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人的外周血淋巴细胞培养及染色体制片方法、染色体组型分析一、实验背景1、Carnoy固定液：固定液的重要特性是能迅速穿透细胞，将其固定并维持染色体结构的完整性，还要能够增强染色体的嗜碱性，达到优良染色效果。
单纯的固定液一般难以达到这些要求，因此在实验中使用两种混合的固定液。
由于Carnoy首先使用的甲醇和冰乙酸混合液而称其为卡诺氏固定液。
Carnoy固定液（甲醇∶冰乙酸=3∶1）每次使用前需临时配制，长时间放置影响固定效果，固定时间15min至24h，冰箱、室温均可。
必要时可改变甲醇和冰乙酸的比例，冰乙酸比例增加，利于细胞膨胀、染色体铺展，但易导致细胞破裂、染色体散失。
2、低渗液（hypotonic solution）低渗液是指渗透压和离子强度均低于正常细胞生理条件的溶液，渗透压低于组织液，与外周血混在一起时，水分迅速进入细胞，使其膨胀，甚至破裂，获得分散良好的染色体分裂象。
常见的低渗液：水、低渗的柠檬酸钠或氯化钠、甘油磷酸钾（0.65mol/L）、氯化钾（0.075mol/L）等。
低渗效果取决于低渗液的化学组成、低渗的温度和处理时间。
低渗处理是凭借反渗透作用使细胞膨胀染色体铺展，同时可使黏附于染色体的核仁物质散开，以便能在一个平面上观察所有染色体形态。
实验室中一般选用0.075mol/L KCl为低渗液，其优点有：①染色体轮廓清楚，可染色性强，染色时间短。
②用于显带染色时能充分显示带型特点。
低渗处理为37℃，25～30min，以预实验条件为准。
2、肝素N-硫酸和艾杜糖醛酸含量较多的一种糖胺聚糖，由D-β-葡糖醛酸(或L-α-艾杜糖醛酸)和N-乙酰氨基葡糖形成重复二糖单位组成的多糖。
肝素是一种抗凝剂，是由二种多糖交替连接而成的多聚体，在体内外都有抗凝血作用。
2、PHA植物血凝素(Phytohaemagglutinin)是一种有丝分裂原，主要用于激活免疫细胞—淋巴细胞。
是一种干扰素诱导剂，不仅可以刺激机体产生白介素-2和干扰素；还可以刺激机体产生非特异性抗体。
实验一花粉生命力测定目的在经过一段时间储藏的花粉或使用远地花粉时,则必须测定,便于杂交成果的分析与研究。
通过实验, 要求学生掌握花粉生命力测定的方法。
药品及用具测微尺、显微镜、毛笔、载玻片、盖玻片、恒温箱、玻璃铅笔、蔗糖、蒸馏水、硼酸液、联苯胺、苯酚、酒精、碳酸钠、过氧化氢、琼脂。
方法步骤1、方法可分三类: 间接法、直接法、染色法。
2、直接法（1）原理（2）将花粉直接在清洁的同种植物的柱头上, 并且作好隔离工作, 然后观察其雌花之发育, 如果胚珠能够正常发育成种子, 则说明花粉具有生命力,否则, 就没有生命力。
（3）步骤第一步: 将花粉直接授在清洁的同种另一植株花的柱头上, 并作好隔离。
隔1--3天采集已授过粉的柱头, 固定于开水或F.A.A液中。
第二步：染色剂的配置:配置1%苯胺兰溶液、配置0.5%苯胺兰乳酸酚。
A．染色镜检3、花柱固定在开水中, 并于水中煮烂, 而后放在1%苯胺兰水溶液或0.5%苯胺兰乳酚中染色24小时,把花柱撕开,盖上盖玻片,用大姆指轻压。
镜检,若花粉具有生命力,即可观察到花粉管伸入柱头组织,若花粉不具生命力,即无花粉管伸入柱头组织.4、间接法（1）原理（2）借人为创造的特定条件使花粉萌发, 鉴定花粉生命力。
（3）硼酸液培养法配置10、50PPM的硼酸溶液。
用毛笔取少量花粉播入已盛硼酸的清洁小瓶并加盖, 放入恒温箱内培养。
5、取出小瓶充分摇动均匀, 用吸管吸一滴于载玻片凹槽内, 迅速盖上盖玻片固定花粉粒, 然后至于显微镜下观察。
6、观察2-----4个载玻片, 每凹面随机观察5个视野计算发芽率。
7、染色法过氧化物酶测定法（1）原理（2）这是借助于测定花粉内过氧化氢酶活性强弱来确定花粉生命力的方法, 在活的花粉内过氧化氢酶存在, 它可以促进过氧化物放氧分解, 这些刚被放出来的活性氧容易使还原剂氧化, 在本实验中所用的无色的联苯胺和苯酚都是还原剂, 但它们被氧化后确表现红色或玫瑰红色, 如果花粉是活的, 那么这个反应很快, 则花粉都被染成红色或玫瑰红色, 如果花粉是死的, 则这一反应迟迟不能进行, 花粉也就保持原色。
一、实验目的1. 掌握永久制片的基本原理和方法。
2. 学会使用石蜡切片法制作永久制片。
3. 观察并分析永久制片的结构和特点。
二、实验原理永久制片是指通过特定的方法将生物组织或细胞制成可以长期保存的切片。
石蜡切片法是常用的永久制片方法之一，其原理是利用石蜡的高熔点和低溶解度，将组织固定在石蜡中，从而实现长期保存。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：洋葱鳞片叶、显微镜、石蜡、酒精、二甲苯、苏木精染液、盐酸酒精溶液、蒸馏水、吸水纸、剪刀、镊子等。
2. 实验仪器：切片机、烤箱、显微镜、显微镜载物台、显微镜显微镜物镜、显微镜目镜等。
四、实验步骤1. 准备材料：取洋葱鳞片叶，用剪刀剪成薄片，放入装有酒精的烧杯中浸泡。
2. 固定：将浸泡好的洋葱鳞片叶取出，用镊子夹住，放入装有石蜡的烧杯中，浸泡一段时间，使洋葱鳞片叶固定在石蜡中。
3. 制片：将固定好的洋葱鳞片叶取出，用镊子夹住，放在切片机上，进行切片。
切片厚度为5-10微米。
4. 清洗：将切片放入盐酸酒精溶液中浸泡，去除多余的石蜡。
5. 染色：将清洗好的切片放入苏木精染液中染色，染色时间为5-10分钟。
6. 水洗：将染色好的切片取出，放入蒸馏水中清洗，去除多余的染液。
7. 脱水：将清洗好的切片依次放入50%、70%、90%、100%的酒精溶液中脱水。
8. 透明：将脱水后的切片放入二甲苯中透明，使切片透明。
9. 装片：将透明好的切片用吸水纸吸去多余二甲苯，放入显微镜载物台上，用显微镜观察。
五、实验结果与分析1. 观察到洋葱鳞片叶的细胞结构，包括细胞壁、细胞质、细胞核等。
2. 细胞壁呈不规则的长方形，细胞质为半透明状，细胞核呈圆形或椭圆形，位于细胞中央。
3. 制成的永久制片具有以下特点：切片厚度均匀，细胞结构清晰，染色均匀，透明度好。
六、实验总结通过本次实验，我们掌握了永久制片的基本原理和方法，学会了使用石蜡切片法制作永久制片。
实验过程中，我们观察到洋葱鳞片叶的细胞结构，了解了细胞壁、细胞质、细胞核等部分的特点。
植物染色体制片方法的改进作者：肖春林来源：《新疆农垦科技》 2016年第3期肖春林（兵团第六师农业科学研究所，新疆五家渠831300）收稿日期：２０16—01—11摘要：以普通小麦（2n=6x=42）为材料，对其种子进行发根，取其根尖分生区进行酶解法染色体制片。
对比常规压片和去壁低渗火焰干燥法制片技术，酶解法制片技术易获得更好的分裂相，分布更加均匀的染色体片，更有利于后期的原位杂交进行信号标记实验。
关键词：小麦；根尖分生区；染色体制片植物染色体制片技术是植物细胞遗传学、染色体工程、植物细胞生物学、植物细胞分类学和物种生物学等众多学科的基本实验技术[1]。
对于染色体形态、结构、遗传行为及细胞变异等遗传学现象的分析，可以大大提高作物育种工作的效率和质量。
因此，改善并提高染色体制片技术显得尤为重要。
目前常用的染色体制片技术有2种，即普通压片技术和去壁低渗火焰干燥技术。
前者虽然操作简单实用，但是需要制片者取材时间适宜，压片力量适中，对操作者的熟练程度要求较高；且处理一些细胞壁坚硬、难以软化的材料时，也不易获得良好的制片[2-3]。
后者相比前者，需要的制片经验较少，且制片效果较好，但操作过程涉及酒精灯，需要火焰干燥和盖玻片压片，对染色体造成部分影响。
酶解法在两者技术的基础上，对部分实验操作进行了改善，不仅可以得到分散良好的有丝分裂中期分裂相，而且还缩短了酶解的时间,提高了制片的效率，从而获得更好的染色体制片，为细胞学观察及相关的原位杂交（GISH）实验做准备。
1材料与方法1.1材料来源市场购买的普通小麦种子。
1.2材料制备1.2.1冷处理将普通小麦种子置于装有湿润滤纸的培养皿内，小麦腹沟朝下贴在滤纸上，于4℃冰箱冷处理24h。
1.2.2发根、剪根冷处理的种子放入25℃培养箱中培养24h以上，待根尖长至2~3cm时剪下。
1.2.3预处理湿润根尖装于2mLEP管中，笑气处理2h左右。
1.2.4固定、保存预处理的根尖用90%冰醋酸浸泡3~5min后转入70%酒精中，4℃冰箱保存。
|首页|课程申报书|教学大纲|授课教案|参考书目|网络课程|习题|教学录像|发表论文|资源库|(六)植物细胞有丝分裂一、实验目的(1) 学习和掌握植物根尖细胞压片技术。
(2) 观察植物细胞有丝分裂过程中染色体的形态特征和动态变化。
二、实验原理有丝分裂是植物细胞增殖的主要方式，在有丝分裂过程中，细胞核内的染色体能准确地复制，并能有规律地均匀分配到两个子细胞中去，使子细胞遗传组成与母细胞完全一样。
从而可推断生物性状的遗传与染色体的准确复制和均等分配有关，支配生物性状的遗传物质主要存在于细胞核内的染色体上。
高等植物有丝分裂主要发生在根尖、茎生长点及幼叶等部位的分生组织，根尖取材容易，操作和鉴定方便。
通过对根尖的固定、染色和压片，可在显微镜下观察到大量处于有丝分裂各个时期的细胞和染色体，看到染色体的变化特点和染色体的形态特征，进行染色体计数。
为了获得更多的中期染色体图像，可以采用药物处理或冷冻处理的方法，阻止纺锤体的形成，使细胞分裂停止在中期，同时还可以使染色体缩短，易于分散，便于观察研究。
另外，通过对细胞组织进行酸性水解或酸处理除去细胞之间的果胶层，并使细胞软化，便于细胞彼此分开，有利于压片和染色。
三、实验材料小麦( Triticum Spp ．) 、玉米( Zea mays ) 、大蒜( Aillumsativum ) 、洋葱(Aillum cepa ) 、蚕豆(Vicia faba ) 等。
四、实验器具和药品1 ．器具冰箱，恒温箱，显微镜，水浴锅、分析天平、扭力天平、电炉、温度计、剪刀、镊子、刀片、量筒、量杯、三角瓶、烧杯、漏斗、培养皿、酒精灯、滴瓶、载玻片、盖玻片、滤纸、标签、胶水等。
2 ．药品无水酒精、95 ％酒精、70 ％酒精、45 ％酒精、0.5 ％醋酸洋红、0.5 ％苏木精液、4 ％铁明矾液、苯酚，亚硫酸、二甲苯、秋水仙素、对二氯苯、8- 羟基喹啉、α－溴萘、lmol/L 盐酸、25 ％纤维素酶和 2.5 ％果胶酶混合液、加拿大树胶等。
实验3、植物染色体标本制备及核型分析目前，国内外常用的植物染色体制片技术可以分为两种，即压片技术和去壁低渗技术。
Belling(1921)提出植物染色体压片技术后，压片已成为植物染色体研究中最广泛应用的常规技术；但是由于植物细胞有坚实的细胞壁，染色体很难象动物染色体那样平整地贴在载玻片上，Omura 和Kurata(1978)把植物原生质体技术应用到水稻染色体研究之中，用纤维素酶、果胶酶和0.075mol.L-1氯化钾处理取得了一定的进展，陈瑞阳等人（1979、1982）提出了植物染色体标本制备的酶解去壁低渗技术，并在多种植物上得到广泛应用，成为当今植物染色体研究中的重要方法。
压片技术和去壁低渗技术在取材和预处理要求及其操作都是相同的，即两者的材料基础条件是相同的，但它们所采用的染色体分散方法是不同的。
压片法是以人工外加机械压力使染色体分散，而去壁低渗法是用酶分解细胞壁，低渗液使细胞膜吸胀、水表面张力使染色体分开。
两种技术各有其优缺点，前者操作快速简便、省材省时，后者染色体易于展开、且真实不变形，尤其是对成熟细胞多的植物组织，如芽、愈伤组织等材料有独到效果，本实验主要介绍去壁低渗染色体制片技术。
一、实验目的1、掌握植物根尖、茎尖及叶片去壁低渗染色体制片技术，通过3周开放性实验教学，进行植物染色体制片技能训练；2、掌握植物染色体显微照象技术及组型分析技术，通过大量的制片观察，能获得图象清晰、完整、高度分散的染色体典型制片；通过显微摄影，获得某植物染色体自然核型图，并能用国内外通用的植物核型分析标准，确定该植物染色体模型图、核式公式及类型；3、掌握植物有丝分裂制片技术，通过大量的制片观察，能比较快速准确地判断细胞有丝分裂前、中、后、末期的染色体图象，并对其典型制片照像，收集核型分析及有丝分裂过程观察的染色体制片素材；4、结合实验，对某一新资源植物进行染色体组型分析，获得该物种染色体组型公式、类型、核型图及核型模式图。
永久制片观察实验报告本实验旨在研究永久制片的制备方法和性能，并通过实际观察观察到制片过程中的变化和效果，以便更好地理解永久制片的特性。
实验原理：永久制片是在化学原理基础上制造的一种材料，其主要原料是氧化铝。
其制备过程主要包括溶解、悬浮、浸渍、烘干和固化等步骤。
实验步骤：1. 首先准备好氧化铝和溶液。
将一定量的氧化铝加入适量的水中，搅拌均匀。
然后将溶液加热至沸腾，保持溶液的温度在40-50摄氏度之间。
2. 将制作好的溶液倒入一个容器中，然后将待制片的基片放入溶液中，保持一段时间，使其能够充分浸渍溶液中。
3. 取出基片，将其表面的溶液悬浮物用水冲洗掉，然后放在通风良好的地方进行自然干燥。
4. 干燥后将基片放入烘箱中，以一定温度和时间进行烘干。
烘干后，基片会变得更加坚硬，使其能够更好地承受后续固化过程中的压力。
5. 固化是制作永久制片的最后一步。
将烘干后的基片放入高温下，使其固化。
在这个过程中，化学反应会进一步加强基片的硬度和耐腐蚀性。
实验结果：通过以上制片过程，我观察到一系列的变化和效果。
首先，在制备溶液的过程中，氧化铝均匀地溶解在水中，形成了均匀的溶液。
然后，在浸渍基片的过程中，基片表面逐渐被氧化铝溶液覆盖，形成了一层均匀的涂层。
在烘干的过程中，观察到基片表面的涂层逐渐变得干燥，并且增加了一些硬度。
最后，在固化的过程中，经过高温处理后，观察到涂层变得非常坚硬和耐腐蚀。
实验结论：通过永久制片的制备实验，我得出了一些结论。
首先，永久制片的制备方法较为简单，只需要一些基本的操作技巧和器材即可。
其次，制备过程中的每个步骤都起到了关键作用，对最终制片的质量和性能有着重要影响。
最后，永久制片具有较好的耐腐蚀性和硬度，可应用于各种材料的表面处理和保护。
实验改进：在实验过程中，我观察到了一些潜在的改进点。
首先，溶液的浓度和温度对制片的性能有一定影响，可以尝试调整这些参数，以优化制片结果。
其次，烘干和固化的温度和时间也可以有所调整，以获得更理想的制片效果。
染色体片子保存制度一、存储条件染色体片子的存储环境需要满足以下条件：1. 温度：应保持在18-24°C之间，以确保染色体的稳定性。
2. 湿度：相对湿度应保持在40%-60%之间，以防止片子受潮和干燥。
3. 光照：避光保存，以避免紫外线对染色体的损害。
二、存储容器染色体片子应存放在专用的存储容器中，以保护片子免受物理损害和污染。
存储容器应满足以下条件：1. 材质：应采用高强度、耐腐蚀、防紫外线的材料，如聚乙烯或玻璃。
2. 规格：应根据染色体片子的尺寸和数量选择适当的容器，以确保足够的空间和空气流通。
3. 标签：每个容器应贴有标签，标明存储的染色体片子的编号、种类、数量等信息。
三、存储时间染色体片子的存储时间应根据其种类和使用需求而定。
一般情况下，长期保存的染色体片子应每五年进行一次复检，以确保其质量和稳定性。
如发现片子出现异常或老化迹象，应及时处理并更新。
四、定期检查为确保染色体片子的质量和安全性，应定期进行以下检查：1. 检查频率：至少每五年进行一次全面检查。
2. 检查内容：检查染色体片子的质量、稳定性、安全性等方面。
3. 检查方法：采用专业的检测仪器和检测方法，如光谱分析、显微镜检查等。
五、备份与复制为确保染色体片子的可靠性和永久性保存，应进行备份和复制。
以下是备份和复制的相关信息：1. 需求分析：根据染色体片子的重要性和使用需求，确定备份和复制的必要性。
2. 备份策略：制定合理的备份策略，包括备份时间、备份位置、备份方式等。
3. 备份介质：可选择硬盘、光盘、云存储等可靠的存储介质进行备份和复制。
六、清理与废弃染色体片子的清理和废弃应按照以下步骤进行：1. 垃圾分类：根据染色体片子的状况将其分为可回收和不可回收垃圾。
2. 清理周期：根据实际情况确定清理周期，一般可设定为一年或两年。
3. 废弃流程：对于无法再利用的染色体片子，应进行安全废弃，如通过专业的废弃公司进行处理。
七、使用记录为了更好地跟踪和管理染色体片子的使用情况，应建立使用记录制度，记录内容包括以下方面：1. 使用时间：记录染色体片子的使用时间，包括开始时间和结束时间。
实验一植物染色体压片技术一、实验原理:植物染色体压片技术是利用化学或物理的方法,将具有分裂能力的细胞保持原有的分裂状态,并对其染色体进行染色,压片后观察它的染色体分裂的一种方法。
二、实验目的:植物染色体压片技术是细胞遗传学和细胞分类学等研究中应用最为普遍的基本技术,是其他新技术所不能完全取代的,是从事染色体研究的工作者首先应该掌握的一项基本的实验方法。
三、材料的制备:黑麦根尖(2n=14根尖材料的制备:1.浸泡:大、油、壳→浸泡24h(23~25℃;小、裸的不浸泡。
2. 发根:将材料放入具有团粒结构条件的土壤中培养(锯木屑、土壤、砾石、麦杆、谷草;最适温度(23~32℃;培养24h→再放入0~4℃冰处理1~7天。
目的:(1使分裂速度减慢,根尖长度整齐一致;(2调节工作时间。
再将材料从冰箱中取出又放回最适温度条件下培养1~2天;待根尖长度为1.5~2Cm即可处理。
3. 愈伤材料的制备:(适合春、夏两季用刀片将树杆割去保护组织露出伤口,用75﹪乙醇消毒包裹一天,再用50~75ppm赤霉素处理;几天后长出白色幼嫩的愈伤组织即可固定。
四、预处理:1. 方法:(化学和物理两种(1 化学方法:(适合所有生物a. 秋水仙素0.05~0.2﹪(白色粉末,易溶于水的巨毒药品;b. 0.002M 8-羟基喹啉(淡黄色晶体,用少量的乙醇溶解再稀释,对禾本科植物的随体表现很清楚;C.а-溴萘饱和液(淡黄色的乳浊液,易溶于乙醇和苯;难溶于水,100ml水中倒入1~2滴剧烈的振动5分钟;(以上abc三种药剂在15~18℃温度下处理3~5hd. 对二氯苯饱和液(淡黄色的晶体,难溶于水;具有强烈的腐蚀性,只能处理1~1.5h。
(2 物理方法:(适合禾本科作物,本次实验所采用冰水混合物在0~4℃温度下处理24h。
预处理的目的破坏或抑制纺锤体形成;增加中期图象,改变细胞质的粘度,使染色体缩短变粗,易于染色体的显带及研究。
五、固定:卡诺氏Ⅰ 3︰1 (乙醇︰醋酸;卡诺氏Ⅱ 6︰3︰1 (5︰3︰2(乙醇︰氯仿︰醋酸;固定的目的利用药剂迅速杀死正在分裂的细胞,使之保持细胞中的染色体处于被固定前的原有状态。
