小鼠脾脏细胞原代培养

⼩⿏脾脏细胞原代培养及观察计数实验报告-⼭东⼤学⼩⿏脾脏细胞原代培养及观察计数【实验⽬的】1.学习掌握细胞培养的基本原理以及具体⽅法，并对⼩⿏脾细胞进⾏原代培养；2.掌握⽆菌操作的具体过程及⽆菌操作台的使⽤；3.学习掌握染⾊法鉴别细胞的⽣死状态的原理及⽅法；4.学习使⽤⾎球计数板对细胞总数及活细胞数进⾏计数；【实验原理】1.细胞培养细胞培养指的是在⽆菌条件下，把动、植物细胞从组织中取出，在体外模拟体的⽣理环境，使离体的细胞在体外⽣长和繁殖，并且维持其结构和功能的⼀种培养技术。

动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。

从供体获得组织细胞，在⽆菌条件下，⽤胰蛋⽩酶消化或机械分散等⽅法，将动物组织分散成单个细胞开始⾸次培养长出单层细胞的⽅法称为细胞的原代培养。

当培养的动物细胞⽣长增殖达到⼀定密度，形成致密的单层细胞时，⽤胰蛋⽩酶将细胞消化分散成单细胞，从⼀个容器中以1：2或其他⽐例转移到另⼀个容器中扩⼤培养的⽅法，称为细胞的传代培养。

传代培养的累计次数就是细胞的培养代数。

⾼等⽣物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某⼀群细胞在体的功能活动是⼗分困难的。

但如果把活细胞拿到体外培养、增殖并进⾏观察和研究，则要⽅便和简单得多。

被培养的动物细胞是⾮常好的实验对象和实验研究材料，对体外培养的活细胞进⾏研究可以帮助⼈类揭开⽣、⽼、病、死的规律，探索优⽣、抗衰⽼和防治各种疾病的途径和机制，也可以⼈为地诱导和改变细胞的遗传性状和特性，使其向有利于⼈类健康长寿的⽅向发展。

因此动物细胞体外培养技术是研究细胞分⼦机制⾮常重要的实验⼿段，被⼴泛应⽤于医学、⽣物技术、基因⼯程等研究领域。

细胞培养的意义:具有其他⽣物技术⽆可⽐拟的优点；培养条件易改变和控制，便于单因⼦分析；便于⼈们直接对细胞结构、细胞⽣长及发育等过程的观察；在⽣物学的各个领域（如分⼦⽣物学、细胞⽣物学、遗传学、免疫学、肿瘤学及病毒学等）已被⼴泛应⽤。

细胞培养的局限性：在脱离机体复杂环境下，细胞培养条件与躯体环境有⼀定距离；观察到的结果有时难以正确反映机体的状况；细胞培养得到的产物少。

小鼠脾脏细胞原代培养及观察计数【实验目的】1.学习掌握细胞培养的基本原理以及具体方法，并对小鼠脾细胞进行原代培养；2.掌握无菌操作的具体过程及无菌操作台的使用；3.学习掌握染色法鉴别细胞的生死状态的原理及方法；4.学习使用血球计数板对细胞总数及活细胞数进行计数；【实验原理】1.细胞培养细胞培养指的是在无菌条件下，把动、植物细胞从组织中取出，在体外模拟体内的生理环境，使离体的细胞在体外生长和繁殖，并且维持其结构和功能的一种培养技术。

动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。

从供体获得组织细胞，在无菌条件下，用胰蛋白酶消化或机械分散等方法，将动物组织分散成单个细胞开始首次培养长出单层细胞的方法称为细胞的原代培养。

当培养的动物细胞生长增殖达到一定密度，形成致密的单层细胞时，用胰蛋白酶将细胞消化分散成单细胞，从一个容器中以1：2或其他比例转移到另一个容器中扩大培养的方法，称为细胞的传代培养。

传代培养的累计次数就是细胞的培养代数。

高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体内的功能活动是十分困难的。

但如果把活细胞拿到体外培养、增殖并进行观察和研究，则要方便和简单得多。

被培养的动物细胞是非常好的实验对象和实验研究材料，对体外培养的活细胞进行研究可以帮助人类揭开生、老、病、死的规律，探索优生、抗衰老和防治各种疾病的途径和机制，也可以人为地诱导和改变细胞的遗传性状和特性，使其向有利于人类健康长寿的方向发展。

因此动物细胞体外培养技术是研究细胞分子机制非常重要的实验手段，被广泛应用于医学、生物技术、基因工程等研究领域。

细胞培养的意义:具有其他生物技术无可比拟的优点；培养条件易改变和控制，便于单因子分析；便于人们直接对细胞内结构、细胞生长及发育等过程的观察；在生物学的各个领域（如分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学及病毒学等）已被广泛应用。

细胞培养的局限性：在脱离机体复杂环境下，细胞培养条件与躯体环境有一定距离；观察到的结果有时难以正确反映机体内的状况；细胞培养得到的产物少。

小鼠细胞原代培养取材方法原代培养是指直接从体内取下的细胞、组织和器官，经过清洗、剪切、分散等步骤后，立即进行培养的过程。

小鼠细胞原代培养取材方法主要包括以下步骤：1. 实验前准备：在超净工作台或生物安全柜中进行，确保无菌环境。

2. 取材：选择健康的成年小鼠，使用颈椎脱臼法处死小鼠。

用70-75%酒精对烧杯进行消毒，将整个小鼠浸入盛有纯酒精的烧杯中浸泡1分钟进行消毒。

3. 打开腹腔：取出小鼠，将其放在不锈钢手术盘中，用无菌手术剪打开腹腔。

4. 取出组织：小心将所需组织从体内取出，放入无菌培养皿中。

5. 清洗组织：用70-75%酒精擦拭培养皿外周后，将培养皿移至超净工作台或生物安全柜中，用含双抗的Hanks液洗涤组织数遍以去除血污。

6. 剪切组织：在体视显微镜下操作，用无菌手术器械去除多余组织，用解剖镊子或眼科剪将组织剪碎至1立方毫米的肉糜状。

7. 消化组织：将剪碎的组织放入含解离液或培养基的50ml离心管中，用10ml弯头滴管对组织进行吹打5-10次，然后用1ml枪头的吹打组织，最后用200μl的尖端进行吹打。

8. 过滤分散：将上述组织悬液通过70μm过滤器过滤，切碎和分散的组织悬浮液。

9. 离心收集细胞：在1200rpm、4℃下离心10分钟，弃掉上清液，加入配置好的细胞培养基重悬细胞。

10. 接种细胞：将细胞接种于经多聚赖氨酸预处理的培养瓶或培养板中，置于37℃、5%CO2的培养箱中进行培养。

注意事项：取材过程应在无菌环境中进行，确保整个过程不受到污染。

操作时要小心，避免损伤组织。

使用的仪器和器皿均应进行消毒处理。

培养基和试剂应选择适宜的种类和浓度。

培养条件要保持恒定，包括温度、湿度、CO2浓度等。

在实验过程中要密切观察细胞生长情况，及时发现和处理异常情况。

以上是小鼠细胞原代培养取材方法的简要步骤，具体操作可能因实验需求和条件而有所不同。

建议在进行实验前仔细阅读相关文献和资料，并咨询专业人士的建议和指导。

动物细胞原代培养一、剪取组织颈椎脱臼法处死小鼠，放在100ml的烧杯中用70％乙醇消毒3min。

用剪刀剪开腹部，取出肾、肝、脾（任意一种脏器）。

1、将小白鼠断颈处死，然后用75%酒精或1‰ 新洁尔灭浸泡消毒，迅速进入无菌室。

2、将小白鼠置超净工作台上，打开腹腔二、清洗在盛有PBS 液平皿中洗涤数次，剔除包膜、结缔组织，将剔除后脏器放入另一盛有PBS 平皿中。

三、剪切将肾、肝、脾剪成1mm3 （剪成肉末状）大小的组织块，再次清洗，洗去残留的血细胞，以备消化。

四、消化1、在50ml离心筒中加入0. 25％胰蛋白酶溶液25ml，在温暖的环境中或置于37 °水浴摇床中轻轻摇动15min，转速约为180r/min。

2、让存留的组织块在重力作用下慢慢沉降，将含有悬浮细胞的液体转移至一无菌50ml的离心管中，该管内按照每10ml上清加入l ml小牛血清的比例加入牛血清以灭活胰蛋白酶。

（小牛血清在共用无菌操作台上取用）3、在离心管中残留未消化组织块中再次加入胰蛋白酶进行消化，重复步骤1和2。

五、制备单细胞悬液1、将混合的细胞悬液离心，1200rpm，5min，弃上清。

2、将沉淀用新鲜的无菌PBS重悬，再1000-1200rpm，5min离心。

3、用PBS反复洗涤细胞直至上清清亮为止,然后再按照（1）进行离心，离心后弃去上清液，将沉淀用少量细胞培养液反复吹打。

制的细胞悬液。

六、接种1、将细胞悬液接种到细胞培养瓶中。

2、用滤器过滤RPMI1640再悬沉淀，并使终体积为20ml。

（RPMI-1640RPMI是Roswell Park Memorial Institute的缩写，代指洛斯维.帕克纪念研究所。

RPMI是该研究所研发的一类细胞培养基，1640是培养基代号。

其中含有10%胎牛血清。

）七、培养1、在培养瓶外做好标记（标明所培养细胞的名称和时间），2、置于CO2的孵箱中培养，3、72h后即可观察。

小鼠脾脏细胞原代培养及观察计数实验背景：一、细胞培养的基本条件：1.无菌条件：净化工作室，风淋室，传递窗，高效过滤器，洁净层流罩，生物安全柜，超净工作台，紫外灯，电热干燥箱，滤器，高压灭菌器，抗生素2.细胞生长条件：纯水蒸馏器，纯水仪，培养板，培养瓶，CO2培养箱，培养基，血清3.细胞检测条件：倒置显微镜，酶标仪，微孔板震荡器，高速离心机，移液器4.细胞保存条件：液氮罐1.超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱动空气遁过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。

净化空气徐徐通过工作台面，使工作台内构成无菌环境。

2.Zeiss滤器：过滤除菌：大多数培养用液，如人工合成培养基、血清、酶液等均采用滤过法除菌。

3.CO2培养箱：CO2培养箱设定的条件为37 ℃，5％CO2 。

使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题：①用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。

②保持培养箱内空气干净。

定期消毒（90 ℃，14 h)。

③箱内灭菌蒸馏水3000毫升蒸馏水槽中以保持箱内湿度，避免培养液蒸发。

三、细胞培养用液的配制：1.水：新鲜配置的三蒸水或去离子水2.平衡盐溶液：无Ca2+、Mg2+的缓冲液PBS：NaCl 8.0 gKCl 0.2 gNa2HPO4.H2O 1.56 gKH2PO4 0.20加水至1000 ml3.消化液：①胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分离。

②胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过一定限度会损伤细胞。

③胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液配制常用的胰蛋白酶液浓度是0.25％。

用滤器过滤除菌。

④胰蛋白酶液消化时间：2-10分钟。

⑤用含血清培养液终止其对细胞的消化作用4.培养基：培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然培养基和合成培养基。

①天然培养基：天然培养基有血清、血浆和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。

组员：刘炎炎 吴颖川 邹琳 张雪娇 顾琦欣一 实验目的了解原代细胞培养的基本方法及操作过程。

学习细胞计数、营养液的配制等，初步掌握无菌操作方法。

以及观察LPS 和PHA 对细胞生长的影响。

二 实验原理(一)细胞原代培养原代细胞培养是指直接从动物体内获取的细胞、组织和器官，经体外培养后，直到第一次传代为止。

这种培养，首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织（或器官），经消化，分解成单个游离细胞，在人工培养下，使其不断的生长及繁殖。

细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严谨的实验技术。

要使细胞能在体外长期生长，必须满足两个基本要求：一是供给细胞存活所必须的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度与渗透压的调节。

二是严格控制无菌条件。

(二)细胞死活鉴定死活细胞的鉴定方法有很多种，常用的有染色法和仪器分析法。

染色法是常用的细胞死活鉴定方法，简便，易于操作。

不同的死活细胞鉴定方法有各自不同具体的反应机理，但无论采用何种办法，都是利用了死活细胞在生理机能和性质上的差异。

染色法分化学染色法和荧光染色法，根据染色机理的不同，染料或使死细胞着色，或使活细胞着色。

死活细胞在生理机能和性质上的差异主要包括： 死活细胞细胞膜通透性的差异：活细胞的细胞膜是一种选择性膜，对细胞起保护和屏障作用，只允许物质选择性的通过；而细胞死亡之后，细胞膜受损，通透性增加。

常用的以台盼蓝鉴别细胞死活的方法就是利用了这一性质。

台盼蓝，又称锥蓝，是一种阴离子型染料，不能透过完整的细胞膜。

所以经台盼蓝染色后只能使死细胞着色，而活细胞不被着色。

甲基蓝有类似的染色机理。

植物细胞的质壁分离也可鉴定死活。

死活细胞在代谢上的差异：是采用美蓝染料鉴定酵母细胞死活的依据。

美蓝是一种无毒染料，氧化型为蓝色，还原型为无色。

由于活细胞中新陈代谢的作用，使细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝从蓝色的氧化性变为无色的还原型，因此美蓝染色后活的酵母细胞无色；而死细胞或代谢缓慢的老细胞，则因它们的无还原能力或还原能力极弱，使美蓝处于氧化态，从而被染成蓝色或淡蓝色。

小鼠脾脏细胞原代培养及观察计数陈素君200900140007实验目的：了解原代培养的基本方法及操作过程。

学习细胞消化、细胞计数、营养液的配制及酸碱度的调节。

初步掌握无菌操作方法。

学会分辨死活细胞，掌握细胞计数。

实验原理：细胞培养是用无菌的方法将动物体内的组织（或器官）取出，模拟动物体内的生理条件，在体内进行培养，使其不断生长、繁殖，人们借以观察细胞生长、繁殖、细胞分化以及细胞衰老等过程的生命现象。

细胞培养的突出优点，一是便于研究各种理化因素对细胞生长发育和分化等的影响，二是细胞培养便于人们对细胞内部结构（如细胞骨架等）、细胞生长及发育过程的观察。

因而是探索和显示细胞生命活动规律的一种简便易行的实验技术，但是不可忽略它脱离了生物机体的一些变化。

细胞培养分为原代培养和传代培养。

原代培养是指直接从动物体内获得的细胞组织和器官，经体外培养后，直到第一次传代为止。

这种培养，首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织（或器官），经消化，分散成单个游离的细胞，在人工培养的条件下，使其不断地生长及繁殖。

要细胞能在体外长期生长，必须满足基本要求：一是供给细胞存活所必须的条件，如适量的、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度与渗透压的调节。

二是严格控制无菌条件。

台盘蓝氧化与还原型颜色不同，活细胞由于新陈代谢产生较强还原力，染色后呈无色，死细胞染色后呈蓝色。

细胞计数以显微镜计数法进行，即将少量待测样品悬浊液置于特定的具有确定容积的载玻片上（计菌器），于显微镜下直接观察计数。

细胞浓度（个/ml）=4个中等方格内的细胞总数÷4×10000×稀释倍数。

实验用品：一、器材解剖剪、解剖镊、眼科剪、眼科镊、培养皿、纱布块、吸管、橡皮头、烧杯、移液枪、注射器、针头、Eppendorf管。

上述器具彻底清洗、消毒、烤干、包装好倒置相差显微镜、酒精灯、酒精棉球、试管架、解剖板二、试剂PBS缓冲溶液、培养液、台盘蓝三、小白鼠实验方法：1. 细胞的原代培养1.1断头法处死小鼠，将血放掉洗净，在酒精中浸泡3min消毒。

细胞生物学实验报告原代细胞培养1.实验目的：了解原理代细胞培养的基本方法，初步掌握无菌操作的方法。

2.实验用品：（1）仪器及器材：显微镜、载玻片、盖玻片、镊子、手术剪、解剖盘、胶头滴管、微量移液管、培养皿、离心机、注射器、L型针头（2）实验药品：蒸馏水、75%酒精溶液、PBS溶液、细胞培养液（3）实验材料：小鼠3.实验原理：（1）动物细胞培养：从动物体内取出体细胞，在体外模拟体内环境在无菌、适宜温度和一定的营养条件下，使之生存、生长、繁殖，并维持其结构和功能的方法。

原代细胞培养：直接从体内获取细胞组织或器官进行体外培养至第一次传代培养为止。

细胞培养至一定程度后，需再做培养。

及培养的细胞分散后，从一个容器以一定比例转移到另一容器扩大培养。

代数：传代培养累计次数（2）细胞培养的条件①气体条件：有一定的O）（小于空气中浓度）和CO2（5%）②无菌环境：培养用品应高温灭菌，培养液应无菌处理，操作应在超净工作台无菌操作。

③最适温度：36～37℃为最适温度，30～37℃细胞可进行代谢，4℃细胞可存活数天。

④渗透压：一般为260～320mmol/l （人血浆一般为290mmol/l）⑤营养条件：含细胞生长必须的有机物，氨基酸、维生素、无机盐、辅助物等。

培养基中不含生长因子，因此，必须在培养基中加入小牛血清。

⑥最适pH：7.0～7.4（中和细胞代谢废物与酸性气体环境）（3）贴壁生长与不贴壁生长①贴壁生长：来自于实体组织的细胞多贴壁生长。

贴壁生长的细胞进行传代培养更换培养皿时有以下步骤：首先，应轻晃培养皿并弃去上清液（去除死细胞），再用胰蛋白酶处理（细胞成片收缩，变圆），倾斜培养皿，用滴管吸去多余酶液，然后用滴管吸取PBS溶液吹打细胞并离心，最后，加入新的培养液，按比例分入培养皿中。

②不贴壁生长：造血细胞、癌细胞等。

半量换液法：吸取1/2培养液到新的培养皿中，再离心，取下层细胞，分入多个培养皿中。

4.实验步骤：（1）用断头法处死小鼠，置于解剖盘中。

细胞原代培养方法1. 胰酶消化法(1) 器材：将孕鼠或新生小鼠拉颈椎致死，置75%酒精泡2—3秒钟(时间不能过长、以免酒精从口和肛门浸入体内)再用碘酒消毒腹部，取胎鼠带入超净台内(或将新生小鼠在超净台内)解剖取肝脏，置平皿中。

(2) 用Hank’s液洗涤三次，并剔除脂肪，结缔组织，血液等杂物。

130(3) 用手术剪将肝脏剪成小块(1mm2)，再用Hank’s液洗三次，转移至小青霉素瓶中。

(4) 视组织块量加入5—6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20—40分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。

(5) 加入3—5ml培养液以终止胰酶消化作用(或加入胰酶抑制剂)。

(6) 静置5—10分钟，使未分散的组织块下沉，取悬液加入到离心管中。

(7) 1000rpm，离心10分钟，弃上清液。

(8) 加入Hank’s液5ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。

(9) 加入培养液l—2 ml(视细胞量)，血球计数板计数。

(10) 将细胞调整到5×105/ml左右，转移至25ml细胞培养瓶中，37℃下培养。

上述消化分离的方法是最基本的方法，在该方法的基础上，可进一步分离不同细胞。

细胞分离的方法各实验室不同，所采用的消化酶也不相同(如胶原酶，透明质酶等)。

2. 组织块直接培养法自上方法第3步后，将组织块转移到培养瓶，贴附与瓶底面。

翻转瓶底朝上，将培养液加至瓶中，培养液勿接触组织块。

入37℃静置3—5小时，轻轻翻转培养瓶，使组织浸入培养液中(勿使组织漂起)，37℃继续培养。

3. 贴壁细胞传代方法(1) 吸光培养瓶中的培养液。

(2) 加入1-2 mL 0.25%的胰蛋白酶液(以消化液能覆盖整个瓶底为准)静置2-10min(显微镜下动态监测) 。

(3) 吸去胰蛋白酶液，加入培养液。

(4) 吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，形成细胞悬液。

(5) 吸取细胞悬液，接种于新的培养瓶内。

(6) 加适量新鲜培养液于新培养瓶内。

一、实验目的1. 掌握细胞培养的基本原理和方法；2. 学习细胞传代培养的操作过程；3. 了解细胞培养在生物学研究中的应用。

二、实验原理细胞培养是指在无菌条件下，将生物体中的细胞取出，在体外模拟体内生理环境，使细胞在体外生长、繁殖和维持其结构和功能的一种技术。

细胞培养可分为原代培养和传代培养。

原代培养是指从生物体中取出组织细胞，进行首次培养；传代培养是指当原代培养的细胞增殖到一定密度后，将细胞分散后转移到另一个或几个容器中进行扩大培养。

三、实验材料1. 细胞：小鼠脾细胞2. 培养基：DMEM培养基3. 试剂：胰蛋白酶、胎牛血清、青霉素、链霉素、双抗、无菌水、无菌滤纸、移液枪、吸管、培养皿、培养箱、显微镜等。

四、实验步骤1. 细胞原代培养（1）取小鼠脾脏，放入无菌培养皿中；（2）用无菌滤纸吸去多余血液；（3）将脾脏剪成小块，放入含有胰蛋白酶的培养皿中；（4）37℃水浴消化10分钟；（5）用无菌吸管将消化后的细胞悬液转移至另一无菌培养皿中；（6）加入胎牛血清终止消化；（7）用移液枪吹打细胞，使其分散；（8）将细胞悬液转移至培养皿中，放入培养箱中培养。

2. 细胞传代培养（1）待细胞生长至80%以上时，用胰蛋白酶消化；（2）加入胎牛血清终止消化；（3）用移液枪吹打细胞，使其分散；（4）将细胞悬液转移至新的培养皿中，加入新鲜培养基；（5）放入培养箱中培养。

五、实验结果1. 细胞原代培养：显微镜下观察到细胞呈圆形、多角形，细胞质丰富，细胞核清晰；2. 细胞传代培养：细胞生长旺盛，形态良好，传代过程中细胞生长速度逐渐加快。

六、实验讨论1. 细胞培养过程中，无菌操作至关重要，避免污染；2. 细胞培养环境要求严格，温度、pH值、氧气浓度等条件需符合细胞生长需求；3. 细胞传代培养过程中，要注意细胞的生长状态，适时传代，避免细胞过度生长或老化；4. 细胞培养技术在生物学研究中具有重要意义，可用于研究细胞生理、病理、遗传等。

一、实验目的1. 掌握原代细胞培养的基本原理和操作步骤。

2. 熟悉细胞培养所需的设备和试剂。

3. 了解细胞培养过程中可能遇到的问题及解决方法。

二、实验原理原代培养是指从生物体内取出组织或细胞，在体外模拟体内生理条件，使其生存、生长、繁殖或传代的过程。

原代培养细胞与体内细胞在形态结构和功能活动上具有相似性，适用于研究细胞生长、代谢、分化等生物学特性。

三、实验材料1. 实验动物：小鼠、大鼠等。

2. 组织：肝脏、脾脏、皮肤等。

3. 试剂：胰蛋白酶、EDTA、胎牛血清、DMEM培养基等。

4. 设备：超净工作台、细胞培养箱、倒置显微镜、移液器、离心机等。

四、实验步骤1. 组织块制备（1）取动物组织，用生理盐水清洗，去除血污。

（2）将组织剪成1mm×1mm×1mm的小块。

（3）将组织块置于含有胰蛋白酶的消毒培养皿中，37℃水浴消化15-20分钟。

（4）加入适量胎牛血清终止消化，用吸管吹打组织块，使其分散成单个细胞。

2. 细胞接种（1）将分散后的细胞悬液移至含有DMEM培养基的培养瓶中，置于细胞培养箱中培养。

（2）观察细胞生长情况，适时更换新鲜培养基。

3. 细胞传代（1）待细胞生长至单层时，用胰蛋白酶消化细胞。

（2）收集消化后的细胞，加入胎牛血清终止消化。

（3）将细胞悬液接种至新的培养瓶中，继续培养。

4. 细胞观察（1）使用倒置显微镜观察细胞形态、生长状态等。

（2）对细胞进行染色，如台盼蓝染色、Giemsa染色等，观察细胞核、细胞器等结构。

五、实验结果1. 原代细胞在培养过程中呈现典型的贴壁生长，细胞形态为多边形、梭形等。

2. 细胞生长速度较快，2-3天即可达到80%的融合度。

3. 细胞传代过程中，细胞生长状态良好，无明显形态变化。

六、实验讨论1. 原代细胞培养过程中，无菌操作至关重要。

应确保所有操作均在超净工作台内进行，避免污染。

2. 培养基的配制和质量直接影响细胞生长。

应严格按照试剂说明书配制培养基，并确保其质量。

小鼠脾脏原代细胞培养与细胞死活鉴定和计数一、实验目的1.学习掌握细胞培养的基本原理及具体操作方法，并对小鼠脾细胞进行原代培养2.掌握并熟悉无菌操作的要点，并养成无菌操作的习惯3.学习用染色法鉴别细胞死活并进行细胞计数4.学会利用血球计数板对细胞总数和活细胞进行计数二、实验原理①细胞培养：多细胞生物的细胞可以被分离出来，然后在体外特殊培养环境中继续存活，并保持其生理、生化特性直接从生物体分离出来，在体外培养过程中尚未分裂、增殖的细胞，称为原代培养细胞。

原代培养细胞在一定条件下可以继续增殖，在数量上大量扩增，这时就成为继代培养细胞。

细胞培养基要满足细胞的生长需要，培养细胞的条件有水的质量、无菌环境，最适温度、渗透压、气体条件、最适PH、营养条件和培养基质等。

细胞培养皿是特殊制造的使细胞可以贴壁。

细胞培养箱常指二氧化碳培养箱。

它可以提供合适的温度和二氧化碳浓度。

二氧化碳和培养基中的缓冲系统共同作用，保持细胞培养液的酸碱度。

超净台通过将空气进行过滤，为细胞培养的各种操作提供了一个干净的环境，使细胞培养免于细菌和真菌的污染。

②细胞生死状态的鉴别方法主要是化学染色法和荧光染色法：活细胞和死亡细胞在生理技能和性质上主要存在一下差异：I.细胞膜通透性的差异：活细胞的细胞膜是一种选择性膜，对细胞起保护和屏障作用，只允许物质选择性地通过；而细胞死后，细胞膜受损，其通透性增加。

基于此，发展出了以台盼蓝、伊红、苯胺黑、赤藓红、甲基蓝以及荧光染料碘化丙啶或溴化乙啶等为染料鉴别细胞生死状态的方法，上述染料能使死亡细胞着色，而活细胞不被着色。

II.代谢上的差异：活细胞中新陈代谢作用强，细胞内的酶具有较强的活性和还原能力。

基于此，发展处了以荧光素二乙酸酯（FDA）、荧光素二丙酸酯、荧光素二丁酸酯或荧光素二苯甲酰酯等酯化的荧光素鉴别细胞生死状态的方法，上述酯化的荧光素亲脂性提高，容易被细胞吸收进入，活细胞内的酯酶具有较强的活性，可将酯化的荧光素分解而释放出能发荧光的荧光素，该物质不能自由透过活的细胞膜，积累在细胞内，荧光显微镜下显示有明亮的绿色或黄绿色荧光；而死亡细胞内的酯酶因失去活性，不能分解酯化的荧光素，荧光显微镜下显示不发光。

一、实验目的1. 掌握小鼠脾细胞的原代培养方法。

2. 学习无菌操作的具体过程，确保细胞培养的无菌环境。

3. 熟悉染色法鉴别细胞生死状态的技术。

4. 学习使用血球计数板对细胞总数及活细胞数进行计数。

二、实验原理细胞培养是指在无菌条件下，将动物细胞从组织中取出，在体外模拟体内生理环境，使离体的细胞在体外生长和繁殖，并维持其结构和功能的一种培养技术。

动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。

原代培养是指从供体获得组织细胞，在无菌条件下，用胰蛋白酶消化或机械分散等方法，将动物组织分散成单个细胞开始首次培养，长出单层细胞的方法。

传代培养是指当培养的动物细胞生长增殖达到一定密度，形成致密的单层细胞时，用胰蛋白酶将细胞消化分散成单细胞，从一个容器中以1：2或其他比例转移到另一个容器中扩大培养的方法。

三、实验材料1. 实验动物：6-8周龄小鼠。

2. 实验试剂：胰蛋白酶、胎牛血清、DMEM培养基、PBS缓冲液、细胞培养瓶、无菌手术器械、无菌操作台、血球计数板等。

四、实验步骤1. 无菌操作准备：在无菌操作台内，将所有实验材料进行消毒处理，包括手术器械、培养瓶、移液器等。

2. 小鼠脾脏取出：将小鼠麻醉后，无菌条件下取出脾脏。

3. 脾脏处理：将脾脏放入含有DMEM培养基的培养皿中，用剪刀将脾脏剪碎，去除结缔组织和脂肪。

4. 胰蛋白酶消化：向脾脏组织中加入适量的胰蛋白酶，在37℃水浴中消化10分钟。

5. 终止消化：加入等量的DMEM培养基终止消化。

6. 细胞计数：用血球计数板对细胞进行计数，计算细胞总数和活细胞数。

7. 细胞培养：将细胞悬液接种于培养瓶中，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。

8. 观察细胞生长：每天观察细胞生长情况，包括细胞形态、生长速度等。

9. 细胞传代：当细胞生长达到一定密度时，用胰蛋白酶消化细胞，进行传代培养。

五、实验结果1. 成功制备小鼠脾细胞悬液，细胞总数和活细胞数符合预期。

2. 细胞在培养过程中生长良好，形态正常。

一、实验目的1. 掌握小鼠原代细胞培养的基本原理和操作方法；2. 了解小鼠细胞传代培养的注意事项；3. 学习使用显微镜观察小鼠细胞的生长状态；4. 熟悉细胞冻存和复苏的操作步骤。

二、实验原理小鼠细胞培养是一种在体外模拟体内生理环境，使细胞在无菌条件下生长和繁殖的技术。

细胞培养可分为原代培养和传代培养。

原代培养是指从组织中获得细胞，经过消化、分散后，在无菌条件下进行首次培养；传代培养是指将生长良好的细胞进行消化、分散后，转移到新的培养容器中进行培养。

细胞冻存和复苏是细胞保存和长期保存的重要方法。

三、实验材料与仪器1. 实验材料：小鼠脾脏、胰蛋白酶、胎牛血清、培养瓶、培养皿、移液器、吸管、细胞冻存管等；2. 实验仪器：超净工作台、显微镜、细胞培养箱、离心机、冰柜等。

四、实验步骤1. 小鼠脾脏的获取与消化（1）取小鼠脾脏，置于含有胎牛血清的培养皿中；（2）用无菌剪刀将脾脏剪成小块；（3）加入适量的胰蛋白酶，置于37℃水浴锅中消化5-10分钟；（4）消化完成后，加入胎牛血清终止消化，用吸管吹打脾脏组织，使其分散成单个细胞。

2. 细胞原代培养（1）将分散好的细胞悬液接种于培养瓶中，置于培养箱中培养；（2）每天观察细胞生长状态，待细胞生长到80%以上时，进行传代培养。

3. 细胞传代培养（1）用胰蛋白酶消化细胞，收集细胞；（2）将消化好的细胞悬液接种于新的培养瓶中，置于培养箱中培养；（3）重复以上步骤，进行细胞传代培养。

4. 细胞冻存和复苏（1）将细胞悬液加入冻存管中，加入适量的胎牛血清；（2）将冻存管置于-80℃冰箱中保存；（3）需要复苏细胞时，将冻存管置于37℃水浴锅中解冻，加入适量的胎牛血清；（4）将复苏后的细胞接种于培养瓶中，置于培养箱中培养。

5. 细胞观察（1）将培养好的细胞用移液器收集到培养皿中；（2）加入适量的固定液，室温固定10分钟；（3）用吸管吹打细胞，使其分散均匀；（4）用盖玻片封片，置于显微镜下观察细胞形态、生长状态等。

小鼠细胞原代培养取材方法
小鼠细胞原代培养取材的方法如下：
1. 准备工具和试剂：显微镜、组织培养耗材（培养皿、离心管、无菌吸管等）、组织培养基、酶消化液（如胰蛋白酶）、PBS缓冲液、抗生素/抗菌剂。

2. 选择适当的组织：根据需要培养的小鼠细胞类型，选择相应的组织。

常用的组织包括肝脏、肺、脾脏、肌肉等。

3. 术前准备：将工作台面清洗消毒，准备好所需的培养皿和离心管，并在显微镜下准备好所需的组织。

4. 组织分离：将小鼠人工麻醉后，用无菌PBS缓冲液冲洗外部组织，然后取出所需的组织。

将组织切成小块，放入含有适当酶消化液的离心管中，进行酶消化。

消化时间和温度根据具体实验要求来确定。

5. 组织纯化：将酶消化后的混合细胞悬液通过滤网过滤，去除组织碎片和大颗粒。

然后将悬液离心，收集沉淀细胞。

细胞沉淀可以通过悬液离心的速度和时间的调整来控制纯化程度。

6. 细胞计数：用显微镜和细胞计数板对细胞进行计数，以确定需要的细胞数量。

7. 细胞培养：将收集到的细胞沉淀转移到含有适当培养基的培养皿中。

根据细胞类型的不同，培养条件和培养基的配方也会有所区别。

一般来说，细胞培养条件包括适当的培养基、温度、CO2浓度和湿度。

8. 细胞培养维护：定期更换培养基，观察细胞的生长情况，及时处理培养皿中的细菌或真菌污染，并进行细胞的传代培养。

以上是小鼠细胞原代培养取材的基本方法，具体操作中还需要根据实验需求和细胞类型的特点进行相应调整。

细胞生物学实验报告题目：小鼠脾脏细胞原代培养及死、活细胞计数姓名：余振洋学号：200900140156 系年级：09级生科三班时间：2011/5/26一、【实验目的】1、了解原代细胞培养的基本方法及操作过程，初步掌握无菌操作的方法。

2、学习细胞计数的方法。

3、学习并掌握死活细胞鉴别的原理及方法。

二、【实验材料】1．实验仪器：解剖刀、解剖镊、解剖盘、无菌培养皿、滴管、“L”形针头、Eppendorf 管、塑料培养皿、移液枪、离心机、试管及试管架、血球计数板、显微镜、标记笔、超净工作台、CO2培养箱等2．实验试剂：PBS液、台盼蓝染液，75%酒精、生理盐水3．材料：小白鼠三、【实验原理】1．细胞原代培养原代细胞培养是指直接从动物体内获首取的细胞、组织或器官，经体外培养后，直到第一次传代为止。

这种培养，首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织（或器官），经消化，分散成为单个游离的细胞，在人工培养下，使其不断的生长和繁殖。

细胞能在体外长期生长，必须满足两个基本要求：一是供给细胞存活所必须的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度与渗透压的调节。

二是严格控制无菌条件。

细胞培养技术目前已经被广泛地应用于生物学各个领域。

如分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学以及病毒学等。

2．细胞死活鉴定。

常用细胞死活鉴定方法有台盼蓝法：细胞损伤或死亡时，台盼蓝可穿透变性的细胞膜，与解体的DNA 结合，使其着色呈蓝色。

而活细胞能阻止染料进入细胞内，呈无色。

故可以鉴别死细胞与活细胞。

本次实验即采用此方法。

伊红Y 法：细胞悬液与3倍量的0.15%伊红染液混合，2min后制片镜检，死细胞被染成红色而活细胞呈无色。

3．细胞计数：血球计数板（如图1所示）是一块特制的厚载玻片，载玻片上由4条槽而构成3个平台。

中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个方格网，每个方格网共分9大格，其中的一大格即为计数室。

一、实验目的1. 掌握小鼠脾脏的解剖学位置和结构。

2. 学习脾脏细胞分离、培养和计数的方法。

3. 掌握细胞染色、观察和计数的技巧。

4. 了解脾脏细胞在免疫学中的重要作用。

二、实验原理脾脏是机体重要的免疫器官之一，主要负责滤血、产生抗体和清除衰老、异常红细胞等功能。

脾脏中含有丰富的淋巴细胞，如B细胞、T细胞和巨噬细胞等，是研究免疫学的重要模型。

本实验通过分离小鼠脾脏细胞，进行原代培养和计数，观察细胞形态和生长情况，以了解脾脏细胞的生物学特性及其在免疫学中的应用。

三、实验材料1. 实验动物：C57BL/6小鼠。

2. 仪器与试剂：解剖剪、镊子、解剖针、离心管、离心机、PBS缓冲液、胰蛋白酶、细胞培养基、血球计数板、染色剂、显微镜等。

四、实验方法1. 解剖小鼠：处死小鼠后，打开腹腔，分离脾脏。

2. 脾脏细胞分离：将脾脏组织放入PBS缓冲液中，用解剖剪剪碎组织，加入胰蛋白酶消化酶，37℃消化30分钟。

3. 细胞培养：消化后的细胞用PBS缓冲液洗涤，加入细胞培养基，调整细胞密度，进行原代培养。

4. 细胞计数：采用血球计数板对培养细胞进行计数，观察细胞生长情况。

5. 细胞染色：采用染色剂对细胞进行染色，观察细胞形态和活力。

6. 显微镜观察：用显微镜观察细胞形态、生长情况和染色效果。

五、实验结果1. 脾脏细胞分离：成功分离出小鼠脾脏细胞，细胞形态呈圆形或椭圆形，细胞密度约为1×10^6个/mL。

2. 细胞培养：细胞在培养过程中生长良好，呈单层生长，细胞形态正常。

3. 细胞计数：培养细胞密度逐渐增加，生长曲线呈指数增长。

4. 细胞染色：细胞染色效果良好，细胞核染色深，细胞质染色浅，细胞活力较高。

5. 显微镜观察：细胞形态正常，生长旺盛，无明显病变。

六、实验讨论1. 脾脏是机体重要的免疫器官，含有丰富的淋巴细胞，在免疫学研究中具有重要意义。

2. 本实验成功分离出小鼠脾脏细胞，并进行原代培养和计数，为后续研究提供了良好的实验材料。

小鼠脾细胞的制备实验报告小鼠脾细胞的制备实验报告引言：细胞是生物体的基本单位，对于研究生物学、医学和药物研发等领域具有重要意义。

小鼠作为常见的实验动物模型，其脾脏细胞在免疫学研究中扮演着重要角色。

本实验旨在制备小鼠脾细胞，为后续的实验提供基础。

材料与方法：1. 实验动物：雄性C57BL/6小鼠，年龄8-12周。

2. 工具：手套、无菌离心管、无菌移液器、培养皿、无菌剪刀和镊子等。

3. 试剂：PBS缓冲液、RBC裂解缓冲液、细胞培养基、胰蛋白酶和DNA酶。

实验步骤：1. 小鼠准备：选择健康小鼠，按照实验动物伦理要求进行操作。

使用无菌手套将小鼠固定在实验台上。

2. 消毒处理：用70%乙醇对小鼠腹部进行消毒处理，避免细菌污染。

3. 脾脏收集：使用无菌剪刀和镊子，小心地切开小鼠腹部，将脾脏取出并置于无菌培养皿中。

4. 细胞制备：将脾脏置于PBS缓冲液中，用无菌移液器反复冲洗，去除血液和组织残渣。

5. 细胞溶解：加入适量的RBC裂解缓冲液，轻轻摇晃培养皿，使脾细胞充分释放。

6. 细胞离心：将脾细胞悬液转移到无菌离心管中，进行低速离心（1000 rpm，5分钟）。

7. 细胞沉淀：将上清液倒掉，保留细胞沉淀。

8. 细胞洗涤：加入适量的PBS缓冲液，轻轻摇晃离心管，使细胞充分悬浮，再次进行低速离心（1000 rpm，5分钟）。

9. 细胞计数：将上清液倒掉，用无菌移液器吸取适量细胞悬液，用细胞计数板进行细胞计数。

10. 细胞培养：将细胞悬液转移到含有细胞培养基的培养皿中，放入37摄氏度恒温培养箱中，进行培养。

结果与讨论：通过以上步骤，成功制备了小鼠脾细胞。

制备的脾细胞悬液呈现浑浊的乳白色，细胞数量充足。

细胞计数结果显示，脾细胞的浓度为1×10^6个/ml，细胞活力高。

在细胞培养基中，脾细胞能够正常生长和繁殖，细胞形态呈现圆形或椭圆形，细胞贴壁能力强。

小鼠脾细胞的制备对于免疫学研究具有重要意义。

通过制备脾细胞悬液，可以进行一系列的细胞实验，如细胞培养、细胞分离、细胞凋亡等。

小鼠肝细胞原代培养实验具体方法及步骤将小鼠的肝细胞从机体中取出，经胰酶、螯合剂（常用EDTA）处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖。

具体步骤1. 将小鼠断颈致死，置75%酒精泡2-3秒钟，取肝脏，置于盛有PBS的平皿中。

2. 剔除脂肪、结缔组织、血液等杂物，转移到另一个盛有PBS液的平皿中。

3. 用手术剪将脏器剪成小块（大小约1mm2），玻片研磨，转到离心管，离心（1 000 rpm，5 min）。

4. 视组织或细胞量加入5-6倍（3-5 ml）胰酶，37℃中消化20分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。

5. 加入3-5 ml含血清的培养液以中止胰酶消化作用。

6. 用100目孔径滤网滤过，除去未消化的大组织块。

7. 再次离心5 min，弃上清液。

8. 加入无血清培养液5 ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。

9. 加入含血清的培养液1-2 ml（视细胞量），血球计数板计数。

10. 将细胞调整到5×105/ml左右，转移至6孔培养板中，37℃下培养。

注意1. 自取材开始，保持所有组织细胞处于无菌条件。

细胞计数可在有菌环境中进行。

2. 在超净台中，组织细胞、培养液等不能暴露过久，以免溶液蒸发。

3. 凡在超净台外操作的步骤，各器皿需用盖子或橡皮塞盖住，以防止细菌落入。

4. 操作前要洗手，进入超净工作台后要用75％酒精或0.2％新洁尔灭擦拭手。

试剂瓶口也要擦拭。

5. 点燃酒精灯，操作在火焰附近进行，耐热物品要经常在火焰上烧灼。

金属器械烧灼时间不能太长，以免退火，且冷却后才能夹取组织。

吸取过营养液的用具不能再烧灼，以免烧焦形成碳膜。

6. 操作动作要准确敏捷，但又不能太快，以防空气流动，增加污染机会。

7. 不能用手触及消毒器皿的工作部分，工作台面上的用品摆放要布局合理。

8. 瓶子开口后要尽量保持45°斜位。

9. 吸溶液的吸管等不能混用。