一种人类K-ras基因突变检测试剂盒的质量标准研究

KRAS基因突变情况KRAS基因位于人类基因组的第12号染色体上，编码K-Ras蛋白质，其是Ras家族蛋白质中的一员。

Ras蛋白质是一种信号传导分子，能够调控细胞增殖、分化和存活等生理过程。

KRAS基因突变是指KRAS基因的DNA序列发生变异，导致蛋白质的氨基酸序列发生改变。

KRAS基因突变常见于KRAS基因第12、13和61个密码子位置上，这些位置是KRAS蛋白质功能的关键区域。

在肿瘤中，KRAS基因突变是相当常见的。

研究发现，约30%的肿瘤中存在KRAS基因突变，其中结直肠癌是其中最常见的。

研究还发现，KRAS 基因突变在结直肠癌中的发病率可高达40-50%。

此外，KRAS基因突变还与其他癌症类型的发生相关，如肺癌、胰腺癌和卵巢癌等。

KRAS基因突变与肿瘤发生和发展密切相关。

正常的KRAS蛋白质能够将细胞内的生长因子信号传递至细胞核，以促进细胞增殖和存活。

当KRAS基因突变发生时，它会导致KRAS蛋白质的活性增强，使其在缺乏生长因子的情况下仍能维持活性状态。

这种异常的信号传导活性会导致细胞不受控制地增殖，促进癌细胞的形成和扩散。

由于KRAS基因突变与癌症的发生和发展关系紧密，因此它已成为肿瘤治疗中的一个重要治疗标靶。

然而，传统的放疗和化疗治疗方案对KRAS基因突变的癌症通常无效。

研究人员通过开发KRAS基因突变特异性的治疗方法来解决这个问题。

目前，针对KRAS基因突变的治疗策略主要包括小分子靶向药物和免疫治疗。

小分子靶向药物的作用是抑制KRAS蛋白质的活性，从而阻断异常的信号通路。

然而，由于KRAS蛋白质的特殊结构，开发针对KRAS基因突变的有效药物一直是一个巨大的挑战。

最近的研究表明，有一些新型的小分子抑制剂能够靶向KRAS基因突变，并取得了一定的治疗效果。

免疫治疗是另一种新兴的治疗策略，它利用激活免疫系统来攻击癌细胞。

免疫检查点抑制剂是最常见的免疫治疗药物之一，它能够阻断免疫抑制分子与癌细胞的结合，增强免疫细胞对肿瘤细胞的攻击能力。

23·综述·RAS基因在结直肠癌发生发展及诊断治疗中的研究进展于鹤（成都军区昆明总医院 病理科，云南 昆明 650032）摘要：结直肠癌是世界上最为常见的消化道恶性肿瘤之一。

其具有相当高的发病率和死亡率。

RAS基因作为一种常见的癌基因，在结直肠癌的发生发展过程中发挥着重要作用。

作为RAS基因的成员之一，K-RAS在该肿瘤的靶向治疗药物疗效评估及预后预测等方面得到了广泛的关注。

本文就RAS基因在结直肠癌发生发展及诊断治疗中的研究进展作一综述。

关键词：结直肠癌 RAS基因；靶向治疗；疗效预测中图分类号：R45 文献标识码：A DOI：10.3969/j.issn.1671-3141.2016.96.0170　引言结直肠癌（Colorectal cancer，CRC）是世界上最为常见的消化道恶性肿瘤之一。

在美国，CRC的发病率和死亡率位居第三位[1]。

据统计，2014年美国有71，830名男性和65，000名女性被诊断为CRC，而有26，170名男性和24，040名女性将会死于CRC。

我国的CRC发病率和死亡率也较高，居所有肿瘤的第四位。

近几十年来，由于生活方式、环境和饮食的改变，我国CRC的发病率呈逐渐上升趋势[2]。

在北京、上海等城市，其已成为发病率居首位的消化道肿瘤[3]。

该病起病隐匿，早期并无症状，20%患者在初诊时即存在远处转移等情况[4]。

其在发病早期易治愈，而在转移后往往预后较差。

因此，了解CRC 的致病机制，做到早发现，早治疗显得十分重要。

然而，其致病机制并不十分清楚，目前认为主要是环境因素和遗传因素的共同作用所致[5]。

随着分子生物学和医学遗传学技术的发展，多个致病基因及突变已被发现与CRC的发病有关。

RAS基因便是其中之一。

该基因野生型及其突变型在CRC的发生发展、早期诊断及靶向治疗方面已经得到了广泛的研究和应用。

本文将从这些方法对其进行综述，为RAS基因在CRC中的临床应用提供思路。

人类EGFR基因突变荧光PCR检测试剂盒说明书【产品名称】通用名称：人类EGFR基因突变荧光PCR检测试剂盒英文名称：Shuwen® Human EGFR Gene Mutation Detection Kit for Real-Time PCR【包装规格】7测试/盒【预期用途】EGFR是一种细胞膜表面的糖蛋白受体，具有酪氨酸激酶（Tyrosine Kinase，TK）活性，是原癌基因c-erbB-1（HER-1）的表达产物。

EGFR 的主要信号转导途径有：PI3K-PDK 通路，RAS-RAF-MEK-ERK-MAPK 通路，PLC-γ 通路，JAK-STAT 通路。

通过这些途径，将胞外信号转化为胞内信号，从而有效应对外界的信号刺激，调节细胞的生长、增殖、分化，抑制细胞的凋亡。

EGFR异常调节通过多种机制促进细胞恶性转化，包括受体的过度表达、突变、生长因子-受体自分泌环的活化以及特定的磷酸酶失活，其中涉及肿瘤发生和进展的机制中最常见的是EGFR的基因突变和过度表达。

EGFR基因位于7号染色体短臂7pl2-14区，由28个外显子组成。

其突变主要发生在EGFR酪氨酸激酶的ATP结合位点的编码区（第18-20外显子），研究表明，EGFR酪氨酸激酶抑制剂（例如吉非替尼、厄洛替尼和埃可替尼等）疗效与EGFR基因的突变有密切的相关性。

目前已经报道大约有30种突变与吉非替尼的药物反应相关，主要是19外显子上的缺失突变和21外显子上的L858R的点突变。

外显子19上747-750位氨基酸的大约20种缺失约占所有突变的45%，其中以两种delE746-A750(2235_2249del15和2236_2250del15)最为常见，占到外显子19缺失总数的75%；外显子21上L858R的点突变占所有突变的45%左右；外显子18的3种点突变（G719X）约占5%；外显子20的突变占1%左右。

另外研究发现外显子20上的T790M突变与酪氨酸激酶抑制剂药物的耐药性相关。

结直肠癌患者KRAS、NRAS、BRAF基因突变与临床病理特征关系的研究贠田;王长松;李富林;吕学霞;蒙念龙;高春芳【摘要】目的探讨在结直肠癌中KRAS、NRAS和BRAF基因突变的状态与病理学因素之间的关系.方法采用RT-PCR的方法检测389例结直肠癌患者的KRAS、NRAS和BRAF基因突变情况,并用统计学方法分析与临床病理学因素之间的关系.结果KRAS总突变率为42.4％,该基因在直肠的突变率显著高于结肠.NRAS和BRAF基因的突变率分别为4.6％和4.1％,这两个基因的突变状态与临床病理学关系不大.结论KRAS、NRAS和BRAF基因属于相互联系的通路,一个发生突变将制约另外两个基因的发生改变,检测结直肠癌中KRAS、NRAS和BRAF基因的突变状态能够更好地指导个体化治疗.【期刊名称】《实用医药杂志》【年(卷),期】2019(036)008【总页数】4页(P733-736)【关键词】结直肠癌;KRAS;NRAS;BRAF;临床病理特征【作者】贠田;王长松;李富林;吕学霞;蒙念龙;高春芳【作者单位】471031 河南洛阳,解放军第989医院病理科;471031 河南洛阳,解放军第989医院病理科;471031 河南洛阳,解放军第989医院病理科;471031 河南洛阳,解放军第989医院病理科;471031 河南洛阳,解放军第989医院病理科;471031 河南洛阳,解放军第989医院病理科【正文语种】中文【中图分类】R735.34散发性结直肠癌是消化道最常见的恶性肿瘤之一，发病率和病死率长期高居恶性肿瘤前列。

结直肠癌的发生发展是多基因、多步骤的复杂过程，个体差异较大，随着精准治疗时代的来临，基于基因检测治疗策略的选择在提升结直肠癌的诊治水平中发挥着巨大的作用，在结直肠癌靶向治疗过程中检测KRAS、NRAS、BRAF基因突变状态对于结直肠癌的治疗有很重要的意义［1，2］。

结直肠癌是一个复杂的多基因参与的疾病，这些个体化药物的靶点基因在结直肠癌中起到关键的作用，因此探讨这些靶点与病理学因素之间的关系也很有必要。

ras基因及信号通路ras基因⾸先在Harvery⿏⾁瘤病毒（Ha-MSV）和Kirsten⿏⾁瘤病毒（Ki-MSV）的⼦代基因中被发现，在这种⼦代病毒中发现含有来源于宿主细胞的基因组的新基因序列，此后⼈们将这种宿主细胞基因称为ras基因。

KRAS基因突变与肺癌、胰脏癌和⼤肠癌的发⽣有着密切的关系，52﹪的肺腺癌病⼈有KRAS基因的突变。

台湾地区胰脏癌的病⼈的研究结果显⽰，有⾼达90﹪突变率。

基因发现1982年Weinberg和Barbacid⾸先从⼈膀胱癌细胞系中分离出⼀种转化基因，可使NIH 3T3细胞发⽣恶性转化，⽽从正常⼈组织中提取的DNA 则⽆此种作⽤。

随后，Santos与Parada发现上述转化基因并⾮新型基因，⽽是Harvery⿏⾁瘤病毒ras基因的⼈类同源基因，命名为H2ras。

同年，Krontiris在⼈肺癌细胞中发现Kirsten⿏⾁瘤病毒基因的同系物，称为K-ras.另⼀种相似的基因是在⼈神经母细胞瘤DNA感染NIH3T3细胞时发现的与ras类似的基因，称为N2ras，此种基因和病毒⽆关.基因结构[编辑](javascript:;)[ 语⾳](javascript:;)ras基因在进化中相当保守，⼴泛存在于各种真核⽣物如哺乳类，果蝇，真菌，线⾍及酵母中，提⽰它有重要的⽣理功能.哺乳动物的ras基因家族有三个成员，分别是H-ras,K-ras,N-ras，其中K-ras的第四个外显⼦有A,B两种变异体.各种ras基因具有相似的结构，均由四个外显⼦组成，分布于全长约30kb的DNA上.它们的编码产物为相对分⼦质量2.1万的蛋⽩质，故称为P21蛋⽩.已证明，H-ras位于⼈类11号染⾊体短臂上（11p15.1～p15.3),K-ras位于12号染⾊体短臂上（12p1.1～pter),N-ras位于1号染⾊体短臂上（1p22-p32），除了K-ras第四个外显⼦有变异外，每个ras基因编码P21的序列都平均分配在四个外显⼦上，⽽内含⼦的序列及⼤⼩相差很⼤，因⽽整个基因也相差很⼤，如⼈K-ras有35kb长，⽽N-ras长为3kb.由于有两个第四号外显⼦，K-ras可以两种⽅式剪接，但编码K-ras-B的mRNA含量⾼.除K-ras-B含有188个氨基酸外，其他两种Ras 蛋⽩均含有189个氨基酸.Ras蛋⽩[编辑](javascript:;)[ 语⾳](javascript:;)3.1 Ras蛋⽩的结构Ras蛋⽩为膜结合型的GTP/GDP结合蛋⽩，相对分⼦质量为2.1万，定位于细胞膜内侧.它由188或189个氨基酸组成，它的第⼀个结构域为含有85个氨基酸残基的⾼度保守序列，接下来含有80个氨基酸残基的结构域中，Ras蛋⽩结构轻微不同，除了K2Ras末端25个氨基酸由于不同的外显⼦⽽分为A型和B型外，其余Ras家族成员最后四个氨基酸均为Cys1862A2A2X2COOH序列.Ras蛋⽩存在4种异构型：H2Ras,N2Ras,K2Ras4A和K2Ras4B，它们是3种基因的产物，其中K2Ras4A和K2Ras4B是同⼀基因不同剪接的结果.3.2 Ras蛋⽩的功能Ras(P21）蛋⽩位于细胞膜内侧，它在传递细胞⽣长分化信号⽅⾯起重要作⽤.它属于三磷酸鸟苷（GTP）结合蛋⽩（⼀种细胞信息传递的耦联因⼦），通过GTP与⼆磷酸鸟苷（GDP）的相互转化来调节信息的传递.P21与GTP和GDP有很强的亲和性，⽽且有较弱的GTP酶活性.正常情况下P21和GDP结合处于失活状态，当细胞外的⽣长分化因⼦把信号传导到胞膜内侧的P21时，可增强P21与GTP结合活性，使P21和GTP结合成为激活状态，信号系统开放.因为P21有GTP酶活性，可使GTP⽔解成GDP,P21和GDP结合后P21失活，信号系统关闭.正常情况下P21的GTP酶活性很弱，当和GTP酶激活蛋⽩(GAP）结合后其⽔解速度可提⾼1万倍⽽使P21失活.P21和GDP结合后可以激活鸟苷酸释放蛋⽩（GNRP),GNRP使P21释放GDP结合GTP，因此通过GTP和GDP的相互转化可以有节制地调节P21对信号系统的开启和关闭，完成⽣长分化信号传⼊细胞内的过程.Ras蛋⽩在合成后，需要经过两种⽅式翻译后修饰，才可定位于细胞膜内侧.①通过FTase在Ras蛋⽩羧基端的CAAX四肽结构中的Cys残基上加上⼀个类异戊⼆烯基团法尼基，随后AAX残基从C端上断裂脱落，法尼基化Cys羧甲基化，此修饰使RasC端具有疏⽔性；②N2或H2ras的半胱氨酸的S2酰基化，长链的S2酰基取代基使ras具有疏⽔性.有研究表明，激活ras的表达能增强⾎管⽣长因⼦（例如VEGF/VPF）的表达，提⽰Ras蛋⽩在⾎管⽣成中发挥作⽤，抑制Ras蛋⽩活性能抑制依赖Ras蛋⽩的肿瘤细胞增殖，也能⼲扰⾎管⽣成.同时，激活Ras蛋⽩还能抑制凋亡.Ras蛋⽩过度表达还能增加药物和紫外光诱导的凋亡，可能的机制是ras癌基因增强了细胞分解过氧化氢的能⼒从⽽抑制凋亡.然⽽，这个假说还需进⼀步研究.基因活化机制[编辑](javascript:;)[ 语⾳](javascript:;)4.1 ras基因激活的⽅式作为原癌基因的ras基因被激活以后就变成有致癌活性的癌基因.ras基因激活的⽅式有3种：基因点突变，基因⼤量表达，基因插⼊及转位.其中ras 基因被激活最常见的⽅式就是点突变，多发⽣在N端第12,13和61密码⼦，其中⼜以第12密码⼦突变最常见，⽽且多为GGT突变成GTT.不同突变位点对P21的活化机制不同，第12密码⼦突变可以减弱P21内在的GTP酶活性，并使细胞凋亡减少，细胞间接触抑制减弱；第61密码⼦突变可削弱GAP对P21的内在GTP酶活性，并可减弱GAP与P21结合的稳定性.4.2 ras基因突变致癌的机制ras基因激活构成癌基因，其表达产物Ras蛋⽩发⽣构型改变，功能也随之改变，与GDP的结合能⼒减弱，和GTP结合后不需外界⽣长信号的刺激便⾃⾝活化.此时Ras蛋⽩内在的GTP酶活性降低，或影响了GTP的活性，使Ras蛋⽩和GTP解离减少，失去了GTP与GDP的有节制的调节，活化状态的Ras蛋⽩持续地激活PLC产⽣第⼆信使，造成细胞不可控制地增殖，恶变.同时细胞凋亡减少，细胞间接触抑制增强也加速了这⼀过程.信号转导途径[编辑](javascript:;)[ 语⾳](javascript:;)Ras2MAPK信号转导途径5.1 Ras上游通路Ras能被复杂的⽹络激活.⾸先，被磷酸化激活的受体如PDGFR,EGFR直接结合⽣长因⼦受体结合蛋⽩（Grb2），这些受体也可以间接结合并磷酸化含有src同源区2(SH2）结构域的蛋⽩质（例如Shc,Syp）后，再激活Grb2.第⼆，Grb2的src同源区3(SH3）结构域与靶蛋⽩如mSos1,mSos2,C3G及发动蛋⽩（dynamin）结合.C3G与连接蛋⽩Crk的SH3结构域结合后耦联酪氨酸磷酸化⽽激活Ras.Crk也能结合mSos1激活Ras.Grb2与激活的受体结合促进鸟苷酸交换因⼦（Sos）蛋⽩定位在与Ras相邻的细胞膜上.这样，Sos与Ras形成复合体，GTP取代GDP与Ras结合后，Ras被激活，当GTP⽔解成GDP后Ras失活.Ras具有内在GTPase活性，它的活性可被RasGAPs调节，因⽽RasGAPs扮演Ras活性调节剂的⾓⾊.另外，Ras失活也受到⾼度调节。