提取金荞麦愈伤组织总RNA的一种有效方法

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金荞麦中总黄酮的提取及含量测定

金荞麦中总黄酮的提取及含量测定倪红辉【期刊名称】《山西中医》【年(卷),期】2014(030)010【摘要】目的:测定不同溶剂对金荞麦中有效成分总黄酮类物质的提取效率,制定简便的金荞麦制剂的制备工艺.方法:采用紫外分光光度法,设定检测波长为510 nm,以芦丁为对照品绘制标准曲线,测定金荞麦中总黄酮含量.结果:在10倍量的溶剂提取下,60％乙醇的金荞麦提取效率最高;芦丁对照品在16～160(μg·mL-1)呈良好线性关系,求得直线回归方程为y=0.000 88X +0.160 2,r=0.997 4;用60％的乙醇为提取溶剂提取金荞麦中总黄酮的含量最高;精密度试验的RSD为0.56％;重复性试验的平均值为2.76％,RSD =2.92％ (n =6);加样回收率试验的平均值为98.43％,RSD=1.78％.结论:以60％的乙醇为溶媒提取金荞麦中的总黄酮类成分提取率最高,稳定性好,方法简便,适用于我院金荞麦制剂的生产.【总页数】3页(P49-51)【作者】倪红辉【作者单位】江苏省南通市中医院南通226001【正文语种】中文【中图分类】R286.0【相关文献】1.金荞麦籽粒中总黄酮提取工艺研究 [J], 唐宇;彭德川;孙俊秀;刘建林;邵继荣2.正交试验优选槐角总黄酮的提取工艺及不同来源槐角中总黄酮的含量测定 [J], 韦华梅;闫腾蛟;林宜沛;王剑波3.黄瑞香叶提取物中总黄酮与香豆素类成分的含量测定 [J], 康阿龙;汤迎爽;王卫峰;李芳4.白花九里明提取物中3种有机酸及总黄酮、总有机酸的含量测定 [J], 韩璐;黄薏霏;那袭雪;张文涛;宋丹;杨宏;宁小清5.潞党参中总黄酮的提取及含量测定 [J], 刘薇因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

【CN109620864A】一种金荞麦中总鞣质和表儿茶素的混合物及其提取方法和应用【专利】

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910113968.8(22)申请日 2019.02.14(71)申请人华颐药业有限公司地址 100000 北京市大兴区中关村科技园区大兴生物医药产业基地天荣街15号(72)发明人李昌福　商国懋　吴德海　张宸　(74)专利代理机构北京高沃律师事务所 11569代理人代芳(51)Int.Cl.A61K 36/70(2006.01)A61P 35/00(2006.01)(54)发明名称一种金荞麦中总鞣质和表儿茶素的混合物及其提取方法和应用(57)摘要本发明提供了一种金荞麦中总鞣质和表儿茶素的混合物的提取方法，属于医药制剂技术领域。

本发明通过限定具体的金荞麦粉碎后的粒径以及混悬工序热水的温度，使金荞麦中的鞣质和表儿茶素提取更加完全，提高了有效物质的转移率和喷雾干燥产物的收率，同时通过限定具体的相对密度，结合大孔吸附树脂的专属纯化技术和喷雾干燥技术，使喷雾干燥产物形态更细腻，分散性好，水分低，得到的总鞣质和表儿茶素的混合物稳定性好，填充的胶囊质量好，利于患者吸收。

权利要求书1页说明书7页CN 109620864 A 2019.04.16C N 109620864A权　利　要　求　书1/1页CN 109620864 A1.一种金荞麦中总鞣质和表儿茶素的混合物的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：将金荞麦粉碎至粒径2～3mm，得到金荞麦颗粒；将所述金荞麦颗粒用乙醇回流提取，得到提取液；将所述提取液过滤后所得滤液减压浓缩至相对密度为1.06～1.09，得到浸膏；将所述浸膏与热水混合后所得上清液经过滤后，用大孔吸附树脂柱层析分离，先用水洗脱至流出液无色，再用80％乙醇洗脱至流出液与三氯化铁试液无反应为止，再收集80％乙醇流出液，得到洗脱液，所述热水的温度为60～80℃；将所述洗脱液浓缩至相对密度为1.02～1.04，喷雾干燥，即得金荞麦中总鞣质和表儿茶素的混合物。

一种快速提取小麦叶片总RNA的方法

一种快速提取小麦叶片总RNA的方法崔素萍;康振生;赵杰;于秀梅【期刊名称】《西北植物学报》【年(卷),期】2006(026)002【摘要】从植物组织中提取高质量的RNA是进行植物分子生物学研究的必要前提和关键.同种植物不同器官的组织由于组成分的差异,提取RNA的方法也存在不同的难点.在苯酚法和氯化锂沉淀法的基础上,改进并提出了一种适合小麦叶片总RNA 的快速提取方法,消除了蛋白质、DNA、多糖、多酚等污染.该方法提取的小麦叶片总RNA,完整性好、纯度高,可用于RT-PCR、Northern杂交、RACE等实验操作,而且简单经济、快速、实验结果稳定,重复性好,还适合富含多糖和脂质的植物组织总RNA的提取.【总页数】5页(P314-318)【作者】崔素萍;康振生;赵杰;于秀梅【作者单位】西北农林科技大学,植物保护学院,陕西杨陵,712100;黑龙江八一农垦大学,食品学院,黑龙江大庆,163319;西北农林科技大学,植物保护学院,陕西杨陵,712100;西北农林科技大学,植物保护学院,陕西杨陵,712100;西北农林科技大学,植物保护学院,陕西杨陵,712100【正文语种】中文【中图分类】Q522;S512.1【相关文献】1.一种植物总RNA的快速提取方法 [J], 刘芬;于秀梅;刘大群2.一种快速提取盐桦叶片总RNA的方法建立 [J], 曾幼玲;邓爱华;曹文尧;张富春3.一种改良的快速提取小型昆虫总RNA的方法 [J], 高阳;朱春晖;谭新球;刘勇;彭静;张德咏4.一种快速提取香蕉叶片总核酸、总RNA和总DNA的新方法 [J], 柴娟;冯仁军;史后蕊;任梦云;王静毅;张银东5.一种组织总RNA的快速提取方法 [J], 梁虹;林敏因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

胡杨根、茎、叶、愈伤组织总RNA提取的研究

ｌｚｄｅＲＮＡｕｌｉｓｂｌｃｒｐｏｅｉｄｑａｔａｉｅｔｓ．ＴｈｅｕｔｉｄｃｔｈａｅｂｎｓｏｓｌｔｄｙｅｔｈｑａｉｅｙｅｅｔｏｈｒｓｓａｕｉｔｖｅｔｔｎｎｔｅｒｓｌｎｉａｅｔｔｔａｄｆｉｏａｅＲＮＡｒｄｈｗｅｅ
ｏｐｕｕｕｒｔａＯｌｆＰｏｌｓｅｐｈａｉｉｃｖ．
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ｇｎｘｒｓｉｎｒｌｔｄｒｓａｃｅｓｎｈｅｅｅｐｅｓｏｅａｅｅｅｒｈｓｕｉｇｔｅＲＮＡ．ｎｔｉａｅ．ｅｄｉｏｔｆｔ－ｅｒｏｄＰ．ｕｒｔｃｒｓｄａＩｈｓｐｐｒｓｅｌｎｇｒｏｓｏｗｏｙａ－ｌｅｐｈａｉａｗｅｅｕｅｓ
关键词：杨；系；Ｎ胡根ＲＡ提取中图分类号：２１９Ｓ７．１９文献标识码：Ａ
ＥｘｒｃｉｎｆｔｔｌＲＮＡｒｍｏｔ，ｔｍｓ，ｅｖｓａｄｃｌｔａｔｏｏｏａｆｏｒｏｓｓｅｌａｅｎａｌｉ
维普资讯 http://www.cqv第２卷第２３期２００８年６月
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金荞麦愈伤组织诱导及其总黄酮含量测定方法的建立

第２期
林静等：金荞麦愈伤组织诱导及其总黄酮含量测定方法的建立
２１３
芦丁对照品（南京替斯艾么中药研究所）其余药品均为分析纯（，成都科龙试剂厂）金荞麦植株由西南大．
学园林花卉研究所栽培繁育．
２方法
２１愈伤组织的诱导．
取金荞麦带芽茎段于自来水下冲洗３ｍｉ７％０ｎ５酒精消毒３ｓ无菌水冲洗１０１升汞消毒８ｉ无菌水冲，０，次，．％ｍｎ，洗５接种于１ＭＳ次，／培养基，２于温度２ ℃、５光照强度２０Ｌ、１ｈ：；４０ｘ／）照条件下培养．６ｄ￣成苗后取其叶片、不带芽茎段，叶片切为５ｍ，ａｒ不带芽茎段和叶柄切成０ｒ左右的小段，．ｍ５ａ分别接种于按正交法添加的各种激素及浓度为如下：６Ａｍ／）：１，．；Ａ（ｇ）：．Ｏ，．；２－（ｇ）：０１Ｂ（ｇＬ为：．０，．－（ｇ为ＢＬ．２ＮＡｍ／为０１．Ｏ００Ｌ，３５，Ｄｍ／为４Ｌ．；ＩＡｍ］）Ｏ１．Ｏ，３５的ＭＳ１ＭＳ和／培养基．２并根据愈伤组织的增殖陕慢、总黄酮含量的高低，挑选出最适合其生长的培养基，一个月
蒸水定容至２ｍ，５ｌ摇匀后静置１ｍｎ在５０ｍ５ｉ，ｎ处测定其吸光度．１该法在本实验中简称为方法一，以此为基础对金荞麦愈伤组织总黄酮含量测定实验条件进行优化，获得了一种适合测定金荞麦愈伤组织总黄酮含量的方法，
简称为方法二．
１仪器、试剂与材料
７２分光光度计（２ｓ上海棱光技术有限公司）ＰＢ，Ｙ型普通摇床（中国科学院武汉科学仪器厂）．

正交试验优选金荞麦提取工艺

正交试验优选金荞麦提取工艺作者：***来源：《中国民族民间医药·上半月》2024年第02期【摘要】目的：优选金荞麦水提取工艺。

方法：采用熵权法确定表儿茶素提取率和干膏率的权重并计算综合得分，以综合得分为指标，采用正交试验设计，以加水量、提取时间、提取次数为考察因素，优化金荞麦水提取工艺。

结果：金荞麦最佳提取工艺为加10倍量水，提取3次，每次提取60 min。

结论：优选出的提取工艺稳定可行，可用于金荞麦的提取。

【关键词】金荞麦；正交试验；表儿茶素；干膏【中图分类号】R284.2【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2024）03-0058-04DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2024.03.zgmzmjyyzz202403013Optimization of Extraction Technology for Fagopyri Dibotryis Rhizoma by Orthogonal Design YU JianTaiji Group Chongqing Fuling Pharmaceutical Factory Co.， Ltd.， Chongqing 408000， ChinaAbstract：Objective To optimize the water extraction of Fagopyri Dibotryis Rhizoma. Methods The weight coefficients and comprehensive score of the extraction rates of epicatechin and dry extract were calculated by entropy weight method. The water addition， extraction time and extraction times were optimized by orthogonal design. Results The optimum extraction conditions were as follows：refluxing extracted 3 times with 10 folds water， 60 min for each time. Conclusion The optimized extraction process was stable and feasible， which can be used for the extraction of Fagopyri Dibotryis Rhizoma.Keywords：Fagopyri Dibotryis Rhizoma; Orthogonal Design; Epicatechin; Dry Extract金荞麦又名赤地利、赤薜荔、野荞麦根，为中医常用中药之一，来源于蓼科植物金荞麦Fagopyrum dibotrys（D.Don） Hara 的干燥根茎［1］，具有清热解毒、排脓祛瘀的功效。

药用植物金荞麦研究进展

药用植物金荞麦研究进展YANG Xi-wen;ZHANG Yan;LI Long-yun【摘要】金荞麦Fagopyrum dibotry Hara.为蓼科荞麦属多年生宿根草本植物,以其干燥根茎入药,是一种传统常用中药材,具有清热解毒、排脓祛瘀之功能.近年因其显著的消炎抗菌、抗癌活性而备受国内外学者关注,具有潜在的巨大开发市场和前景.本文对近年来药用植物金荞麦的遗传多样性、组织培养技术、规范化种植技术、化学成分、功能基因以及开发利用和保护及金荞麦药材质量控制和药理作用等方面的研究进行综述,为金荞麦的综合开发利用提供参考.【期刊名称】《中国现代中药》【年(卷),期】2019(021)006【总页数】10页(P837-846)【关键词】药用植物;金荞麦;研究进展【作者】YANG Xi-wen;ZHANG Yan;LI Long-yun【作者单位】;;【正文语种】中文【中图分类】R282.71;R284;R285金荞麦Fagopyrum dibotrys Hara.为蓼科荞麦属多年生宿根性草本植物，是一种营养丰富并具有重要价值的资源植物，其根茎为常用中药材，地上部分也是一种优良的牧草资源[1]。

金荞麦药材又名野荞麦、苦荞头、金锁开银、荞麦三七等，性凉，味辛涩，归肺经，具有清热解毒、排脓祛瘀之功能，可用于肺痈吐脓、肺热喘咳、乳蛾肿痛、咽喉疼痛、头风痛、消化不良、肝炎腹胀、痢疾、痈疽疖肿、风湿痹痛等症[2]。

金荞麦根茎中主要含有原矢车菊素、表儿茶素、没食子酸、槲皮素、木犀草素等化合物。

现代研究表明，金荞麦根茎提取物还具有显著的抗癌、抑制肿瘤细胞侵袭、转移和消炎抗菌等作用，为金荞麦片、复方金荞麦颗粒、威麦宁胶囊等多种抗癌药和癌预防药物的主要成分[3-4]。

金荞麦分布十分广泛，我国主产于四川盆地、两广丘陵、江南丘陵、云贵高原及长江中下游平原，泰国、越南、尼泊尔、印度等国也有分布[5]。

郭杰等[6]基于38个环境因子以及金荞麦在我国的153个地理分布记录，研究了金荞麦潜在分布区及生态特征。

金荞麦功效成分提取工艺装置[实用新型专利]

专利名称：金荞麦功效成分提取工艺装置专利类型：实用新型专利
发明人：武彦辉
申请号：CN201220185723.X
申请日：20120427
公开号：CN202497739U
公开日：
20121024
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本实用新型的金荞麦功效成分提取工艺装置属于中药提取装置，是由冷却器、分离器、提取罐和蒸发器构成，提取罐的顶部出口连接除沫器，除沫器连接由冷凝器、冷却器和分离器构成的冷却分离装置；提取罐的底部出口经过滤器和储液槽连接蒸发器，蒸发器与加热器循环连接；自动控制器分别与冷却分离装置、过滤器、提取罐、储液槽、加热器和一效蒸发器电路连接。

本实用新型的金荞麦功效成分提取工艺装置，结构设计合理、实现了自动控制，一人就可以完成整套工艺操作，大大节约了人力成本，减轻了工人的劳动强度，有效的提高了药物制剂的质量和提取效率，达到了结构合理、占地面积小、节约生产成本、提高提取效率且操作简单，又节约人工成本的有益效果。

申请人：黑龙江康麦斯药业有限公司
地址：163457 黑龙江省大庆市让胡路区乘风大街309号
国籍：CN
代理机构：大庆市远东专利商标事务所
代理人：马洪发
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高山离子芥愈伤组织总RNA的提取方法研究

高山离子芥愈伤组织总RNA的提取方法研究岳修乐;李争艳;徐世健;张华;安黎哲【期刊名称】《草业科学》【年(卷),期】2012(029)012【摘要】为了探寻提取高山离子芥（Chorispora bungeana）总RNA的最佳方法和条件。

本研究分别采用改良的Trizol法、柱式离心法和CTAB法提取高山离子芥RNA，比较其得率、纯度、完整性和反转录后的PCR扩增效果；并对RNA 的保存以及去RNA酶的处理进行了优化。

结果表明，改良的Trizol法提取的RNA纯度和得率高、完整性好，转录后的PCR扩增效果好；RNA提取后室温保存8h内降解较少，80℃至少保存30d。

枪头、离心管等去RNA酶处理不完全会导致大量RNA降解，电泳槽等工具及电泳液的RNA酶灭活不彻底会使RNA在电泳过程中降解。

【总页数】6页(P1870-1875)【作者】岳修乐;李争艳;徐世健;张华;安黎哲【作者单位】兰州大学生命科学学院,甘肃兰州730000;安徽省农业科学院畜牧兽医研究所,安徽合肥230031;兰州大学生命科学学院,甘肃兰州730000;兰州大学生命科学学院,甘肃兰州730000;兰州大学生命科学学院,甘肃兰州730000【正文语种】中文【中图分类】Q943.1【相关文献】1.岩白菜幼叶总RNA的提取方法研究 [J], 刘喜军;王仕玉;郭凤根;李娟2.适用于转录组测序的大豆根总RNA的提取方法研究 [J], 谢钰珍;覃鸿妮;张宇;梅啸;吴凡3.濒危南药白木香愈伤组织总RNA提取方法研究 [J], 杨云;张争;孟慧;高志晖;陈怀琼;魏建和;冯锦东4.一种提取芸芥(E.Sativa Mill.)柱头组织总RNA的有效方法 [J], 白生文;范惠玲;马正龙;吴志强;王小明5.一种大量提取红豆杉中总RNA的方法研究 [J], 陈小凤;曾奇峰;邓旭;曾光尧;周应军因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

药用植物金荞麦愈伤组织诱导与植株再生

药用植物金荞麦愈伤组织诱导与植株再生陈彩霞;崔思然;江艳华;李艾莲【期刊名称】《植物科学学报》【年(卷),期】2012(030)003【摘要】目前转基因技术已成为植物定向遗传改良的重要手段,而建立稳定高频的离体再生系统是实现遗传转化的基础和前提。

本试验以25～30 d苗龄的金荞麦（Fagopyrum dibotrys）无菌苗叶片、茎节间、叶柄为外植体进行愈伤组织诱导与植株再生研究。

结果表明：叶片在MS＋2,4-D 4.0 mg/L＋6-BA 1.0 mg/L培养基上愈伤组织诱导率达到89%。

茎节间在MS＋2,4-D 2.0 mg/L＋6-BA 2.0 mg/L培养基上愈伤组织诱导率为87%。

叶柄在MS＋2,4-D 4.0 mg/L＋6-BA 2.0 mg/L＋IBA 0.2 mg/L培养基上的最高诱导率仅为54%。

愈伤组织分化不定芽的适宜培养基为MS＋6-BA 2.0 mg/L＋TDZ 0.2 mg/L＋NAA 0.2 mg/L;金荞麦不定芽在1/2 MS＋NAA 0.5 mg/L的培养基上生根效果最好。

组培再生植株经炼苗后移栽到田间成活率达80%以上,且生长表现正常。

高频完整再生体系的建立,为金荞麦进一步遗传操作和扩大药材资源奠定了基础。

【总页数】7页(P315-321)【作者】陈彩霞;崔思然;江艳华;李艾莲【作者单位】中国医学科学院,北京协和医学院药用植物研究所,北京100193【正文语种】中文【中图分类】Q943.1【相关文献】1.植物激素对药用植物山丹离体子叶愈伤组织诱导、器官分化及植株再生的影响[J], 胡人伦2.药用植物金荞麦愈伤组织诱导与植株再生 [J], 陈彩霞;崔思然;江艳华;李艾莲3.糜子幼胚愈伤组织的诱导及植株再生 [J], 吴会琴;王娜;黄梦迪;刘蓓蓓;杨璞;高小丽4.矮牵牛梅林愈伤组织诱导与植株再生 [J], 张洁;郑益平;杨成龙;林觅;林智敏5.红花烟草叶片愈伤组织诱导与植株再生 [J], 董行健;余宗波因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

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℃ 1 min，然后经历 22 个循环: 95 ℃ 15 s，68 ℃ 6 min。循环结束后至 4 ℃ 。取 5 μL LD-PCR 产物， 1. 0% 琼脂糖凝胶电泳检测。 3 结果与分析 3. 1 RNA 质量的凝胶电泳及分光光度检测以金荞麦愈伤组织为试材，提取总 RNA，用 0. 8% 的非变性琼脂糖凝胶电泳检测，可见从 4 种金荞麦愈伤组织提取的总 RNA 的 28S rRNA 亮度约为 18S rRNA 的 1. 5 ～ 2. 0 倍，说明提取过程中没有降解现象发生 ( 图 1 ) ，紫外分光光度检测 A260 / A280 在 1. 9 ～ 2. 0，说明 RNA 纯度较高。
［稿件编号］ 20100802002 ［基金项目］农业部野生植物保护项目( 2130135) ; 重庆市自然科学基金项目( CSTC 2005881154) ; 西南大学研究生科技创新基金项目( kb2009016) ［通信作者］ * 李名扬，教授，博士生导师，主要研究方向为植物生物技术，Tel: ( 023 ) 68250086，Fax: ( 023 ) 68251250，E-mail: limy @ swu. edu. cn
图 2 金荞麦红色愈伤 RNA 反转录为 cDNA 电泳
第 36 卷第 6 期 2011 年 3 月
Vol. 36，Issue 6 March，2011
3. 3 其他方法提取的效果作者在大量的前期工作中使用其他多种常规方法提取金荞麦愈伤组织 RNA，不同方法提取金荞麦红色愈伤组织总 RNA 的电泳图对比( 图 3) ，结果表明如异硫氰酸胍法、冷酚法、热酚法等均无法得到较高纯度的金荞麦愈伤组织 RNA 或降解严重，甚至根本得不到 RNA，实验中常用的多种 RNA 提取试剂盒，也无法对金荞麦愈伤组织进行有效提取。而在提取总 RNA 时最常被报道使用的 Trizol 试剂在金荞麦愈伤组织 RNA 提取中也表现不佳，这主要是由于植物组织富含多糖、多酚，经过细胞培养后，糖类和酚类化合物剧增［8］，特别是金荞麦愈伤组织中的多糖多酚含量比其他的植物组织更高。而多糖的许多理化性质与 RNA 相似，很难将它们分开，在沉淀 RNA 时很容易产生多糖的胶状沉淀，难溶于水。同时多糖会抑制许多酶活性［9］。金荞麦还富含一些其他次生代谢产物，尤其富含“原花色素类”化合物，该化合物是一类易氧化的酚类物质，氧化后与 RNA 不可逆的结合，影响 RNA 的分离纯化［10-11］。这些都严重干扰了金荞麦愈伤组织总 RNA 的有效提取。
图 1 金荞麦愈伤组织总 RNA 电泳
3. 2 RNA 的反转录质量 RNA 的反转录质量是检测 RNA 质量的重要指标之一，作者将获得的 RNA 进行反转录，并用 PCR 技术检测其反转录质量，结果表明，RNA 可以被成功反转录，并且反转录的 cDNA 呈现弥散条带，长度范围较广( cDNA 的大小主要分布在 500 bp ～ 5 kb) ，说明 RNA 纯度高要求。
［关键词］金荞麦; 愈伤组织; 总 RNA 提取
金荞麦 Fagopyrum cymosum ( Trev. ) Meisn 是蓼科 Polygonaceae 荞麦属多年生草本植物，是一种营养丰富并具有重要药用价值的资源植物。作为我国重要的传统中药材，金荞麦的块根活性提取物( 主要为类黄酮次生代谢产物) 具有显著的抗癌、抑制肿瘤细胞侵袭和转移，以及消炎抗菌等重要作用，是多种重要的抗癌药物和癌预防药物( 如复方金荞麦颗粒、金荞麦片、和威麦宁胶囊等 ) 的主要成分之一［1-3］。
第 36 卷第 6 期 2011 年 3 月
Vol. 36，Issue 6 March，2011
提取金荞麦愈伤组织总 R李名扬1*
( 1. 西南大学园艺园林学院，重庆市花卉工程技术研究中心，南方山地园艺学教育部重点实验室，重庆 400715; 2. 湖州市农业科学研究院，浙江湖州 313000)
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第 36 卷第 6 期 2011 年 3 月
Vol. 36，Issue 6 March，2011
酯 ( DEPC) 为 Sigma 产品。琼脂糖为 Promega 公司产品。 2 方法 2. 1 金荞麦愈伤组织总 RNA 的提取采用 CTAB 法结合 LiCl 沉淀的方法，在 5 mL RNA 抽提 buffer 加入 2% 终体积的 β-巯基乙醇后，65 ℃ 温育 15 min。取 0. 65 g 愈伤组织放入盛有温育后的 RNA 抽提 buffer 的研钵中，迅速研磨( 不加液氮) 。转移至 10 mL 离心管中振荡，65 ℃ 温育 10 min。加入等体积氯仿-异戊醇抽提 2 次( 离心 10 000 r·min － 1 ，4 ℃ ， 10 min) ( 抽提时在冰上静置 10 min) 。取上清于一新的 10 mL 离心管中，加入 1 /4 体积 10 mol ·L － 1 LiCl 混匀，4 ℃ 过夜。离心( 10 000 r·min － 1 ，4 ℃ ， 20 min) ，弃上清，将沉淀溶于 500 mL 的 RNase-free 的水中，并转移至 1. 5 mL 离心管。加入等体积酸酚 ( pH 4. 2) -氯仿-异戊醇( 25∶ 24∶ 1) 抽提 2 次( 离心 10 000 r· min －1 ，4 ℃ ，10 min) ( 抽提时室温静置 5 min) 。取上清于一个 1. 5 mL 离心管中。加 2 倍体积无水乙醇，－ 70 ℃ 沉淀 30 min。10 000 r·min －1 ，4 ℃ ，离心 15 min 弃上清。加入 70% 乙醇漂洗 1 次。吹干乙醇后，加入 100 mL 的 H2 O( DEPC) ，充分溶解。 2. 2 总 RNA 质量检测提取的总 RNA 纯度用紫外分光光度检测，完整性用 0. 8% 非变性琼脂糖凝胶电泳检测，质量合格的总 RNA － 70 ℃ 保存。 2. 3 RNA 的反转录和 RT-PCR 分析将获得的 RNA 用 DNaseI ( RNA free) 消化，去除 DNA 污染，然后进行反转录与 PCR。具体步骤参照 cDNA 一链合成试剂盒 RevertaidTM First Strand cDNA Synthesis Kit( MBI，K1622) 使用手册进行。第 1 链的合成，在 PCR 反应管中顺次加入 2 μL 总 RNA，1 μL SMARTIV Oligomucleotide，1 μL，CDS III /3’PCR Primer，1 μL DEPC-H2 O，混匀，稍离心，然后于 72 ℃ 保温 2 min，冰浴 2 min 后加入: 2 μL 5 × First-Strand Buffer，1 μL DTT ( 20 mmol·L － 1 ) ，1 μL dNTP Mix ( 10 mmol· L － 1 each) ，1 μL PowerScript Reverse Transcriptase，抽吸混匀，稍离心，于 42 ℃ 下反应 90 min ( PCR 仪中进行) ，冰上终止第 1 链合成。取第 1 链产物 7 μL 依次加入 75 μL Dionized H2 O，10 μL 10 × Advantage 2 PCR Buffer，2 μL 50 × dNTP Mix，2 μL 5'PCR Primer，2 μL CDSⅢ /3'PCR Primer，2 μL 50 × Advantage 2 Polymerase Mix，置于 PCR 仪上，采用长距离 PCR 技术扩增双链cDNA。反应条件为 95
·L － 1 的 NaAc，简化了配制提取试剂的程序，排除了 NaAc 溶液引入 RNA 酶的可能性，减少了 RNA 降解机率，达到了良好的效果。
图 3 不同方法提取金荞麦红色愈伤总 RNA 电泳
4 讨论本实验方法的最大特点就是将材料直接加入到
RNA 抽提液中进行研磨。这样做有 2 个优点。首先，从培养皿中取出的新鲜愈伤组织含有大量的水分，如果直接加液氮研磨会很快结冰，影响研磨的效果，甚至无法研磨。其次，就是将材料直接加入到 RNA 抽提液中，减少材料在空气中暴露的时间，从而最大限度地减少 RNA 被降解和酚类被氧化的可能性。另外在用乙醇沉淀 RNA 时，没有加入 3 mol
蛋白质合成的角度对金荞麦不同愈伤组织类黄酮含量差异形成的原因进行探索，以期为进一步的悬浮培养提供指导，因此首先需要获得高质量的 RNA。目前尚未见有关于金荞麦愈伤组织 RNA 提取的报道，作者试用多种方法提取金荞麦愈伤组织 RNA 效果不理想。而本实验采用的 CTAB 法结合 LiCl 沉淀的改良方法从金荞麦愈伤组织提取的 RNA 可以满足多种分子生物学研究的需要，为进一步的研究提供了快速、高效、高质量的 RNA 提取方法，也为同类研究提供了参考。 1 材料
［摘要］目的: 建立金荞麦愈伤组织总 RNA 提取方法。方法: 采用 CTAB 法结合 LiCl 沉淀的改良方法提取 RNA，紫外分光光度检测、0. 8% 非变性琼脂糖凝胶电泳检测、RNA 的反转录等评价 RNA 质量。结果: 提取的总 RNA 28S 和 18S 条带清晰，且 A260 / A280 在 1. 9 ～ 2. 0，以提取的 RNA 为模板反转录的 cDNA 长度范围较广( 500 bp ～ 5 kb) 。结论: 该方法提取出的总 RNA 质量能满足 RT-PCR 等分子生物学操作的要求，且简单、有效、经济，可用于金荞麦愈伤组织总 RNA 的提取。
本实验室诱导筛选的金荞麦白色、浅黄色、褐色、红色愈伤组织系。
RNA 提取所有塑料器具，如 1. 5，0. 2 mL 离心管，1，0. 2，0. 01 mL 吸头等用 0. 1% DEPC 超纯水浸泡过夜，121 ℃ 湿热灭菌 15 min，弃去液体，放入 37 ℃ 烘箱中干燥备用。研钵和杵子及其他玻璃用具用洗涤剂清洗干净，蒸馏水冲洗，晾干后在 180 ℃ 烘箱中烘烤过夜备用。RNA 抽提缓冲液配方如下: 2% CTAB，2% PVP，100 mmol · L － 1 Tris-HCl ( pH 8. 0) ，25 mmol·L － 1 sodium-EDTA ( pH 8. 0) ，2. 0 mmol·L － 1 NaCl 混匀灭菌。用前加入终体积为 2% 的 β-巯基乙醇。氯仿-异戊醇 ( 24 ∶ 1 ) ; 酸酚 ( pH 4. 2) ; 10 mol·L － 1 LiCl; 无水乙醇。以上试剂均为分析纯，购自上海生工生物合成公司。cDNA 一链合成试剂盒 RevertaidTM First Strand cDNA Synthesis Kit ( MBI，K1622) 购自深圳晶美公司，焦炭酸二乙