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细胞悬液置于离心管底部。
离心管横放，将PBS滴加在靠近管口的管壁上。
再将CFSE加在PBS滴上。
维持离心管横向水平，拧上管盖，迅速垂直倒置离心管于涡旋器上涡旋。
（可参考JOVE网上的CFSE标记视频）
步骤：
1. 常规方法分离PBMC，细胞计数后300g离心10分钟。
弃上清，加入1%FBS/PBS液体重悬，洗涤一次，再用合适体积数目的1%FBS/PBS重悬，取出2×10^6l的细胞悬液，离心弃上清。
2. 用0.1%FBS/PBS稀释CFSE储存液(5000×,5mM)至1umol/L。
3. 用0.5ml上述CFSE稀释液重悬细胞，轻柔混匀。
4. 37 ℃放置10min。
5. 加入1ml冰冷的RPMI 1640 完全培养液，4℃，5分钟以中止染色。
6. 300g室温离心5分钟。
弃上清，加入冰冷的含10%FBS 的完全1640培养液洗2次。
最后用0.4ml 培养基重悬。
7. 将上述细胞悬液加入96孔培养板,每孔105个细胞,（阳性对照用PHA刺激（1ug/ml））
8. 37 ℃, 5％CO2 避光培养3天。
9. 吸出培养液，24小时内上机检测。
（7AAD排除死细胞）
17. 在FACScalibur流式细胞仪上检测,用Cell Quest软件获取数据,然后用软件分析。
体内CTL方法
1．将1 mg CFSE（MW 557.46）溶解于358.77 ul DMSO中，制备成5mM的储存液，分装成20ul/管，置于－20℃保存；
2．取naïve 小鼠脾细胞，以含2％胎牛血清的Hank液将PBMC按2×107细胞/ml重悬，将脾细胞分成2等份，分别用等体积低浓度的CFSE（1.0uM）和高浓度的CFSE（10uM）染色，37℃避光轻摇染色10min；
（注：染色液迅速往细胞内加，使细胞同时染上色）
3．用等体积的胎牛血清终止反应，1000rpm离心5min，弃上清，用含2％胎牛血清的Hank液洗2次，计数；
4．以2×107/ml重悬于含2％胎牛血清的Hank液中，高浓度的CFSE（10uM）染色的细胞进行肽（1-10ug/ml）孵育，低浓度的CFSE（1.0uM）染色的细胞不进行肽孵育，37℃ 5％CO2培养4小时；
5．将细胞转入15ml离心管中，1000rpm离心5min，弃上清，洗细胞2－3次；6．将低浓度和高浓度CFSE染色的靶细胞等体积混合，按每只小鼠1×107细胞/100ul由眼底毛细血管注射到实验小鼠体内，进行体内细胞杀伤反应；7．杀伤15小时（或更长时间，根据试验决定）后，处死实验小鼠，避光分离得到脾细胞，筛网过滤后转入FACS专用管中，准备进行仪器检测和分析；8．杀伤率＝【1－（试验组的比率/naïve的比率）】×100，
比率＝percentage CFSE high/percentage CFSE low。
1。
小鼠脾脏单个核细胞分离及细胞计数实验时间：实验地点：实验人：1实验原理小鼠脾脏位于上腹部左后侧，体积较大，长条形，属于外周免疫器官。
外周血中淋巴细胞可经再循环驻如脾脏等外周免疫器官的特定区域，所以富含各类免疫细胞。
免疫细胞的分离：采用红细胞裂解法，是根据细胞对渗透压变化的敏感度。
红细胞由于细胞结构较为简单，仅有细胞膜结构，对于膨胀的耐受能力较差，因此绝大部分就会涨破，受到破坏。
是一种比较温和的去除红细胞最简便易行的方法。
2实验材料：1)健康小鼠2)手术器械（剪刀、镊子）、解剖板3)70%乙醇4)PBS缓冲液、红细胞裂解液（ACK）5)0.2%台盼蓝6)细胞计数板、计数器7)离心机8)显微镜3实验方法：3.1取小鼠脾脏●将小鼠颈椎脱位处死，用酒精消毒。
●用剪刀剪开背部皮肤，再找到脾脏，用镊子夹出脾脏并剪除周围组织。
3.2制备单个核细胞悬液●将取出的脾脏置于盛有3mlPBS缓冲液的平皿中，然后再置于尼龙指套中，用针芯轻轻碾压使得单个核细胞悬浮于平皿中。
●吸取平皿中细胞悬液置于刻度离心管（15ml）中，以1500rpm离心10min，弃去上清液，加入ASK至2-3ml，轻轻吹打混匀并放置2min，以破坏红细胞。
然后加入PBS缓冲液至10ml，以1500rpm离心10min。
●弃去上清液，用PBS缓冲液定容至2ml，吹打混匀即为小鼠脾脏单个核细胞悬液。
3.3计算细胞浓度稀释十倍，随机选取一个大方格计数细胞计数为324个，计算细胞浓度为324×104×10=3.24×107/ml3.4计算细胞活力在总计为324个细胞中计数，死亡细胞有16个，计算细胞活力为：324-16/324×100%=95.1%在理论范围之内4实验结果4.1研磨脾脏得到细胞悬液本实验中将小鼠的脾脏放入尼龙指套内，置于少量PBS液中缓慢研磨，获得细胞悬液。
实验中，我们发现尼龙指套不能滤去所有结缔组织，操作中会有结为絮状团块的结缔组织。
小鼠脾细胞分离+CFSE染色步骤小鼠脾脏淋巴细胞分离与CFSE染色步骤实验材料：小鼠1只、组织剪1把、镊子2把、75%酒精、小鼠固定板、1640培养液（10%FBS，1%双抗）、含0.1%FBS的PBS溶液（无菌）、PBS溶液（无菌）、ACK溶液（无菌）、移液管、枪头、组织研磨棒（无菌）、12孔细胞培养板、15mL离心管、300目尼龙网（无菌），细胞计数板，手术台布。
实验前准备工作：做好上述实验器具的灭菌工作；将手术台布裹在小鼠固定板上，喷75%酒精，组织剪和镊子用75%酒精浸泡后置于生物安全柜中紫外照射30min；实验步骤：1. 取一只6-8周小鼠颈椎脱臼处死后，将其全部浸泡于75%酒精中5min。
2. 取出小鼠将其固定于固定板上，用组织剪和镊子沿小鼠腹白线剪开腹腔，拨开小肠在腹腔左上方紧贴小肠部位取褐红色长条型脾脏，用组织剪剪开筋膜同时不要把脾脏剪破，将取下的脾脏用PBS冲洗两遍，剪去脾脏上连接的结缔组织。
3. 将脾脏转移入组织研磨棒中，向其中加入2mLPBS溶液后研磨三下，尽量不残留较大组织块；再用3ml PBS冲洗研磨棒后，将脾脏研磨液经300目尼龙网过滤至15mL离心管中，再用2ml PBS冲洗研磨器内壁，同样过滤至15mL离心管中，离心500g，5min。
4. 弃上清后，加入2mL 常温ACK，轻微吹打，裂解红细胞1min 后加入等体积（2mL）PBS 终止裂解，轻微吹打细胞混匀后离心500g，5min。
CFSE染色开始：5. 弃上清，用4ml PBS（0.1%FBS）重新混匀细胞，反复吹打为单细胞悬液，再用300目尼龙网过滤。
取10μL细胞液于细胞计数板上计数，并将细胞浓度调至1.0×107/ml。
6. 提前将CFSE按照说明书配成5mM母液并2ul分装储存于-80冰箱备用，其工作浓度为0.5-25μM.7. 分出一部分细胞加入24孔板中，用于做CFSE空白对照8. 2μlCFSE + 6ml浓度1.0×107/ml的细胞，工作浓度约为1.67μM，37℃，10min，避光。
C F S E细胞增殖实验集团标准化工作小组 #Q8QGGQT-GX8G08Q8-GNQGJ8-MHHGN#准备：1.20ml 预冷5%FBS(HI)-PBS2.50ml 预冷MACS buffer3.70um滤网4. RBC lysis5.LS column6.50ml 37度预热PBS7.50ml 37度预热complete culture medium(RPMI 1640 +10% Heat InactivatedFBS+10 mM HEPES+1 mM penicilline streptomycin+ 50 mM 2-mercaptoethanol)（一）CD3抗体包被取96孔板每孔加入100ul 10ug/mlanti-CD3抗体（PBS）密封4度过夜。
（二）淋巴细胞获取1.小鼠的脾脏结摘取于10ml 冷5%FBS-PBS中。
2.于70um滤网研磨滤过，500g 4度 5min离心后弃上清。
3. RBC lysis裂红5 min，10ml 冷5% PBS终止。
4.500g 4度 5min 离心后弃上清，10mlMACS buffer重悬，计数。
留取105个细胞进行FACS。
（三）磁珠分选nave CD8a+ T细胞cell suspension at 300×g for 10 minutes. Aspirate supernatant completely.cell pellet in 400 μL of MACS buffer per 108 total cells.100 μL of Naive CD8a+ T Cell Biotin-Antibody Cocktail per 108 total cells.well and incubate for 5 minutes in the refrigerator (28 °C).5.Add 200 μL of MACS buffer per 108 total cells.6.Add 200 μL of Anti-Biotin MicroBeads per 108total cells. Add 100 μL of CD44 MicroBeads per 108 total cells.7.Mix well and incubate for an additional 10 minutes in the refrigerator (28 °C).8.Wash cells by adding 10ml of MACS buffer per 108 cells and centrifuge at 300×g for 10 minutes. Aspirate supernatant completely.9.Resuspend up to 108cells in 500 μL of MACS buffer.10.Place LS column in the magnetic field of a suitable MACS Separator.11. Prepare column by rinsing with 3 mL of MACS buffer.12.Apply cell suspension onto the column. Collect flow-through containingunlabeled cells, representing the enriched naive CD8a+ T cell fraction. 13.Wash column with 3 mL of MACS buffer. Collect unlabeled cells that passthrough, representing the enriched naive CD8a+ T cells, and combine with the flow-through from step 3.14.Determine cell number. 留取105个细胞进行FACS。
一、实验目的1. 学习掌握脾细胞提取的基本原理和方法。
2. 熟悉无菌操作流程，提高实验操作技能。
3. 了解脾细胞在免疫学研究中的应用。
二、实验原理脾脏是人体重要的免疫器官，其中含有丰富的免疫细胞，如B淋巴细胞、T淋巴细胞、巨噬细胞等。
脾细胞提取实验旨在从脾脏中获取这些免疫细胞，为后续的免疫学研究和实验提供材料。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：成年小鼠、胰蛋白酶、Hanks平衡盐溶液（HBSS）、FBS、离心管、吸管、解剖显微镜、手术刀、镊子、剪刀、无菌操作台等。
2. 实验仪器：细胞培养箱、低温离心机、细胞计数仪、显微镜等。
四、实验步骤1. 小鼠麻醉与解剖- 将小鼠置于解剖显微镜下，用麻醉剂将其麻醉。
- 小心切开小鼠腹部皮肤，暴露脾脏。
- 使用手术刀将脾脏从体内取出。
2. 脾细胞制备- 将脾脏置于Hanks平衡盐溶液中，轻轻漂洗去除杂质。
- 使用剪刀将脾脏剪成小块，放入装有胰蛋白酶的离心管中。
- 将离心管置于37℃水浴中消化10-15分钟，期间轻轻摇动。
- 停止消化后，用吸管将消化后的脾细胞悬液转移至新的离心管中。
- 1000g离心5分钟，弃去上清液。
- 加入适量的FBS，重悬细胞，制成脾细胞悬液。
3. 细胞计数与纯度鉴定- 使用细胞计数仪对脾细胞悬液进行计数，计算细胞总数。
- 取少量脾细胞悬液，进行染色（如台盼蓝染色），在显微镜下观察细胞活力和纯度。
4. 细胞培养- 将脾细胞悬液接种于细胞培养瓶中，放入细胞培养箱中培养。
- 定期观察细胞生长情况，记录细胞生长曲线。
五、实验结果1. 脾细胞悬液经离心后，上清液清亮，细胞沉底。
2. 细胞计数仪显示细胞总数为1.5×10^7个。
3. 台盼蓝染色结果显示细胞活力约为90%。
4. 细胞培养过程中，细胞生长良好，呈典型的淋巴细胞形态。
六、实验讨论1. 脾细胞提取实验过程中，无菌操作至关重要，应严格遵循无菌操作规程。
2. 胰蛋白酶消化脾细胞时，消化时间不宜过长，以免损伤细胞。
小鼠全脾分离及淋巴细胞的获取实验步骤：1.杀鼠：将小鼠颈椎脱臼处死，70%酒精喷涂表面，无菌条件下剖开小鼠腹腔2.分离全脾：取脾，横切约1mm厚放入固定液，作为组化样本，其余组织放入1ml 5% FCS 1640.3.脾淋巴细胞的分离：1)脾脏处理：将脾脏置于200目滤网上，用5mL注射器内芯轻轻研磨，不断向组织上滴加2ml 5% FCS 1640，直至组织内绝大部分细胞被分离，1ml注射器抽吸滤过，将细胞收集于5ml离心管中。
.2)500g，3min，弃上清。
3)红细胞裂解：加入1ml 红细胞裂解液，轻轻吹打混匀，室温裂解2分钟至红细胞完全破碎。
4)500g，5min，弃上清。
5)洗涤1次：加入1ml 5% FCS 1640，重悬沉淀，500g，3分钟，弃上清。
加入1mL 10% FCS1640重悬，取出15μL计数；6)台盼蓝染色细胞计数：1:20稀释细胞悬液，与0.4%台盼蓝染液9:1混合，计数；计算终浓度为1×107/mL所需加入10% FCS 1640的量。
7)加入适量10% FCS 1640调整细胞浓度至1×107/mL，置于4ºC备用。
小鼠淋巴结分离及淋巴细胞的获取实验步骤：1.杀鼠：将小鼠颈椎脱臼处死，70%酒精喷涂表面，无菌条件下剖开小鼠腹腔2.分离淋巴结：取腋下，腹股沟，肠系膜淋巴结，其中腋下淋巴结置固定液中送组化，其余淋巴结放入1ml 5% FCS 1640.3.淋巴结淋巴细胞的分离：1)淋巴结处理：将淋巴结漂浮于3ml 5% FCS 1640（玻璃平皿）中，用无菌大镊子紧捏淋巴结，并用5mL注射器内芯轻轻研磨，绝大部分淋巴细胞游离置培养基中，1ml注射器抽吸滤过，将细胞收集于5ml离心管中。
.2)500g，3min，弃上清。
3)洗涤：加入1ml 5% FCS 1640，重悬沉淀，500g，3分钟，弃上清。
加入1mL 10% FCS1640重悬，取出15μL计数；4)台盼蓝染色细胞计数：1:20稀释细胞悬液，与0.4%台盼蓝染液9:1混合，计数；计算终浓度为1×107/mL所需加入10% FCS 1640 的量。
小鼠脾脏单个核细胞的分离一、实验目的1. 熟悉细胞分离的基本原理2. 掌握小鼠脾脏单个核细胞的分离的方法3. 掌握流式细胞术检测细胞表面标志的方法二、实验原理1.台盼蓝染色：正常的活细胞，胞膜结构完整，能够排斥台盼蓝，使之不能够进入胞内。
丧失活性或细胞膜不完整的细胞，胞膜的通透性增加，可被台盼蓝染成蓝色。
通常认为细胞膜完整性丧失，即可认为细胞已经死亡。
2.脾是人和脊椎动物最大的淋巴器官。
人的脾脏位于左季肋区的后外侧部，呈卵圆形，脾是血循环中重要的滤过器，能清除血液中的异物、病菌以及衰老死亡的细胞，特别是红细胞和血小板。
三、实验材料小鼠手术器械（剪刀、镊子）、酒精喷壶、杀鼠板平皿，尼龙膜指套、研磨棒、吸管、试管、EP管、移液器和tipsPBS缓冲液、红细胞裂解液（ACK）细胞计数板0.2%台盼蓝染液8.显微镜四、实验步骤（一）取小鼠脾脏1.小鼠颈椎脱位处死——用拇指和食指往下按住鼠头，另一只手抓住鼠尾，用力稍向后上方一拉，使之颈椎脱臼，造成脊髓与脑髓断离。
2.取其后右侧卧位，消毒左侧背腹交界处皮肤，剪取脾脏并尽量将去除脂肪及筋膜组织。
（二）制备单个核细胞悬液：1.将脾脏置于盛有5mLPBS缓冲液的平皿中，然后再置于尼龙指套中。
用针芯轻轻碾磨使单个核细胞通过尼龙指套悬浮于平皿中；2.吸取平皿中细胞悬液（再次用尼龙指套过滤）置于刻度离心管中，加PBS缓冲液（可冲洗培养皿）至10mL，以1500rpm离心5min。
弃去上清，弹散细胞沉淀，加ACK2ml，轻轻吹打混匀并放置3-4min，以破坏红细胞。
然后加PBS缓冲液至10ml，以1500rpm离心5min；3.弃去上清，弹散细胞沉淀，加PBS缓冲液至2ml，吹打混匀即为小鼠脾脏单个核细胞悬液。
(放置冰上)4.取100uL至EP管中，进行计数和活力测定（建议5倍稀释）5.以1500rpm离心5min，根据计数结果稀释到合适的浓度a)注：减少操作的时间，并放置冰上或低温离心机里以保证细胞活力（三）计算细胞浓度1.将上述细胞悬液做一定倍数的稀释；（建议5倍稀释）。
准备：1.20ml 预冷5%FBS(HI)-PBS2.50ml 预冷MACS buffer3.70um滤网4.2.5ml RBC lysis5.LS column6.50ml 37度预热PBS7.50ml 37度预热complete culture medium(RPMI 1640 +10% HeatInactivated FBS+10 mM HEPES+1 mM penicilline streptomycin+ 50 mM 2-mercaptoethanol)（一）CD3抗体包被取96孔板每孔加入100ul 10ug/ml anti-CD3抗体（PBS）密封4度过夜。
（二）淋巴细胞获取1.小鼠的脾脏结摘取于10ml 冷5%FBS-PBS中。
2.于70um滤网研磨滤过，500g 4度5min离心后弃上清。
3.2.5ml RBC lysis裂红5 min，10ml 冷5% PBS终止。
4.500g 4度5min 离心后弃上清，10ml MACS buffer重悬，计数。
留取105个细胞进行FACS。
（三）磁珠分选naïve CD8a+ T细胞1.Centrifuge cell suspension at 300×g for 10 minutes. Aspirate supernatant completely. 2.Resuspend cell pellet in 400 μL of MACS buffer per 108 total cells. 3.Add 100 μL of Naive CD8a+ T Cell Biotin-Antibody Cocktail per 108 total cells. 4.Mix well and incubate for 5 minutes in the refr igerator (2−8 °C). 5.Add 200 μL of MACS buffer per 108 total cells. 6.Add 200 μL of Anti-Biotin MicroBeads per 108total cells. Add 100 μL of CD44 MicroBeads per 108 total cells.7.Mix well and incubate for an additional 10 minutes in the refrigerator (2−8 °C).8.Wash cells by adding 10ml of MACS buffer per 108 cells and centrifuge at 300×g for 10 minutes. Aspirate supernatant completely.9.Resuspend up to 108cells in 500 μL of MACS buffer.10.Place LS column in the magnetic field of a suitable MACS Separator.11.Prepare column by rinsing with 3 mL of MACS buffer. 12.Apply cell suspension onto the column. Collect flow-throughcontaining unlabeled cells, representing the enriched naive CD8a+ T cell fraction. 13.Wash column with 3 mL of MACS buffer. Collect unlabeled cells thatpass through, representing the enriched naive CD8a+ T cells, andcombine with the flow-through from step 3. 14.Determine cell number. 留取105个细胞进行FACS。
实验三小鼠脾细胞的分离制备及其活力检测
实验二小鼠脾细胞的分离制备及其
活力检测
材料
1、器材：离心机、手术剪、镊子、平皿、10ml离心管，5ml 注射器等
2、动物：昆明小鼠（25g左右，雄性）
3、试剂：碘伏、红细胞裂解液、Hank’s 液、0.4%台盼兰染液
方法
1、取小鼠一只，置于蜡盘上，颈椎脱臼处死，用碘伏消毒小鼠腹部后，打开腹腔，取出脾，去除周围的结缔组织，放入含有5ml Hank’s的平皿中。
2、用眼科剪将脾一端剪一小口后，将含有5ml Hank’s液的注射器从脾的另一端刺入脾，缓缓注入Hank’s液，即可见脾细胞悬液流入平皿，注意在注射Hank＇s液同时不断转动针头方向，直至脾变苍白为止。
3、将平皿倾斜静置10 min后，用干净吸管吸取细胞液到10ml 离心管中，平衡后，离心（1500rpm 10min），将
离心管盖子打开，快速弃上清液，往管底的细胞中加入1ml的红细胞裂解液，充分混匀20秒，立即加入9ml的Hank’s液，混匀，离心（1500rpm 10min），弃上清，将细胞定容到1ml。
4、吸取0.1ml的细胞悬液到干净的试管中，加入等量的0.4%台盼兰染液，混匀，吸取1滴的细胞液到玻片上，加上盖片，显微镜观察：死亡细胞染成蓝色，活细胞不染色。
正常情况下，活细胞数应达到95%以上。
小鼠脾细胞线粒体的分离与活体染色山东大学实验报告 2014/11/11 姓名:XX 系年级:2XX3级齐鲁医学班学号:20XXXXXXXX 实验题目: 小鼠肝细胞线粒体的活体染色及观察同组者: XXX 小白鼠肝细胞线粒体的活体染色与观察一 (【实验目的】1(观察小白鼠肝细胞内线粒体的形态和结构。
2(学习和掌握细胞的超活染色技术。
二(【实验原理】超活染色实验原理:超活染色也称活体染色，是指对生活有机体的细胞或组织能着色但又无毒害的一种染色方法。
超活染色的目的是显示生活细胞内的某些结构，而不影响细胞的生命活动和产生任何物理、化学变化以致引起细胞的死亡。
应用:活染技术可用来研究生活状态下的细胞形态结构和生理、病理状态。
活体染色根据所用染色剂的性质和染色方法的不同，通常把活体染色分为体内活染与体外活).体内活染是以胶体状的染料溶液注入动、植物体内，染料的胶粒固定、堆积染两类。
(1在细胞内某些特殊结构里，达到易于识别的目的。
(2).体外活染又称超活染色，它是由活的动、植物分离出部分细胞或组织小块，以染料溶液浸染，染料被选择固定在活细胞的某种结构上而显色。
活体染料之所以能固定、堆积在细胞内某些特殊的部分，主要是染料的“电化学，特性起重要作用。
碱性染料的胶粒表面带阳离子，酸性染料的胶粒表面带有阴离子，而被染的部分本身也是具有阴离子或阳离子，这样，它们彼此之间就发生了吸引作用,从而使样品着色。
但不是任何染料皆可以作为活体染色剂之用，应选择那些对细胞无毒性或毒性极小的染料。
活体染色剂选择原则,(1).对细胞无毒性或毒性极小的染料;(2).具有电化学特性;(3).配成稀淡的溶液来使用;(4).一般是以碱性染料最为适用。
线粒体是细胞进行呼吸作用的场所，其形态和数量随不同物种、不同组织器官和不同的生理状态而发生变化。
本实验常用活体染色剂——詹纳斯绿B詹纳斯绿B是毒性较小的碱性染料，可专一地堆线粒体进行超活染色，这是由于线粒体内的细胞色素氧化酶系的作用，使染料始终保持氧化状态(即有色状态)，呈蓝绿色;而线粒体周围的细胞质中，这些染料被还原成为无色的色基(即无色状态)。
小鼠脾脏分离方法
小鼠脾脏分离的方法大致分为以下几个步骤：
1. 准备实验器材和试剂：包括小鼠、手术器械（注射器、剪刀、镊子等）、培养介质等。
2. 麻醉小鼠：将小鼠固定在麻醉机的透明密闭室中，在室内添加气体麻醉剂（如异氟醚）使其麻醉，直到小鼠没有任何反应。
3. 消毒和剪毛：用75%酒精和消毒棉球彻底消毒小鼠的腹部。
将小鼠放在消毒台上，使用剪刀修剪腹部的毛发。
4. 制备手术器械：将手术器械放在消毒台上，使用消毒液进行消毒。
5. 手术操作：使用剪刀和镊子，小心地切开小鼠的腹腔。
找到脾脏，并用剪刀和镊子将其取出。
6. 分离脾脏细胞：将脾脏放入含有适宜培养液的离心管中。
用剪刀和镊子将脾脏分成小块。
7. 细胞过滤：将分块的脾脏组织用细胞过滤器过滤，以去除大块组织和残渣。
8. 细胞计数：使用显微镜和细胞计数板，将过滤后的细胞进行计数。
9. 实验操作：根据实验的需要，将分离的脾脏细胞进行相应的实验操作，如培养、染色等。
10. 实验结束：在实验完成后，将剩余的细胞进行妥善保存或处理，清洗实验器材，并按规定进行废弃物处理。
小鼠脾脏淋巴细胞分离与CFSE染色步骤
实验材料：小鼠1只、组织剪1把、镊子2把、75%酒精、小鼠固定板、1640培养液（10%FBS，1%双抗）、含0.1%FBS的PBS溶液（无菌）、PBS溶液（无菌）、ACK溶液（无菌）、移液管、枪头、组织研磨棒（无菌）、12孔细胞培养板、15mL离心管、300目尼龙网（无菌），细胞计数板，手术台布。
实验前准备工作：
做好上述实验器具的灭菌工作；将手术台布裹在小鼠固定板上，喷75%酒精，组织剪和镊子用75%酒精浸泡后置于生物安全柜中紫外照射30min；
实验步骤：
1. 取一只6-8周小鼠颈椎脱臼处死后，将其全部浸泡于75%酒精中5min。
2. 取出小鼠将其固定于固定板上，用组织剪和镊子沿小鼠腹白线剪开腹腔，拨开小肠在腹腔左上方紧贴小肠部位取褐红色长条型脾脏，用组织剪剪开筋膜同时不要把脾脏剪破，将取下的脾脏用PBS冲洗两遍，剪去脾脏上连接的结缔组织。
3. 将脾脏转移入组织研磨棒中，向其中加入2mLPBS溶液后研磨三下，尽量不残留较大组织块；再用3ml PBS冲洗研磨棒后，将脾脏研磨液经300目尼龙网过滤至15mL离心管中，再用2ml PBS冲洗研磨器内壁，同样过滤至15mL离心管中，离心500g，5min。
4. 弃上清后，加入2mL 常温ACK，轻微吹打，裂解红细胞1min后加入等体积（2mL）PBS 终止裂解，轻微吹打细胞混匀后离心500g，5min。
CFSE染色开始：
5. 弃上清，用4ml PBS（0.1%FBS）重新混匀细胞，反复吹打为单细胞悬液，再用300目尼龙网过滤。
取10μL细胞液于细胞计数板上计数，并将细胞浓度调至1.0×107/ml。
6. 提前将CFSE按照说明书配成5mM母液并2ul分装储存于-80冰箱备用，其工作浓度为0.5-25μM.
7. 分出一部分细胞加入24孔板中，用于做CFSE空白对照
8. 2μlCFSE + 6ml浓度1.0×107/ml的细胞，工作浓度约为1.67μM，37℃，10min，避光。
9. 加入等体积（ice-cold）含血清1640培养基（10%FBS）终止反应，混匀后冰上孵育5min，再离心：500g，5min；
10. 弃上清，用不含血清1640培养基洗细胞一次；
11. 用6ml不含血清培养基（混合TP5或者Tα1或TP5-Myr）重悬细胞沉淀，充分吹打成单细胞悬液，铺12孔板，每孔1ml，孵育2h后再加100ul FBS至终浓度为10%；
11. 37℃，5%CO2培养3-5天后用流式细胞仪分析细胞488nm激光器检查细胞增殖情况。
