｄｉ）ｕｕ１ＶｌＮ．ｎｈＳｇｅｒｃｔｏｓ２０４４

卵巢黏液性肿瘤中EGFR表达和K-RAS基因的突变

Байду номын сангаас
ＥｘｒｓｉｎｏｐｅｓｏｆＥＧＦａｄｍｕａｉｎｏ－ＲｎｔｔｆＫＲＡＳｇｎｎｏａｉｎｍｕｉｏｓｔｍｏｏｅｅｉｖｒａｃｎｕｕｒ
ＹＵＸａ・ｏｇｉｏｈｎ，ＹＥＬｕ，ＤＩｎ — ｕ，Ｓａ — ｏｇＮＧＨｏｇｈｉＨＵＫｕｎｙｎ，ＷＥＩＢｏｘｕａ — ｉ
（ｅａｔｅｔｆＰｔｏｏｙＪａｇｉｔｎｌｎｈｄＨａｔｏｉｌＮｎｈｎ刀ＤＤ，Ｃｉ）Ｄｐｒｎａｈｌ，ｉｎｘＭａｅａａｄＣｉｅｌＨｓｔ，ａｃａｇｍｏｇｒｌｈｐａ０６ｈｎａ
ＡｂｔａｔＰｒｏｅＴｎｅｔａｅｔｅｅｐｅｓｏｆＥＧＦｐｏｅｎａｄｍｕａｉｎｏＲＡＳｇｎｎｔｅｏａｉｎｍｕｉｏｓｔｍｏｒｎｓｒｃ：ｕｐｓｏｉｖｓｉｔｈｘｒｓｉｎｏｇＲｒｔｉｎｔｔｆＫ・ｏｅｅｉｈｖｒｃｎｕｕｕ，ａｄａｔｘｌｒｈａｈｇｎｓｆｈｖｒｎｍｕｉｏｓｔｍｏｒａｄｔｅｆａｉｉｔｆｔｒｅｅｅｔｅａｙｏｅｐｏｅｔｅｐｔｏｅｅｉｏｅｏａｉｃｎｕｕｕｎｈｅｓｌｙｏｇｔｎｈｒｐ．ＭｅｈｄＩｓｔａｂｉａｇｔｏｓｍｍｕｏｉｏｈｍｉａｎｈｓｃｅｃｌｔＰ９０ｎＣＲＬｅｅｕｅｏｄｔｃｅｅｐｅｓｏｆＥＲａｄｍｕａｉｎｏｅＫ— Ｖ００ａｄＰＲ— ＦＰｗｒｓｄｔｅｅｔｈｘｒｓｉｎｏＧＦｎｔｔｆｔＲＡＳｇｎ，ｒｓｅｔｅｙ，ｉ．０ｃｓｓｏ — ｔｏｈｅｅｅｐｃｉｌｎ２ａｅｆｏｖｖｒｎｃｓａｅｏ，０ｃｓｓｏｖｒｎｍｕｉｏｓｂｒｅｌｅｃｓａｅｏｎ０ｃｓｓｏｖｒｎｍｕｉｏｓｃｓｄｎｃｒｉｏ．Ｒｅａａｙｔｄｎｍａ４ａｅｆｏａａｃｎｕｏｄｒｎｙｔｄｎｍａａｄ４ａｅｆａａｃｎｕｙｔｅｏａｃｎｍａｉｉｏｉａ－ｓｉＴｅｐｓｔｅｅｐｅｓｏａｅｆＥＧＦｗｅｅ０．３．％ｕｔｓｈｏｉｉｘｒｓｉｎｒｔｓｏｖＲｒ７５ａｄ６．％ｎ７５ｉｖｒｎｃｓａｅｏｎｖｒａｃｎｕｏｄｄｎｎｏａｉｙｔｄｎｍａａｄｏａｉｎｍｕｉｏｓｂｒｅｉｅａ

肽核酸钳制PCR技术在结肠癌K-Ras基因突变检测中的优化

ａｄｕｌｃａｉ（ＮｍｉｎｃｅｃＰＡ）ａｄｐｉｅｓｏｄｔｔｏ — ｖｌｕａｏｓｅｕｔＴｅｌｐｎｔｉｅｐａｍｄｆ２ａｄ１ｅｉｄｎｒｒｔｅｅｗｌｅｍｔｉｎ．Ｒｓｌｈｄｔｅａｄｍｕｔｎｔｌｉｓｎ３ｍｃｌｅｔｓｉｗｙａｏｙｐｓｏ１
【ｂｔｃ】０ｊｔｅＴｅｅｐａｓｓｉ，ｉｐｎａｌｍｔｄｆ－ａｍｔｉｅｃｏａｅｔｏｃｏＡｓａｔｒｂｅｉｏｄｖｌｎｉｅｓｌａｄｓｂｅｏｒＲｓｕｔｎｄｔｔｎｉｐｔｎｌｃｖｏｅｔｖｍｅｔｅｈｏＫａｏｅｉｎｉｓｆｏｎ
１０７北京军事医学科学院附属医院消化道肿瘤内科００１
刘晓静，徐建明，宋三泰，师明磊，张彦，王洋
【摘
要】目的
优化建立一种敏感、简便、稳定地检测结肠癌患者ＫＲｓ —ａ基因突变的方法。方法
构建ＫＲｓ因第 —ａ基
ＳｓｍＯｃｌｙＡｌｔｏｉｌｃｄｍＭｄａＳｉｃｓｙｔｎｏｇ，ｆｉｅＨｓｔ，ａｅｙｏｅｉｌｃｎｅ，ｅｏｉｆａｄｐａＡｆｃｅ
ｎ００１Ｃｉａｇ１０７，ｈｎ
Ｊａ — ｉｇＥｍｉ：ｍｘ２０＠ｙｈｏｃｎｉｎｍｎ， — ａｌｊｕ０３ａｏ．ｏ
ｌ床肿瘤学杂志２１缶０２年２月第１第２期７卷
ＣｉｓｌｉｌｎｏｏｙＦｂ０２Ｖ１１，ｏ２ｈｎｅＣｉｃｃｌｇ，ｅ．２１，ｏ．７Ｎ．ｅｎａＯ来自・９・７

EGFR和KRAS基因检测意义

• 检测K-ras基因突变是深入了解癌基因的情况、了解各种癌症的发展预后、放化疗疗效的重要指标。 • 1.K-ras基因突变发生在肿瘤恶变的早期，并且原发灶和转移灶的K-ras基因高度保持一致。一般认为，K-ras基因状态不会因治疗而发生变化。 • 2.K-ras基因突变见于20%的非小细胞肺癌 (NSCLC)，其中肺腺癌占30%～50%。
KRAS基因 - K-ras基因突变发生的时间 • K-ras基因突变发生在肿瘤恶变的早期，并且原发灶和转移灶的K-ras基因高度保持一致。一般认为，K-ras基因状态不会因治疗而发生变化。大肠癌患者K-ras基因突变异常的概率为30％－35％。
KRAS基因 - K-ras基因检测（K-ras,p21）临床意义
EGFR基因检测在肺癌中的应用
检测方法：DNA测序法检测周期: 7-10天
检测位点：EGFR的18，19，21号外显子
标本要求：肿瘤组织病理切片，厚度8-10μm, 5-10张，要求肿瘤组织占标本的70%以上支气管镜活检组织，厚度8-10μm，需要10张切片
KRAS基因检测
KRAS蛋白处于EGFR信号通路通路的下游。在生理情况下，EGFR信号通路活化后， KRAS蛋白短暂激活，其后迅速失活，KRAS激活/失活效应是受控的。而KRAS基因突变时，可以导致 EGRF 信号通路持续激活，加速肿瘤细胞增殖。
KRAS基因检测在大肠癌中的应用
检测方法：DNA测序法检测周期: 7-10天
检测位点：KRAS基因第2外显子的12，13密码子
标本要求：肿瘤组织病理切片，厚度8-10μm, 5-10张，要求肿瘤组织占标本的70%以上。肠镜活检组织，厚度8-10μm，需要10张切片。

直肠癌患者HPV感染及APC、K-ras基因突变检测及其意义

肠癌恶性表型的重要因素；Ｐ而ＡＣ和Ｋｒｓ－基因突变是直肠癌发生常见的早期分子事件。ａ［关键词］直肠肿瘤；多肽现象，单链构象；乳头状瘤病毒，；人腺瘤性息内病，结肠； — ｓ因Ｋｒ基ａ［中图分类号］Ｒ３．７７５３［文献标志码］Ａ［文章编号］１０ —４１２１）８０８－５００７３（０００－６２０
例（０Ｏ）在有ＡＣ基因突变的４５．％；Ｐ３例直肠癌组织中，时伴有Ｋｒｓ因突变１倒（４２）而无ＡＣ基因突变的３同－基ａ９４．％，Ｐ２例直肠癌中，－ｓ因突变１Ｋｒ基ａ５例（６９）ＨＶ感染、Ｐ４．％，ＰＡＣ和Ｋｒｓ因突变三者间无相关性。结论：Ｐ感染可能是导致直 — 基ａＨＶ
采用ＰＲ法检测ｅＤＡ在直肠癌组织及正常结直肠黏膜组织中的表达；Ｃ一链构象多态性（ｉｇ — ｒｄｃｎｏｔｎＮＰＲ单ｓｌｓａｏｆｒｉｎｅｔｎｍａｏｐｌｍｒｈｓＳＣ）ｏｏｐｉＳＰ银染法检测ＡＣ基因突变密集区（ｕａｏｌｓｒｅｉ，Ｃ和Ｋｒｓ基因第１外显子的突变情况。ｙｍ，ＰｍｔｔｎｃｕｔｇｎＭＲ）ｉｅｒｏ－ａ结果：５例直肠癌组织中检测到５７５例ＤＡ为阳性（３３）而在正常黏膜组织中未检测到。ＮＮ７．％，ＤＡ的存在。ＨＶＰ感染与患者年龄和淋巴结转移存在相关性，而与患者族别、肿瘤大小、肿瘤类型、组织学类型、ｕｅ分期及浸润深度无关；ＰＤｋＡＣ基因突变４３例（７３）Ｋｒｓ５．％，－基因突变３ａ４例（５３）均与患者年龄、４．％，组织学类型、侵袭深度、巴结转移及Ｄｋ淋ｕｅ分期无相关性；中ＡＣ基因突变与患者性别存在相关性（００）其ＰＰ＜．５。在有ＨＶ感染的５Ｐ５例直肠癌中，同时伴有ＡＣ基因突变３Ｐ１例（６４）Ｋｒｓ因突变２５．％，－基ａ４例（３６）在ＨＶ阴性的２４．％；Ｐ０例直肠癌中，ＰＡＣ基因突变１（００）Ｋｒｓ因突变１２例６．％，－基ａ０

结直肠癌患者血浆K-ras基因突变情况分析

［摘要］采用直接测序法检测４例结直肠癌患者血浆、组织及２例正常人血浆中Ｋｒ基因突变情况。２肿瘤０－ｓａ
结果４例结直肠癌患者血浆Ｋｒ基因突变１（０４％）肿瘤组织Ｋｒ基因突变１（５２％）２－ｓａ７例４．８，－８ａ９例４．４。对照组无
黏稠的液体。加入等体积酚一氯仿一异戊醇（５２２：４：）１混合液振荡混匀，０００ｒｉ１０／ｎ离心１ｉ，上ｍ０ｍｎ将清液移入一个新的离心管中。在上清液中加入１／２
体积的７５．Ｍ醋酸铵，倍体积的１％乙醇，００２００５０
３讨论
１２２Ｎ．．ＤＡ提取
①将冷藏的血浆自然解冻后反
复离心，提取，弃上清液，留沉淀物，加入ＴＥ缓冲液溶解沉淀物。② 取１ｇ冷藏的肿瘤组织浸入液氮中，组织结冻，其捣碎，入研钵中，人少许液待将置加氮，磨至粉末状。取粉末状肿瘤组织１０ｍ，研０ｇ加入消化液１２ｍ，０ｏ消化３～１，．ｌ５Ｃ８ｈ待溶液成为透明
ｄｉ心２ｍｎ析出沉淀，上清。用７％乙醇ｍｎ离ｉ，弃０
瘤组织的ＤＡ进行直接测序，测Ｋｒｓ因的突Ｎ检 — 基ａ
变情况。现报告如下。１资料与方法
０５ｌ．～１洗涤沉淀，ｍ空气干燥。加人ＴＥ缓冲液溶
１２３引物设计．．
参照文献序列 …并结合计算机

非小细胞肺癌p53、FHIT、K-RAS基因突变与吸烟相关性Meta分析

【ｂｔｃ】０ｊｃｖ：ｏｅｒｅａｅａｓｅｅｔｎｆ５，ＨＴＫ— ＡｎｕｔｎａｄｂＡｓａｔｒｂｅｉＴｒｏＭｔａｌｉｏｔｌｉ３ＦＩ，Ｒｓｎｈｒａｏｏｐｇｍａｏａ
ｃｌｃｒｉｏｆｔｅｅｏｈｇｓｒｆａｔｒｏｃｅｔｅａｙｗｔｅｌａｃｎｍａｏｈｓｐａｕｅｒｃｏｙｔｈｍｏｈｒｐｉｈ５
一
ＥｎｉｇｒＰＣ，ａｚｎｅＲｙｎＤＰ，ｌｒＷ，ｔａ．ｅｌｏｅａｅ，ｉｐａｉＣａｋＪｅＷｅｋｙｄｃｔｘｌｅｓｌｔ１ｎ
马列，赵明静，群，王李秀林，王笑歌
ｐ３，ＨＴ，５ＦＩＫ—ＲＳｇｎｔｔｎｒｓｏｉｔｄｗｉｍｏｉｇｉｎｎ—ｓｌｃｌｌｎＡｅｅｍｕａｉｓａｅａｓｃａｅｔｓｋｎｎｏｏｈｍａｌｅｌｕｇｃｎｅｙＭｅａ—ａａｙｉａｃｒｂｔ — ｎｌｓｓ
ｌｅ（ＮＩ，ｈｎｃｎｅａｄＴｃｎｌｇｅｏｉａＤｔｂｇＶＰＩｆｍａｏｅｏ）ｔｅＵＳＮｔｎｉｉＣＫ）ＣｉａＳｉｃｎｅｈｏｏｙＰｒｄｌａａｅ（ＩｎｏｔｎＮｔｒ，．．ａｏａＬ— ｎｅｉｃａｒｉｗｋｈｉｌｂａｙｆｕＭｅａａａｅａｄｔｅＳＳｃｔｏｌｉｌｎｏｇＡＣ）ｐｏｅｄｎｓｅａｃｅｏ９０ｔｒｒｏｂｄｄｔｓ．ｏｉｙｆｉｃｃｌｙ（ＳＯｒｃｅｉｇｒｓｒｈｄｆｍ１９ＰｂｎｈＵ．ｅＣｎａＯｏｗｅｅｒｏ

实体肿瘤中Ras基因突变及其临床意义

关键词: 肿瘤; 基因, ras; 诊断, 鉴别; 预后
中图分类号: R 730 文献标志码: A 文章编号: 1001-1692( 2010) 01-0089-05
人类肿瘤中 Ras基因突变是最常见的癌基因异常, 大约可见于 30% 的人体肿瘤, Ras 基因家族由 H-ras, K-ras和 N-ras三个成员组成, 其中 K-ras 基因突变最常见。K-ras 尤其和腺癌相关, 目前原因不明。在几乎所有的胰腺癌和 50% 的大肠癌、甲状腺癌以及 30% 的肺腺癌可见 K-ras 基因突变, 然而在乳腺癌、卵巢癌中 Ras 基因突变非常罕见。随着研
本组病例术后均常规行胸腔负压引流, 无纵隔重度移位、心脏嵌顿、腔静脉撕裂等严重并发症发生。直接拉拢缝合膈肌, 使膈肌紧张, 减少全肺切除后胸腔空间, 减轻因切除受侵膈神经造成的膈肌反
常呼吸, 术后亦无膈肌裂开及膈疝形成。通过临床观察, 作者认为采用自体带蒂膈肌瓣修补心包缺损, 为心包内全肺切除提供了更满意的辅助条件。
常的生理要求 [ 3] 。由于心包内全肺切除病例数不断增多, 对缺损
心包的修复材料的选择上文献报道有壁层胸膜、阔筋膜、小牛心包及各种合成材料如涤纶网等。相比较而言, 壁层胸膜较薄弱, 强度往往达不到修补心包的理想要求, 阔筋膜手术制取及存活相对较困难, 对于小牛心包及合成材料则有异物排斥, 对合并有胸腔感染者就会使感染难以控制, 且费用较高; 而膈肌瓣血供丰富、强度高、弹力好、表面光滑、取材面积大、手术操作方便, 可避免以上各种修补材料的缺陷, 是更为理想的生物材料 [ 4] 。
1 Ras基因定位及生物学功能 R as 基因家族包括 H-ras, K-ras和 N-ras, 分别定

结直肠癌患者肿瘤组织中KRAS、NRAS和BRAF基因各亚型突变状况分析

结直肠癌患者肿瘤组织中KRAS、NRAS和BRAF基因各亚型突变状况分析郑宏江;尤雅坤;索成云【摘要】目的：分析结直肠癌患者肿瘤组织中 KRAS、NRAS和BRAF基因各亚型突变状况。

方法选取我院2014年6月至2015年6月期间就诊并经病理学检查确诊的结直肠癌患者82例作为本次研究对象，常规石蜡包埋组织，并使用甲醛固定，提取DNA组织，采取实时荧光定量PCR技术测定石蜡组织中KRAS基因、NRAS基因和BRAF基因突变情况。

结果本组82例患者中，有34例（41.46%）检测到KRAS基因突变，其中12密码子突变26例（31.71%），包括G12A 点突变4例（4.88%）、G12C 点突变4例（4.88%）、G12D点突变12例（14.63%）、G12S点突变3例（3.66%）、G12V点突变2例（4.88%）、G12R点突变1例（1.22%）；有8例（9.76%）检测到KRAS基因13密码子突变，均为G13D点突变；有4例（4.88%）检测到NRAS基因突变，其中12密码子突变2例（2.44%），包括G12D点突变1例（1.22%）、G13D点突变1例（1.22%），检测到61基因突变2例（2.44%），包括Q61H点突变1例（1.22%）、Q61R点突变1例（1.22%）；有3例（3.66%）检测到BRAF基因突变，均为V600E点突变。

结论 KRAS基因在结直肠癌患者中的突变率较高，虽然NRAS基因和 BRAF 基因突变率较低，但临床不容忽视。

通过KRAS基因、NRAS基因和BRAF基因检测，为临床结直肠癌患者的治疗提供重要参考信息。

【期刊名称】《现代消化及介入诊疗》【年(卷),期】2016(021)004【总页数】3页(P559-561)【关键词】结直肠癌;KRAS;NRAS;BRAF;基因突变【作者】郑宏江;尤雅坤;索成云【作者单位】056200 冀中能源峰峰集团有限公司总医院病理科;056200 冀中能源峰峰集团有限公司总医院手术室;056200 冀中能源峰峰集团有限公司总医院消化内科【正文语种】中文结直肠癌是我国常见的消化道肿瘤之一，发病率较高，位居我国恶性肿瘤第3位，仅次于肺癌、乳腺癌，且死亡率较高，占全部恶性肿瘤人数的6%～8%［1］。

Kras基因突变与非小细胞肺癌

Kras基因突变与非小细胞肺癌1 kras突变的临床意义kras是egfr的下游分子，当kras突变时，就不会受到egfr的调控，造成egfr标靶治疗无效，因此kras突变为负向生物指标（negative biomarker）。

表皮生长因子接受器（epidermal growth factor；egfr）是一个调控细胞生长的穿膜蛋白，属于人类egfr蛋白质家族的四个成员之一。

概观其讯息传导路径，表皮生长因子结合到细胞膜上的egfr，kras将细胞膜上egfr所接受的讯息传递到细胞核内，来调控细胞的正常生长。

但是当egfr或kras发生突变而持续活化时，就会造成细胞不断生长形成肿瘤。

众多研究资料显示，kras突变可作为egfr治疗的负向生物指标，而egfr抗体在有kras 突变的结直肠癌患者中几乎无疗效，因此负向指标能减少不必要的治疗。

2 非小细胞肺癌中kras突变意义非小细胞肺癌(NCSLC) 中15%～30%有kras基因突变。

目前研究认为,其突变与EGFR突变互相排斥,与egfr酪氨酸激酶抑制剂( EGFR-TKIs)耐药正相关,但与C-225疗效无正相关关系,与NCSLC不良预后有关, kras突变是独立于疾病分期的一个影响生存的因素。

但也有研究报道Ⅲ、IV期肺腺癌无论有无kras突变,有相同的PFS和OS。

kras突变(p21 ras)是肺腺癌估计复发、判断预后的良好指标,可用于肺腺癌复发的早期检测,还可用于区分肿瘤的起源。

kras 突变的腺癌趋向于低分化程度,与生存期更短有关,尤其是在可切除的病例。

kras基因突变可鉴别出肺腺癌的一个即使I、II期已行根治性切除但预后仍很差的亚型,这一结果已被美国癌症研究所最近的一项研究所证实。

现有许多研究探索法尼基转移酶抑制剂( Ftase抑制剂) 、RAF抑制剂、MAPK激酶(MEK)抑制剂来消除突变kras活性,以期改善临床疗效,但尚未有上市突破。

基因突变的检测方法

基因突变的检测方法基因突变的检测方法基因突变的研已成为当今生命科学研究的热点之一，检测方法也随之迅速发展。

人类细胞癌基因的突变类型已如上所述，对于基因突变的检测，1985以前，利用Southern印迹法，可以筛选出基因的缺失、插入和移码重组等突变形式。

对于用该法法不能检测的突变，只能应用复杂费时的DNA序列测定分析法。

多聚酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）技术是突变研究中的最重大进展，使基因突变检测技术有了长足的发展，目前几乎所有的基因突变检测的分子诊断技术都是建立于PCR的基础之上，并且由PCR衍生出的新方法不断出现，目前已达二十余种，自动化程度也愈来愈高，分析时间大大缩短，分析结果的准确性也有很大很提高。

其中包括单链构象多态性（single-strand comformational polymorphism,SSCP）和异源双链分析法（heteroduplex analysis,HA）。

下面分别介绍几种PCR衍生技术及经典突变检测方法，可根据检测目的和实验室条件选择时参考。

PCR-SSCP法PCR-SSCP法是在非这性聚丙烯酰胺凝胶上，短的单链DNA和RNA分子依其大街基序列不同而形成不同构象，一个碱基的改变将影响其构象而导致其在凝胶上的移动速度改变。

其基本原理为单链DNA在中性条件下会形成二级结构，这种二级结构依赖于其碱基组成，即使一个碱基的不同，也会形成不同的二级结构而出刺同的迁移率。

由于该法简单快速，因而被广泛用于未知基因突变的检测。

用PCR-SSCP法检测小于200bp的PCR产物时，突变检出率可达70％-95％，片段大于400bp时，检出率仅为50％左右，该法可能会存在1％的假阳性率。

应用PCR-SSCP法应注意电泳的最佳条件，一般突变类型对检测的灵敏度无大的影响，同时该法不能测定突变的准确位点，还需通过序列分析来确定。

Sarkar等认为对于大于200bp的片段，用其RNA分子来做SSCP会提高其录敏度。

大肠癌K-ras、p53基因突变分析及其与肝转移的关系

１．１一般资料
４５），４６．７％（２１／４５）和６２．２％（２８／４５）。术前外周血、术前门静脉血、术后门静脉血及癌组织ｐ５３基因突变阳
期、Ｃ期各１５例，直肠癌ｌ８例，结肠癌２７例，术中均未发现肝转移，均行大肠癌根治术，术后ＤｕｋｅＢ
肝脏是大肠癌血行转移的主要靶器官，约２５％大肠癌在初次确诊即发现肝转移但目前常规检测手段对于直径＜ｌａｍ的微小转移灶，很难作出明确的诊断。我们通过对本科大肠癌患者的癌组织标本
１．２．２Ｋ — ｒａｓ和ｐ５３基因突变检测方法：① 提取样
脉＞术前门静脉血＞外周血。ｐ５３基因突变率：癌组织＞术后门静脉＞术前门静脉血＞外周血。大肠癌不同分期术后
门静脉血Ｋ．ｒａｓ基因突变率：ＤｕｋｅＣ＞ＤｕｋｅＢ＞ＤｕｋｅＡ（Ｐ＜０．０５）；ｐ５３基因突变率：ＤｕｋｅＣ＞ＤｕｋｅＢ＞ＤｕｋｅＡ
床随诊术后２年内肝转移率探讨Ｋ．ｒａｓ、ｐ５３基因突变与大肠癌肝转移的关系，为术后早期经肝脏区域化疗提供实验依据。
１资料和方法
采用卡方检验。
２．１Ｋ — ｒａｓ和ｐ５３基因突变阳性率电泳条带差异

RAS基因和EGFR检测在结直肠癌治疗中的意义讲义

总结了西妥昔单抗单药或联合化疗作为mCRC的一线、二线及三线治疗方案，比较了未经选择的患者、K-ras野生型和K-ras突变型患者在RR、PFS、OS上的差异。
单药有效率为13%
Banck MS1, Grothey A.Biomarkers of Resistance to Epidermal Growth Factor Receptor Monoclonal Antibodies in Patients with Metastatic Colorectal Cancer.Clin Cancer Res. 2009;15(24):7492-7501.
AKT
MTOR
Rictor
MTOR Raptor
PI3K下游通路抑制剂正待研究 e.g. BKM120, perifosine, MK2206, everolimus, temsirolimus
p70s6k
细胞浆细胞核
三、西妥昔单抗单药疗效？可以单独用药？
• 体能状况差或/和不能耐受化疗的mCRC患者，如 ras为野生型可以考虑西妥昔单抗单药治疗。值得注意的是，这类研究多以经历了多线治疗失败、体能状况较差的患者为研究对象。
总结
全RAS测定包括H-ras、K-ras和N-ras，临床实践中检测的全RAS检测包括K-ras和 N-ras
应用西妥昔单抗需要根据RAS突变情况， RAS检测不需要用复发转移后的标本进行检测，也就是说K-ras/N-ras检测既可以选择
原发瘤组织也可以选择转移灶组织
体能状况差或/和不能耐受化疗的mCRC患者，如ras为野生型可以考虑西妥昔单抗单药治疗。
正性因素： Grb2蛋白激活Sos蛋白 Sos蛋白激活Ras蛋白

ras基因及信号通路

ras基因及信号通路ras基因⾸先在Harvery⿏⾁瘤病毒（Ha-MSV）和Kirsten⿏⾁瘤病毒（Ki-MSV）的⼦代基因中被发现，在这种⼦代病毒中发现含有来源于宿主细胞的基因组的新基因序列，此后⼈们将这种宿主细胞基因称为ras基因。

KRAS基因突变与肺癌、胰脏癌和⼤肠癌的发⽣有着密切的关系，52﹪的肺腺癌病⼈有KRAS基因的突变。

台湾地区胰脏癌的病⼈的研究结果显⽰，有⾼达90﹪突变率。

基因发现1982年Weinberg和Barbacid⾸先从⼈膀胱癌细胞系中分离出⼀种转化基因，可使NIH 3T3细胞发⽣恶性转化，⽽从正常⼈组织中提取的DNA 则⽆此种作⽤。

随后，Santos与Parada发现上述转化基因并⾮新型基因，⽽是Harvery⿏⾁瘤病毒ras基因的⼈类同源基因，命名为H2ras。

同年，Krontiris在⼈肺癌细胞中发现Kirsten⿏⾁瘤病毒基因的同系物，称为K-ras.另⼀种相似的基因是在⼈神经母细胞瘤DNA感染NIH3T3细胞时发现的与ras类似的基因，称为N2ras，此种基因和病毒⽆关.基因结构[编辑](javascript:;)[ 语⾳](javascript:;)ras基因在进化中相当保守，⼴泛存在于各种真核⽣物如哺乳类，果蝇，真菌，线⾍及酵母中，提⽰它有重要的⽣理功能.哺乳动物的ras基因家族有三个成员，分别是H-ras,K-ras,N-ras，其中K-ras的第四个外显⼦有A,B两种变异体.各种ras基因具有相似的结构，均由四个外显⼦组成，分布于全长约30kb的DNA上.它们的编码产物为相对分⼦质量2.1万的蛋⽩质，故称为P21蛋⽩.已证明，H-ras位于⼈类11号染⾊体短臂上（11p15.1～p15.3),K-ras位于12号染⾊体短臂上（12p1.1～pter),N-ras位于1号染⾊体短臂上（1p22-p32），除了K-ras第四个外显⼦有变异外，每个ras基因编码P21的序列都平均分配在四个外显⼦上，⽽内含⼦的序列及⼤⼩相差很⼤，因⽽整个基因也相差很⼤，如⼈K-ras有35kb长，⽽N-ras长为3kb.由于有两个第四号外显⼦，K-ras可以两种⽅式剪接，但编码K-ras-B的mRNA含量⾼.除K-ras-B含有188个氨基酸外，其他两种Ras 蛋⽩均含有189个氨基酸.Ras蛋⽩[编辑](javascript:;)[ 语⾳](javascript:;)3.1 Ras蛋⽩的结构Ras蛋⽩为膜结合型的GTP/GDP结合蛋⽩，相对分⼦质量为2.1万，定位于细胞膜内侧.它由188或189个氨基酸组成，它的第⼀个结构域为含有85个氨基酸残基的⾼度保守序列，接下来含有80个氨基酸残基的结构域中，Ras蛋⽩结构轻微不同，除了K2Ras末端25个氨基酸由于不同的外显⼦⽽分为A型和B型外，其余Ras家族成员最后四个氨基酸均为Cys1862A2A2X2COOH序列.Ras蛋⽩存在4种异构型：H2Ras,N2Ras,K2Ras4A和K2Ras4B，它们是3种基因的产物，其中K2Ras4A和K2Ras4B是同⼀基因不同剪接的结果.3.2 Ras蛋⽩的功能Ras(P21）蛋⽩位于细胞膜内侧，它在传递细胞⽣长分化信号⽅⾯起重要作⽤.它属于三磷酸鸟苷（GTP）结合蛋⽩（⼀种细胞信息传递的耦联因⼦），通过GTP与⼆磷酸鸟苷（GDP）的相互转化来调节信息的传递.P21与GTP和GDP有很强的亲和性，⽽且有较弱的GTP酶活性.正常情况下P21和GDP结合处于失活状态，当细胞外的⽣长分化因⼦把信号传导到胞膜内侧的P21时，可增强P21与GTP结合活性，使P21和GTP结合成为激活状态，信号系统开放.因为P21有GTP酶活性，可使GTP⽔解成GDP,P21和GDP结合后P21失活，信号系统关闭.正常情况下P21的GTP酶活性很弱，当和GTP酶激活蛋⽩(GAP）结合后其⽔解速度可提⾼1万倍⽽使P21失活.P21和GDP结合后可以激活鸟苷酸释放蛋⽩（GNRP),GNRP使P21释放GDP结合GTP，因此通过GTP和GDP的相互转化可以有节制地调节P21对信号系统的开启和关闭，完成⽣长分化信号传⼊细胞内的过程.Ras蛋⽩在合成后，需要经过两种⽅式翻译后修饰，才可定位于细胞膜内侧.①通过FTase在Ras蛋⽩羧基端的CAAX四肽结构中的Cys残基上加上⼀个类异戊⼆烯基团法尼基，随后AAX残基从C端上断裂脱落，法尼基化Cys羧甲基化，此修饰使RasC端具有疏⽔性；②N2或H2ras的半胱氨酸的S2酰基化，长链的S2酰基取代基使ras具有疏⽔性.有研究表明，激活ras的表达能增强⾎管⽣长因⼦（例如VEGF/VPF）的表达，提⽰Ras蛋⽩在⾎管⽣成中发挥作⽤，抑制Ras蛋⽩活性能抑制依赖Ras蛋⽩的肿瘤细胞增殖，也能⼲扰⾎管⽣成.同时，激活Ras蛋⽩还能抑制凋亡.Ras蛋⽩过度表达还能增加药物和紫外光诱导的凋亡，可能的机制是ras癌基因增强了细胞分解过氧化氢的能⼒从⽽抑制凋亡.然⽽，这个假说还需进⼀步研究.基因活化机制[编辑](javascript:;)[ 语⾳](javascript:;)4.1 ras基因激活的⽅式作为原癌基因的ras基因被激活以后就变成有致癌活性的癌基因.ras基因激活的⽅式有3种：基因点突变，基因⼤量表达，基因插⼊及转位.其中ras 基因被激活最常见的⽅式就是点突变，多发⽣在N端第12,13和61密码⼦，其中⼜以第12密码⼦突变最常见，⽽且多为GGT突变成GTT.不同突变位点对P21的活化机制不同，第12密码⼦突变可以减弱P21内在的GTP酶活性，并使细胞凋亡减少，细胞间接触抑制减弱；第61密码⼦突变可削弱GAP对P21的内在GTP酶活性，并可减弱GAP与P21结合的稳定性.4.2 ras基因突变致癌的机制ras基因激活构成癌基因，其表达产物Ras蛋⽩发⽣构型改变，功能也随之改变，与GDP的结合能⼒减弱，和GTP结合后不需外界⽣长信号的刺激便⾃⾝活化.此时Ras蛋⽩内在的GTP酶活性降低，或影响了GTP的活性，使Ras蛋⽩和GTP解离减少，失去了GTP与GDP的有节制的调节，活化状态的Ras蛋⽩持续地激活PLC产⽣第⼆信使，造成细胞不可控制地增殖，恶变.同时细胞凋亡减少，细胞间接触抑制增强也加速了这⼀过程.信号转导途径[编辑](javascript:;)[ 语⾳](javascript:;)Ras2MAPK信号转导途径5.1 Ras上游通路Ras能被复杂的⽹络激活.⾸先，被磷酸化激活的受体如PDGFR,EGFR直接结合⽣长因⼦受体结合蛋⽩（Grb2），这些受体也可以间接结合并磷酸化含有src同源区2(SH2）结构域的蛋⽩质（例如Shc,Syp）后，再激活Grb2.第⼆，Grb2的src同源区3(SH3）结构域与靶蛋⽩如mSos1,mSos2,C3G及发动蛋⽩（dynamin）结合.C3G与连接蛋⽩Crk的SH3结构域结合后耦联酪氨酸磷酸化⽽激活Ras.Crk也能结合mSos1激活Ras.Grb2与激活的受体结合促进鸟苷酸交换因⼦（Sos）蛋⽩定位在与Ras相邻的细胞膜上.这样，Sos与Ras形成复合体，GTP取代GDP与Ras结合后，Ras被激活，当GTP⽔解成GDP后Ras失活.Ras具有内在GTPase活性，它的活性可被RasGAPs调节，因⽽RasGAPs扮演Ras活性调节剂的⾓⾊.另外，Ras失活也受到⾼度调节。

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人类K-ras基因突变检测试剂盒说明书人类K-ras基因突变检测试剂盒（PCR-熔解曲线法）说明书【产品名称】通用名：人类K-ras基因突变检测试剂盒（PCR-熔解曲线法）

英文名：Diagnostic kit for Mutations of Human K-ras Gene (PCR-Melting Curve Analysis)

【包装规格】 20测试/盒【预期用途】 K-ras基因位于12号染色体短臂上，是重要的癌基因之一，编码一种21kD 的kras蛋白，参与细胞内的信号传递，主要包括PI3K/PTEN/AKT 和 RAF/MEK/ERK信号转导途径，这些转导途径是当前肿瘤靶向药物研究的热点，靶向药物通过抑制这些途径发生药理作用。K-ras基因第12和13密码子发生突变，将导致kras蛋白变异并处于持续激活状态，使药物失效。。据中国2010版《肿瘤学临床实践指南》，在一项包含101例肺腺癌亚型细支气管肺泡癌患者的回顾性研究中，所有患者均接受厄洛替尼单药一线治疗。K-ras突变者无一例缓解（0/18），而无K-ras突变者则有20例缓解（20/62，32%），差别有统计学意义（P <0.01）。因此，指南建议，非小细胞肺癌和结直肠癌患者使用靶向药物前应进行K-ras基因突变状态的检测。

本试剂盒以人非小细胞肺癌、结直肠癌肿瘤组织切片提取的基因组DNA为检测样本，用于检测肿瘤组织K-ras基因第12，13密码子的12种体细胞突变（表1），提供突变状态的定性结果。为临床肿瘤靶向药物的个体化用药提供辅助诊断依据，本品适用于进入个体化靶向治疗疗程前的患者使用。 1）。【主要组成成份】本试剂盒包含PCR反应液I、PCR反应液Ⅱ和野生型对照品等3管试剂。PCR反应液I包含相应的K-ras基因突变检测引物和探针，探针由FAM荧光指示；PCR反应液Ⅱ含有dNTP、Taq酶和MgCl2等。检测必须但试剂盒中不包含的组分： 1.5ml 离心管（用于配制PCR反应液和DNA提取）；0.2ml PCR管或8联PCR管或96孔PCR板；带滤塞的吸头（1ml、200μl和10μl）；

DNA提取试剂盒ReliaPrep™ FFPE gDNA Miniprep System（货号：A2352）

【贮存条件及有效期】置于-20℃条件下储存，有效期6个月。4-10℃避光条件下储存或运输不得超过7天。

【适用仪器】适用于ABI7500、Linegene FQD-96A型号的Real-time PCR扩增仪。【样本要求】 1. 适用样本为非小细胞肺癌、结直肠癌石蜡包埋病理组织切片，切片厚度10μm，数量1片，所用切片样品保存不超过3年。

2. 由于肿瘤的复杂性，所采集的临床样品往往会混有正常组织细胞，石蜡包埋病理切片样品肿瘤病变细胞

应不低于 %，所取部分应尽量在蜡块中部；

3. 使用商业化的试剂盒来提取人类基因组DNA，推荐使用Promega公司的ReliaPrep™ FFPE gDNA

Miniprep System（A2352）提取石蜡包埋组织切片样品，所提DNA需用紫外分光光度计测定浓度和纯度，其DNA OD260/OD280的值应在1.8~2.0，浓度应在3~300ng/μl之间，样本DNA质量不合格者不得用于检测，建议重新取切片进行核酸提取，提取完的DNA建议立即进行检测，否则请于-20℃以下保存，保存时间不要超过6个月。【检验方法】一、核酸提取（样本处理室）使用ReliaPrep™ FFPE gDNA Miniprep System进行核酸提取，提取步骤如下。

1. 用矿物油去除石蜡加矿物油500µl到装有组织切片样本的1.5ml离心管内，80℃孵育1min，振荡混匀；

2. 组织样本裂解，消化组织蛋白质 1) 离心管内加入200µl裂解液，室温10,000g离心15s,形成水油两相溶液，下层为水相，上层为油相；

2) 向离心管水相加入20µl蛋白酶K, 用移液枪吸打混匀； 3) 56℃孵育1h； 4) 80℃孵育1h；

5) 冷却到室温，离心15s； 3. 去除RNA 向离心管水相加入10µl RNase A，吸打混匀。室温（20-25℃）孵育5min； 4. 用核酸提取柱提取基因组DNA1) 加入 220µl BL Buffer到含裂解样品的离心管中，再加入240µl乙醇（95-100%），震荡混匀，室温10,000g离心15s，形成水油两相溶液，下层为水相，上层为油相；

2) 将结合柱置于收集管内，小心吸取离心管下层水相（包括可能形成的沉淀）转移到结合柱内，盖上管盖，将离心管丢弃。

3) 收集管室温10,000g离心30s，弃去管中的滤出液。

4) 把柱子重新装入收集管中，加入500μl 1 洗涤液至柱内，室温10,000g离心30 s，弃去滤出的洗涤液。 5) 重复步骤4）再洗涤一次；

6) 打开结合柱盖子，室温条件下16,000g离心3 min以甩干柱内残余的液体；

7) 把柱子转移至一个干净的自备1.5ml离心管中，向柱内加入50μl Elution Buffer，室温16,000 g 离心1 min

洗脱基因组DNA，丢弃提取柱。注意事项： 1. 操作提取柱和收集管时应戴好一次性手套； 2. 收集基因组DNA前的16,000g离心3 min操作必须开盖，以除净乙醇，乙醇残留过量将严重影响基因组的收集质量。

二、试剂准备（试剂准备室）将试剂从冰箱取出，室温融化，混匀，1000rpm快速离心20秒，备用；

三、反应体系配制（试剂准备室） 1. 根据检测样本数计算所需反应数，如样本数为n，则需做n+2个反应（包含一个阴性对照反应和一个

无模板对照反应）； 2. 根据表3计算所需各反应液的体积，并配制反应体系，反应体系混匀后3000rpm快速离心30秒，分装至PCR管中，每管18μl；四、加样（样本处理室）取2μl提取的样品DNA加入PCR反应管，盖上管盖，1000rpm离心或轻甩，排除管底气泡；阴性对照反应所用模板为试剂盒中野生型对照品，空白对照反应所用模板为超纯水（自备）。

五、上机检测（扩增室） 1. 将PCR管按顺序放入PCR仪，设置反应程序

（1） LineGene FQD-96A荧光定量PCR仪程序设置在52℃时收集荧光，荧光检测通道选择FAM检测通道，获得扩增曲线及Ct值，实时监测反应进程。

Melt分析时，目标温度65℃，起始温度39℃，台阶温度1℃，台阶温度维持30s，荧光采集方式为“台阶”。荧光检测通道选择FAM检测通道。

（2） ABI7500荧光定量PCR仪 Melt分析时，选择StepAndHold模式，温度39～65℃，每个步骤升高0.3℃，在每个温度都收集荧光。荧光检测通道选择FAM检测通道。

2. 运行PCR反应程序，保存文件。六、结果获取荧光定量PCR仪运行结束后，使用配套软件对本次试验的结果进行熔解曲线导数图（-dF/dT）分析。

【参考临界值】以野生型对照品反应管为参照，以野生型对照峰峰高的1/5划定阈值线。

【检验结果的解释】 1. 空白对照在Linegene FQD-96A中应无明显熔解峰，若分析后出现明显熔解峰，可能为试剂受到污染或操作过程中的污染，请排除污染源后重新检测；在ABI7500中，空白对照荧光变化曲线（Normalized Reporter）应为逐渐上升的一条斜线（如图4），若出现荧光值下降的熔解特征曲线，可能为试剂受到污染或操作过程中的污染，请排除污染源后重新检测； 2. 野生型对照管在熔解曲线分析后应有单独熔解峰，若野生型对照管无熔解峰，或出现2个或2个以上熔解峰，该批次样本需重新检测。请确认所使用的试剂是否仍在有效期内，确定操作是否严格按照说明书进行。

3. 若满足1和2要求，表明此次实验成功，对样品管进行分析：

（1）样品管只出现单独熔解峰，且Tm值在野生型对照管熔解曲线峰Tm±1范围内，该样本判定为阴

性（野生型），如图5野生峰；（2）样品管只出现单独熔解峰，且Tm值小于野生型对照管熔解曲线峰Tm值3℃以上，则该样本判定

为阳性（突变型），如图5突变峰；（3）样品管出现两个熔解峰，且两个熔解峰分别符合（1）和（2）的要求（如图6A），或样品管出现

一个宽峰（左右各有一个高点，可以判为峰值，但两峰间平缓过渡，凹陷不明显，见图6B、C和 D），则该样本判定为阳性（突变型）；（4）一般情况下不会出现突变峰与野生峰位置相差3℃以内或单一突变峰与野生型对照管的野生峰位

置相差1~3℃的情况，如确实发生此种情况，考虑仪器温度控制和传感系统是否发生故障；（5）样品管在熔解曲线分析中无明显熔解曲线峰，可能为DNA样本中存在PCR抑制剂或DNA量不够，请确认样本质量以及前处理过程是否规范，必要时再行检测。