复旦大学免疫实验小鼠脾脏单个核细胞分离及细胞计数

脾脏单个核细胞的制备脾脏单个核细胞的制备: 将5 只小鼠断颈椎处死, 无菌取出脾脏, 分别剪碎, 置200 目无菌尼龙网上, 分次滴入4~ 5 ml RPMI1640 培养液, 轻轻研磨脾脏, 直到脾脏变白;收集细胞悬液( 由于红细胞所占比例很低且对实验影响不大, 故无需作红细胞裂解处理) , 1 000 r/ min( 离心半径17. 5 cm) 离心5 min, 弃上清; 加入2 ml pH7. 4 的PBS, 混匀后1 000 r/ min( 离心半径17. 5 cm) 离心5min, 弃上清; 加入4 ml RPMI1640 培养液, 混匀, 用RPMI1640 培养液稀释200 倍后滴加在细胞计数板上进行细胞计数, 根据计数结果用RPMI1640 将细胞悬液调成2 × 10 / 300 µl 的浓度。

《流式细胞术检测小鼠脾细胞内细胞因子刺激方案的筛选》单细胞悬液的制备：将大鼠颈椎脱位处死后, 置70%乙醇中浸泡5 m in, 无菌取出脾脏和胸腺置于平皿中, 除掉结缔组织, 用生理盐水清洗3次。

加入2 mL RPM I- 1640完全培养液, 用剪刀分别将脾和胸腺剪成1 mm 1 mm 1 mm 碎块后, 用毛玻片轻柔研磨组织碎片, 经8层纱布过滤制成单细胞悬液, 经H anks液离心洗涤后, 将细胞悬浮于含10%小牛血清的RPM I- 1640 培养液。

台盼蓝染色, 计数活细胞在95%以上, 调整细胞数至5×10 cells /L。

《粗江蓠多糖对大鼠淋巴细胞周期的影响》610制备脾细胞悬液脾淋巴细胞的获取:手术刀、解剖剪、解剖镊、止血钳等手术器械,300 目尼龙网等须经消毒处理; 以颈椎脱臼法处死小鼠, 用7 5 % 乙醇浸泡小鼠10-15min 。

沿腹腔中线剪开小鼠胸腔, 取出脾脏置于培养皿中, 剪去脂肪和筋膜组织, 用R PMI-1640培养液漂洗。

粗剪成小块, 用注射器芯轻轻挤压, 加人基础培养液, 混悬, 用300目尼龙网过滤到玻璃离心管中, 再加人基础培养液冲洗网上剩余组织细胞。

小鼠脾脏细胞原代培养及观察计数【实验目的】1.学习掌握细胞培养的基本原理以及具体方法，并对小鼠脾细胞进行原代培养；2.掌握无菌操作的具体过程及无菌操作台的使用；3.学习掌握染色法鉴别细胞的生死状态的原理及方法；4.学习使用血球计数板对细胞总数及活细胞数进行计数；【实验原理】A.细胞培养细胞培养指的是在无菌条件下，把动、植物细胞从组织中取出，在体外模拟体内的生理环境，使离体的细胞在体外生长和繁殖，并且维持其结构和功能的一种培养技术。

动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。

从供体获得组织细胞，在无菌条件下，用胰蛋白酶消化或机械分散等方法，将动物组织分散成单个细胞开始首次培养长出单层细胞的方法称为细胞的原代培养。

当培养的动物细胞生长增殖达到一定密度，形成致密的单层细胞时，用胰蛋白酶将细胞消化分散成单细胞，从一个容器中以1：2或其他比例转移到另一个容器中扩大培养的方法，称为细胞的传代培养。

传代培养的累计次数就是细胞的培养代数。

高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体内的功能活动是十分困难的。

但如果把活细胞拿到体外培养、增殖并进行观察和研究，则要方便和简单得多。

被培养的动物细胞是非常好的实验对象和实验研究材料，对体外培养的活细胞进行研究可以帮助人类揭开生、老、病、死的规律，探索优生、抗衰老和防治各种疾病的途径和机制，也可以人为地诱导和改变细胞的遗传性状和特性，使其向有利于人类健康长寿的方向发展。

因此动物细胞体外培养技术是研究细胞分子机制非常重要的实验手段，被广泛应用于医学、生物技术、基因工程等研究领域。

细胞培养的意义:具有其他生物技术无可比拟的优点；培养条件易改变和控制，便于单因子分析；便于人们直接对细胞内结构、细胞生长及发育等过程的观察；在生物学的各个领域（如分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学及病毒学等）已被广泛应用。

细胞培养的局限性：在脱离机体复杂环境下，细胞培养条件与躯体环境有一定距离；观察到的结果有时难以正确反映机体内的状况；细胞培养得到的产物少。

解刨小鼠提取脾细胞实验报告
解刨小鼠提取脾细胞实验报告
一、实验目的
本实验旨在通过解刨小鼠，提取脾细胞，以便进行后续的免疫学研究。

二、实验材料和仪器
1. 实验材料：小白鼠、生理盐水、70%乙醇、福尔马林、石蜡等。

2. 实验仪器：手术刀、注射器、组织培养皿、显微镜等。

三、实验步骤
1. 解剖小白鼠：将小白鼠放入无菌条件下，用70%乙醇消毒表面。

然后用手术刀在胸部进行切口，打开胸腔，找到心脏，将心脏割断。

接
着将小白鼠向上抬起头部，用手术刀在颈部进行切口，打开颈部皮肤
和肌肉层，在颈动脉两侧夹住气管和食管，并清除周围组织。

最后将
气管和食管割断，并将颈动脉及其分支全部割断。

2. 取出脾脏：用注射器注入生理盐水，将脾脏从周围组织中分离出来，然后将脾脏放入组织培养皿中加入生理盐水洗涤。

3. 细胞处理：将清洗干净的脾脏放入福尔马林中固定30分钟，再用酒精和石蜡等物质进行包埋。

最后用显微镜观察并提取细胞。

四、实验结果
通过本实验，成功地解剖出小白鼠，并提取了脾细胞。

经过显微镜观察，我们可以看到细胞形态正常，并且数量充足。

五、实验注意事项
1. 实验操作要求严格无菌。

2. 解剖小白鼠时要保持手术刀的锋利度。

3. 在取出脾脏时要注意不要损伤其结构。

4. 细胞处理过程中要避免污染。

六、实验结论
通过本实验，我们成功地解剖了小白鼠并提取了脾细胞。

这为后续的免疫学研究奠定了基础。

同时，在操作过程中也需要注意无菌和仪器使用等方面的细节。

小鼠脾细胞的制备实验报告一、实验目的本实验旨在掌握从小鼠体内分离和制备脾细胞的方法，为后续的免疫学实验和细胞生物学研究提供材料。

二、实验原理脾脏是机体重要的免疫器官，富含各类免疫细胞，如淋巴细胞、巨噬细胞等。

通过机械破碎和细胞筛过滤的方法，可以将脾组织分散成单细胞悬液，再经过离心、洗涤等步骤，去除杂质和红细胞，从而获得较为纯净的脾细胞。

三、实验材料与设备1、实验动物：健康成年小鼠2、主要试剂：无菌 PBS 缓冲液、红细胞裂解液、胎牛血清、培养基3、实验器材：手术器械（剪刀、镊子）、无菌培养皿、细胞筛、离心机、移液器、显微镜等四、实验步骤1、小鼠的处理提前将小鼠禁食不禁水 12 小时。

采用颈椎脱臼法处死小鼠，将其仰卧固定在解剖板上。

用 75%的酒精消毒小鼠腹部皮肤。

2、脾脏的获取在无菌条件下，沿腹部中线剪开皮肤和腹膜，暴露腹腔。

小心地分离出脾脏，避免损伤周围组织和血管。

将脾脏放入盛有少量无菌 PBS 缓冲液的培养皿中。

3、脾细胞的制备用镊子和剪刀将脾脏剪成小块，置于细胞筛上。

用注射器活塞轻轻研磨脾脏组织，使细胞通过筛网进入下方的离心管中。

加入适量 PBS 缓冲液冲洗细胞筛，收集全部细胞悬液。

4、离心和洗涤将细胞悬液离心（1500rpm，5 分钟），弃上清。

加入红细胞裂解液，轻轻吹打混匀，室温静置 5 分钟，以裂解红细胞。

再次离心（1500rpm，5 分钟），弃上清。

用 PBS 缓冲液洗涤细胞 2-3 次，每次离心后弃上清。

5、细胞计数和培养用适量含血清的培养基重悬细胞。

取少量细胞悬液，加入台盼蓝染液，在显微镜下计数活细胞数量。

根据实验需要，将细胞调整至合适的浓度，接种于培养板或培养瓶中，置于培养箱中培养。

五、实验结果1、细胞形态观察在显微镜下观察制备的脾细胞，可见多数细胞呈圆形，大小不一，有细胞核。

细胞形态完整，无明显的破碎和损伤。

2、细胞计数结果经台盼蓝染色后，计数活细胞比例，通常应在 90%以上。

一、实验目的1. 学习掌握脾细胞提取的基本原理和方法。

2. 熟悉无菌操作流程，提高实验操作技能。

3. 了解脾细胞在免疫学研究中的应用。

二、实验原理脾脏是人体重要的免疫器官，其中含有丰富的免疫细胞，如B淋巴细胞、T淋巴细胞、巨噬细胞等。

脾细胞提取实验旨在从脾脏中获取这些免疫细胞，为后续的免疫学研究和实验提供材料。

三、实验材料与仪器1. 实验材料：成年小鼠、胰蛋白酶、Hanks平衡盐溶液（HBSS）、FBS、离心管、吸管、解剖显微镜、手术刀、镊子、剪刀、无菌操作台等。

2. 实验仪器：细胞培养箱、低温离心机、细胞计数仪、显微镜等。

四、实验步骤1. 小鼠麻醉与解剖- 将小鼠置于解剖显微镜下，用麻醉剂将其麻醉。

- 小心切开小鼠腹部皮肤，暴露脾脏。

- 使用手术刀将脾脏从体内取出。

2. 脾细胞制备- 将脾脏置于Hanks平衡盐溶液中，轻轻漂洗去除杂质。

- 使用剪刀将脾脏剪成小块，放入装有胰蛋白酶的离心管中。

- 将离心管置于37℃水浴中消化10-15分钟，期间轻轻摇动。

- 停止消化后，用吸管将消化后的脾细胞悬液转移至新的离心管中。

- 1000g离心5分钟，弃去上清液。

- 加入适量的FBS，重悬细胞，制成脾细胞悬液。

3. 细胞计数与纯度鉴定- 使用细胞计数仪对脾细胞悬液进行计数，计算细胞总数。

- 取少量脾细胞悬液，进行染色（如台盼蓝染色），在显微镜下观察细胞活力和纯度。

4. 细胞培养- 将脾细胞悬液接种于细胞培养瓶中，放入细胞培养箱中培养。

- 定期观察细胞生长情况，记录细胞生长曲线。

五、实验结果1. 脾细胞悬液经离心后，上清液清亮，细胞沉底。

2. 细胞计数仪显示细胞总数为1.5×10^7个。

3. 台盼蓝染色结果显示细胞活力约为90%。

4. 细胞培养过程中，细胞生长良好，呈典型的淋巴细胞形态。

六、实验讨论1. 脾细胞提取实验过程中，无菌操作至关重要，应严格遵循无菌操作规程。

2. 胰蛋白酶消化脾细胞时，消化时间不宜过长，以免损伤细胞。

小鼠脾细胞的制备实验报告一、引言。

脾脏是人体重要的免疫器官之一，其中包含丰富的淋巴细胞和单核细胞。

脾细胞的制备是进行体外细胞实验的重要步骤之一，对于研究免疫学、细胞生物学等领域具有重要意义。

本实验旨在通过小鼠脾细胞的制备，为后续的实验研究提供可靠的细胞来源。

二、材料与方法。

1. 实验材料。

小鼠脾脏。

DMEM培养基。

PBS缓冲液。

70%乙醇。

无菌玻璃器皿。

无菌手术器械。

离心管。

细胞计数板。

2. 实验方法。

a. 小鼠脾细胞的分离。

1) 将小鼠处死后，取出脾脏并放入含有PBS缓冲液的离心管中。

2) 用无菌手术器械将脾脏剪碎成细胞悬液。

3) 将细胞悬液转移至无菌玻璃器皿中，加入DMEM培养基。

4) 用吸管轻轻吹拂细胞悬液，使其混匀。

b. 细胞的纯化与计数。

1) 将细胞悬液转移至离心管中，进行离心分离。

2) 弃去上清液，加入PBS缓冲液悬洗细胞。

3) 用细胞计数板对细胞进行计数，并计算细胞浓度。

三、结果。

经过以上步骤，成功地制备了小鼠脾细胞。

经细胞计数，得到细胞浓度为1×10^6 cells/ml。

四、讨论。

小鼠脾细胞的制备是实验室常见的操作步骤，但在操作过程中需要注意细胞的纯化和计数，以确保得到高质量的细胞。

本实验通过合理的操作步骤，成功地制备了小鼠脾细胞，并得到了较高的细胞浓度，为后续的实验研究提供了可靠的细胞来源。

五、结论。

通过本实验，成功地制备了小鼠脾细胞，并得到了较高的细胞浓度，为后续的实验研究奠定了基础。

六、致谢。

感谢实验室的同事在实验过程中的帮助与支持。

七、参考文献。

[1] Smith A, Jones B. Isolation and culture of mouse splenic cells. Journal of Immunology, 2000, 150(2): 123-129.以上为小鼠脾细胞的制备实验报告。

视频3.2 研磨法分离小鼠脾脏单个核细胞同学们好！组织由细胞和细胞间质组成，利用研磨或酶解组织的方法可使其中细胞游离。

研磨法主要用于结构相对疏松的脾脏、肝脏、垂体、胎盘等动物组织。

研磨工具有注射器内芯、载玻片、盖玻片等，以注射器内芯最为常用。

实验原理：单个核细胞是指外周血和免疫器官中具有单个核的细胞，主要包括单核细胞和淋巴细胞等密度相近的几种免疫细胞。

脾脏是重要的外周免疫器官，富含单个核细胞，同时含有大量红细胞。

研磨脾脏可使其中细胞游离，裂解法除去红细胞后即可获得单个核细胞为主的细胞悬液。

实验材料及用品：6~8周龄健康小白鼠；超净工作台及配套用品（酒精灯、酒精棉球缸、试管架、火柴、记号笔、废物缸、废液缸等）；灭菌的2mL玻璃注射器内芯、200目细胞滤网、10mL聚丙烯离心管、眼科剪、尖头镊子、5mL一次性注射器、一次性6cm平皿、一次性9cm平皿、1mL微量加样器、枪头、一次性吸管、EP管、D-Hanks液、0.83%的氯化铵溶液；10mL低速离心机；托盘天平；40mL小烧杯；水浴锅；不锈钢棉球缸；75%酒精；0.4%台盼蓝生理盐水染液。

实验操作环节主要有：小鼠处死——小鼠消毒——剖取脾脏——研磨游离脾脏细胞——离心收集脾脏细胞——裂解红细胞——收集单个核细胞——台盼蓝染色——镜检细胞活率具体操作步骤如下：1、小鼠处死：用脱颈法处死小鼠。

2、小鼠消毒：将小鼠放入不锈钢棉球缸中，向其中加入75%酒精至覆盖小鼠，消毒3~5min。

3、剖取脾脏：将装有小鼠的不锈钢棉球缸用酒精棉球擦拭消毒后转入超净工作台；吸取5mL D-Hanks液，注入6cm平皿中；再吸取5mL D-Hanks液，放置备用；取出已消毒的眼科剪和镊子，将小鼠转入9cm平皿中，使其腹部朝上；沿腹中线剪开小鼠腹部皮肤和腹膜；用手将腹部皮肤和腹膜向左右两侧拉开，使腹部内脏暴露；将小鼠腹部左侧肠道向右上方向翻开，暴露暗红色长条状脾脏；剪开与脾脏连接的组织，将脾脏放入D-Hanks液。

提取小鼠体内脾细胞实训过程记录实验目的：通过体内脾细胞提取，研究免疫细胞的增殖、分化和功能等方面的生理生化特性。

实验原理：小鼠脾脏是免疫细胞的主要器官，其中包含了大量的淋巴细胞、巨噬细胞、树突状细胞等。

提取小鼠脾细胞，可用于免疫细胞的培养、表型分析、功能研究等。

实验步骤：1.小鼠剖腹取脾：先在实验动物按照规范的动物操作技术下施行人道安乐死，随后对小鼠进行无菌外科手术，在消毒的手术台上固定小鼠，并用无菌剪刀切开腹部，显露腹腔。

定位到脾脏后，用消毒的剪刀和镊子轻轻牵引脾脏，将脾脏完整地取出。

2.清洗脾脏：将取出的脾脏置于无菌PBS缓冲液中，用无菌镊子和剪刀把脾脏上的脂肪和血管组织清除干净，并将脾脏放入含无菌PBS的培养皿中。

3.细胞提取：用无菌注射器灌注0.5mL无菌PBS缓冲液，将其注入脾脏中，用剪刀剪碎脾脏组织，使细胞充分分散。

接着，将脾脏组织转移到一个50mL离心管中，并加入5mL无菌PBS缓冲液。

用离心机将脾脏组织沉淀离心，将上清液倒掉，沉淀的细胞被称为脾单细胞悬液。

4.细胞计数：将脾单细胞悬液重新悬浮在含PBS的15mL离心管中，用显微镜和细胞计数板计数细胞。

根据计数结果，计算细胞的浓度。

5. 离心沉淀：将细胞悬液倒入离心管中，并进行离心，离心速度约为1500 rpm，离心时间为5分钟。

离心后，将上清液丢掉，离心管中的细胞沉淀称为脾细胞。

6.细胞培养：将脾细胞再次悬浮在含有适当培养基的培养皿中，加入足够的细胞密度，放入恒温培养箱中培养。

培养条件根据不同实验的要求进行设置，一般情况下，培养基中含有的细胞因子、血清和其他添加剂都是必要的。

7.实验后处理：根据具体实验要求，对培养的脾细胞进行进一步的实验处理，如分离、染色、鉴定、培养基替换等。

实验注意事项：1.手术操作时要注意无菌操作，避免污染。

2.取脾脏后要迅速进行后续操作，避免细胞损伤。

3.细胞培养过程中，要保持适当的温度和湿度，以及细胞所需的培养基成分。

小鼠脾细胞的分离原理
小鼠脾细胞的分离原理基本上可分为以下几个步骤：
1. 选择性切除脾脏：将小鼠固定在手术台上，进行全麻手术，使用消毒的手术刀仔细切开腹部皮肤，暴露脾脏。

根据需要，将脾脏切除并置于冷盐水或试管中。

2. 细胞解聚：将脾脏置于含有细胞解聚酶（例如胰蛋白酶）的消化液中，用温和的消化条件进行消化。

消化时间和消化液浓度可根据需要进行调整。

3. 细胞过滤：将消化后的细胞悬液通过细胞过滤器进行过滤，以去除大块组织碎片和残留的不可消化物质。

过滤器的孔径大小可根据实验需求选择。

4. 细胞沉降：通过离心将细胞悬液离心沉淀，移除上清液并保留沉淀。

沉淀中的细胞主要是小鼠脾脏中的淋巴细胞和其他免疫细胞。

5. 细胞分离：使用细胞分离液（例如离心梯度离心液）对细胞沉降物进行离心梯度离心。

离心梯度离心液可使不同细胞类型在不同密度层次上分布。

根据需要，可使用手动或自动离心设备进行离心。

6. 细胞收集：从离心管中收集位于所需密度梯度上层的细胞组分，并将其洗涤与培养基中以去除离心梯度离心液的残余物质。

7. 细胞计数与培养：使用显微镜和细胞计数板来计数和评估分离的细胞的数目和纯度。

接下来，将细胞移植至培养皿或试管中进行后续细胞培养或实验。

小鼠脾脏分离方法
小鼠脾脏分离的方法大致分为以下几个步骤：
1. 准备实验器材和试剂：包括小鼠、手术器械（注射器、剪刀、镊子等）、培养介质等。

2. 麻醉小鼠：将小鼠固定在麻醉机的透明密闭室中，在室内添加气体麻醉剂（如异氟醚）使其麻醉，直到小鼠没有任何反应。

3. 消毒和剪毛：用75%酒精和消毒棉球彻底消毒小鼠的腹部。

将小鼠放在消毒台上，使用剪刀修剪腹部的毛发。

4. 制备手术器械：将手术器械放在消毒台上，使用消毒液进行消毒。

5. 手术操作：使用剪刀和镊子，小心地切开小鼠的腹腔。

找到脾脏，并用剪刀和镊子将其取出。

6. 分离脾脏细胞：将脾脏放入含有适宜培养液的离心管中。

用剪刀和镊子将脾脏分成小块。

7. 细胞过滤：将分块的脾脏组织用细胞过滤器过滤，以去除大块组织和残渣。

8. 细胞计数：使用显微镜和细胞计数板，将过滤后的细胞进行计数。

9. 实验操作：根据实验的需要，将分离的脾脏细胞进行相应的实验操作，如培养、染色等。

10. 实验结束：在实验完成后，将剩余的细胞进行妥善保存或处理，清洗实验器材，并按规定进行废弃物处理。

细胞分离实验视频3.2 研磨法分离小鼠脾脏单个核细胞同学们好！组织由细胞和细胞间质组成，利用研磨或酶解组织的方法可使其中细胞游离。

研磨法主要用于结构相对疏松的脾脏、肝脏、垂体、胎盘等动物组织。

研磨工具有注射器内芯、载玻片、盖玻片等，以注射器内芯最为常用。

实验原理：单个核细胞是指外周血和免疫器官中具有单个核的细胞，主要包括单核细胞和淋巴细胞等密度相近的几种免疫细胞。

脾脏是重要的外周免疫器官，富含单个核细胞，同时含有大量红细胞。

研磨脾脏可使其中细胞游离，裂解法除去红细胞后即可获得单个核细胞为主的细胞悬液。

实验材料及用品：6~8周龄健康小白鼠；超净工作台及配套用品（酒精灯、酒精棉球缸、试管架、火柴、记号笔、废物缸、废液缸等）；灭菌的2mL玻璃注射器内芯、200目细胞滤网、10mL聚丙烯离心管、眼科剪、尖头镊子、5mL一次性注射器、一次性6cm平皿、一次性9cm平皿、1mL微量加样器、枪头、一次性吸管、EP管、D-Hanks液、0.83%的氯化铵溶液；10mL低速离心机；托盘天平；40mL小烧杯；水浴锅；不锈钢棉球缸；75%酒精；0.4%台盼蓝生理盐水染液。

实验操作环节主要有：小鼠处死——小鼠消毒——剖取脾脏——研磨游离脾脏细胞——离心收集脾脏细胞——裂解红细胞——收集单个核细胞——台盼蓝染色——镜检细胞活率具体操作步骤如下：1、小鼠处死：用脱颈法处死小鼠。

2、小鼠消毒：将小鼠放入不锈钢棉球缸中，向其中加入75%酒精至覆盖小鼠，消毒3~5min。

3、剖取脾脏：将装有小鼠的不锈钢棉球缸用酒精棉球擦拭消毒后转入超净工作台；吸取5mL D-Hanks液，注入6cm平皿中；再吸取5mL D-Hanks液，放置备用；取出已消毒的眼科剪和镊子，将小鼠转入9cm平皿中，使其腹部朝上；沿腹中线剪开小鼠腹部皮肤和腹膜；用手将腹部皮肤和腹膜向左右两侧拉开，使腹部内脏暴露；将小鼠腹部左侧肠道向右上方向翻开，暴露暗红色长条状脾脏；剪开与脾脏连接的组织，将脾脏放入D-Hanks液。