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第11章 生物素-亲合素放大技术

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9章生物素亲和素

9章生物素亲和素

物－活化生物素 (生物素化衍生物)
生物素活化
标记蛋白质醛基的活化生物素
标记蛋白质巯基的活化生物素
活化生物素易 与抗原、抗体 酶及核酸分子 中相应基团偶 联形成生物素 化标记物
标记蛋白质氨基的活化生物素
标记核酸的活化生物素
三、生物素标记蛋白质
1. 标记方式 生物素化蛋白质衍生物有二类： 一种是生物素化的大分子生物活性物 质（如生物素化抗原、抗体） 另一种是标记材料（如酶）结合生物 素后制成的标记物（如生物素 化酶）。
亲和素与链霉亲和素不同点
特点 等电点 分子量(KD) 是否有糖基 非特异吸附

AV 10.5 67 有 多
SAV 6 .0 65 无 少
三、SA和SAV的标记物 几乎所有用于标记的物质均可以同AV和 SAV结合， 125I、胶体金、荧光素、化学发光物 等 小分子物质 酶、抗原、抗体等大分子物质


BAS技术基本类型
1.BAB法（biotin--avidin bind，BAB ）， 也称为桥联亲和素－标记生物素法 （BRAB） 2.标记亲和素-生物素法（BA） （labeledavidin-biotin，LAB）


BAS技术基本类型
BAB法


（biotin--avidin bind，BAB）
及既可偶联生物大分子，又可连接荧光
素、酶等标记材料的特性，使该系统在
标记免疫分析技术领域中的应用具有很
强的稳定性和适用性。
第二节

生物素的理化性质及其标记物
一、生物素的特性 生物素（biotin，B）又称维生素H，辅酶R 分子量-----244.31 广泛分布于动、植物组织中，常从含 量较高的卵黄和肝组织中提取。生物素分 子有两个环状结构
猪肉中氯霉素残留的生物素-亲和素放大免疫检测方法

猪肉中氯霉素残留的生物素-亲和素放大免疫检测方法

０ ５ 、０ 、 ０ 和 ３ 的 血 清 和 ０ １ 和 １ 的 、 １ ％ ２ ％ ０ ．％
Ｂ Ａ 按照 （） 骤反应 。 Ｓ １步
霉素从 ２ ０ ０ ０年 《 国兽 药典 》 中 巾删 除 ， 于 ２ ０ 并 ０ ２年 ３ ５日发布 的“ 品 动物 禁用 的兽 药及 其 他 化合 月 食 物清 单” Ｃ 中， ＡＰ被 禁 止 所 有 用 途 用 于食 品 动 物 。 欧美 等发达 国家 已相 继禁止 或严格禁 止使用 。
种 检 测 系 统 。 目前 ， ＡＳ技 术 在 兽 药 残 留 检 测 中 Ｂ 已有 研 究 报 道 ， 在 生 物 学 领 域 已 经 得 到 广 泛 应 ］而
用 ， 为当今生物 医学 研究 工 作 中最具 使 用 价值 和 成
发展前途 的技术之一 ｌ 。 ５。
氯霉 素（ ＡＰ 残留 问题 已引起 国际组织和 世界 Ｃ ）
配 制系 列稀 释 的 Ｃ ＡＰ标 准 品 ， 采
用 方 阵 法 确 定 包 被 原 和 一 抗 的 最 适 浓 度 ， 以 此 浓 再
度， 根据 Ｏ Ｄ值和 Ｉ ｃ。 确定本 方法 的其他 条件 。（ ） １
Ｃ ＡＰ包 被 原 ｉ ０ Ｌ ／ ｌ ３ ℃ 反 应 一 定 时 间 。洗 ０ ｗｅ ， ７ ｌ 液 洗 ３ ， 遍 间 隔 １ ２ｍｉ 。 （） 闭 液 １ ０ Ｌ 遍 每 ～ ｎ ２封 ０ ／
文章 编 号 ：５ ９６ ０ （ ０ ０ ０ —０ ４０ ０ ２ — ０ ５ ２ １ ） ７０ ５ — ２
生 物 素一 和 素 放 大 免 疫 检 测 方 法 是 在 常 规 免 亲 疫 检 测 的基 础 上 Ｌ ］ 结 合 生 物 素一 和 素 系 统 （ ｉ １ ， 。 亲 ｂ ｏ
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生物素-亲和素预定位技术在肿瘤诊断和治疗中的应用

生物素-亲和素预定位技术在肿瘤诊断和治疗中的应用


步法 、 ４步法和 ５步法等。多步法是在 ２步 法原 理的基础上 ， 由于需要清除体 内相关的影响因子， 而选择不 同的清除剂而
收稿 日期 ： ０ —２１ ２ ９１ ７ ０ 基金 项 目 ： 国家 自然科 学 基 金 面 上项 目 ： ６０ ８ ３ ７ ５４ ０
２ ０年 ２月第 １ ０１ ７卷 第 ｌ
５ ７
・
综
述 ・
生 物 素 ． 和 素 预 定 位 技 术 在 亲 肿 瘤 诊 断 和 治 疗 中 的应 用
邓新 荣 杜 ， 进。 罗志福 ，
（． １ 中国 原子 能科 学研 究 院 同位 素 研 究 所 ， 京 １２ １ ；． 北 ０４ ３ ２ 中国 同位 素 有 限公 司 ， 京 １０４ ） 北 ０ ０ ５ 用中具有 广泛 的应用前景。利用其作 用特点进 行肿瘤 显像诊 断和靶
向治 疗 的 研 究 是一 个 热 点 。 ２ 生 物 素一 亲和 素 系 统预 定 位 技 术 在肿 瘤 显 像 和 治 疗 中
应 用 的研 究现 状
肿瘤组织的浓聚 ， 提高了药物的有效性并减少 了毒副作用 。 预定位技 术 的 机 理 主 要 依 据 两 类 反 应 ： 和 素 （ 白素 ， 亲 卵
ａｉ ｎＡ） ｖ ｉ， 或抗 生 物 素 蛋 白链 菌 素 （ 霉 亲 和 素 ） ｓ ｅｔ ｉｉ， ｄ 链 （ｔ ｐａ ｄｎ ｒ ｖ
旦结合后很难分离 。但 当生 物素或 亲和 素的活性 受到 损
伤时 。 其结 合能 力 会 下 降 ０ 。
１２ 生物素 ． 亲和 素 系统的 特点
Ｂ Ｓ既 可偶 联 抗 体 等一 系列 大 分 子 活 性 物 质 ， 可 被 酶 Ａ 又
肿 瘤 预定 位 显 像 和 治 疗 的 具 体 方 案 可 以 分 为 ２步 法 、 ３
主管检验师临床医学检验免疫学和免疫检验 第十一章 生物素-亲和素放大技术

主管检验师临床医学检验免疫学和免疫检验 第十一章 生物素-亲和素放大技术

第十一章生物素-亲和素放大技术第一节生物素的理化性质与标记生物素（biotin）、亲和素（avidin）是一对具有高度亲和力的物质，它们的结合迅速、专一、稳定并具有多级放大效应。

生物素-亲和素系统（BAS）是一种以生物素和亲和素具有的多级放大结合特性为基础的实验技术，它既能偶联抗原抗体等大分子生物活性物质，又可被荧光素、酶、放射性核素等材料标记。

生物素（biotin，B）广泛分布于动、植物组织中，常从含量较高的卵黄和肝组织中提取。

一、活化生物素利用生物素的羧基加以化学修饰可制成各种活性基团的衍生物，称为活化生物素。

生物素活化后，可容易地与各种抗原、抗体、酶及核酸分子中相应基团偶联形成生物素化标志物。

（一）标记蛋白质氨基的活化生物素此种活化生物素的制备方法是将生物素与N-羟基丁二酰胺在碳二亚胺的作用下进行缩和，生成生物素N-羟基丁二酰亚胺醣（BLAHS）。

BLAHS分子酯键中的—C-=0基团可与蛋白质分子中赖氨酸的氨基形成肽键。

从而使蛋白质标记上生物素。

（二）标记蛋白质醛基的活化生物素用于此类标记的活化生物素有两种：生物素酰肼（BHZ）和肼化生物胞素（BGHZ）。

BHZ是水合肼与生物素的合成物，主要用于偏酸性糖蛋白的生物素标记。

（三）标记蛋白质巯基的活化生物素3-（N-马来酰亚胺-丙酰）-生物胞素（MPB）是能特异地与蛋白质巯基结合的活化生物素试剂。

（四）标记核酸的活化生物素活化生物素可通过缺口移位法、化学偶联法、光化学法及末端标记法等技术使生物素的戊酸侧链通过酰胺键与核酸分子相连，构成生物素标记的核酸探针。

二、生物素标记蛋白质（一）生物素化蛋白质衍生物的特性生物素化蛋白质衍生物有两类：1.生物素化的大分子活性物质，如抗原、抗体。

2.标记材料（如酶）结合生物素后制成的标志物。

（二）标记方法1.标记抗体、抗原选用第二抗体进行生物素标记，制备的标志物具有通用性。

2.标记酶生物素标记辣根过氧化物酶第二节亲和素、链霉亲和素的理化性质与标记亲和素和链霉亲和素是生物亲和素的天然特异性结合物。

亲和素和生物素系统

亲和素和生物素系统


标记亲和素-生物素法（labeled avidin biotin，LAB）
• 将亲和素与标记酶（HRP）结合，一个亲和素可 结合多个HRP
• 将生物素与抗体（一抗或二抗）结合，一个抗体 分子可连接多个生物素分子
• 细胞的抗原（或通过一抗）先与生物素化的抗体 结合，继而将酶标记亲和素结合在抗体的生物素 上，如此多层放大提高了检测抗原的敏感性。
• 抗体分子经生物素化后，其结合抗原的能 力不受损失，细胞经生物素化后仍能保持 正常的分裂、增殖能力，因此被用作抗体、 细胞的标记。
亲和素
• 亲和素（avidin）是一种分子质量为 68000Da的一、胶体 金等，结合的能力。
• 生物素和亲和素之间有极强的亲和力，比 抗体对抗原的亲和力要高出100 万倍。
物素标记抗体结合。由于采用了改良的亲 和纯化技术和酶标技术，LSAB 法敏感性更 高、背景更清晰。
演讲结束，谢谢大家支持
附PPT常用图标，方便大家提高工作效 率
生活
图标元素
医疗
图标元素
• 亲和素有4 个亚单位，它具有4 个同生物素 亲和力极高的结合位点，因其能使生物素 失活，故又称抗生物素。
链霉亲和素
• 链霉亲和素（streptavidin ）是一种从链霉 菌培养物中提取的蛋白质，相对分子质量 60000，且不含糖链。
• 同亲和素一样，链霉亲和素也具有4个生物 素结合位点，亲和力高达10－15 mol/L，是 一种更完美的生物素结合蛋白。因为它很 少有低聚糖残余成分，可保持中性等电点， 避免了组织中的非特异性染色。
• ABC 复合物不能饱和，即亲和素上的4 个结合位 点最多允许3 个位点与生物素化酶结合，留1~2 个位点与生物素化二抗结合。
• 抗原先后与特异性一抗、生物素化二抗、ABC 复 合物结合，最终形成巨大复合体，因该复合体网 络了大量酶分子，从而提高了检测的灵敏度。
生物素亲和素

生物素亲和素




分子式：C10H16O3N2S 分子量：244.31 等电点：PH=3.5 溶解特性：难溶于水，易 溶于二甲基甲酰胺(DMF) 两个环状结构： I环（咪唑酮环）为与亲 和素结合的主要部位； II环（噻吩环）为结合抗 体和其它生物大分子的部 位，C2上戊酸侧链的未端 羧基是结合生物大分子的 唯一结构
分子量：68 000
比活性：A≥12u/mgP


亲和常数：1015/mol
生物素酰肼(BHZ)：水合肼与生物素的合成物 主要用于标记偏酸性糖蛋白 肼化生物胞素(BCHZ) ：生物素与赖氨酸连接后， 再与无水肼反应而成。 除醛基外， BCHZ还可标记氨基
标记特点：BHZ与蛋白质中的 醛基结合而标记
马来酰亚胺-丙酰-生物胞素（MPB)：
能特异地与蛋白质巯基结合的活化生物素
活化生物素可克服以上缺点，既减少空间位阻 效应，又可扩大其结合的对象。
生物素侧链的末
端羧基经化学修
饰后制成带各种 活性基团的衍生
物－活化生物素
(生物素化衍生 物)
标记蛋白质氨基的活化生物素
N-羟基丁二酰亚胺酯（BNHS） 长臂活化生物素（BCNHS）
活化生物素易 与抗原、抗体 酶及核酸分子 中相应基团偶 联形成生物素 化标记物
注意事项：

选择活化生物素：依抗原或抗体分子所带可标记基 团的种类（氨基、醛基或巯基）以及分子的酸碱性；
控制生物素：蛋白质比例 生物素：IgG 用量比(mg/mg)宜为2:1，IgG应用浓度 0.5~5μg/ml；生物素1~3个/Ag，3~5个/Ab； 使用交联臂减少空间阻力


概念：是动物微生物中提取的一种含10%碳水化物的碱性糖 蛋白，可由蛋清中提取。 主要包括：卵白亲合素、链亲合素、卵黄亲合素及类亲合素 等。后两种因其特异性亲合力低，研究不多，前两种目前已 深入研究并得到广泛应用。 结构：4个相同亚基组成的四聚体糖蛋白，富含色氨酸，它 是与生物素结合的基团。
主管检验师资格考试临床免疫学和免疫检验 复习习题 第十一章 生物素-亲和素放大技术(附答案解析)

主管检验师资格考试临床免疫学和免疫检验 复习习题 第十一章 生物素-亲和素放大技术(附答案解析)

主管检验师资格考试临床免疫学和免疫检验复习习题第十一章生物素-亲和素放大技术（附答案解析）一、A1型题1、每个亲和素能结合生物素分子的数目是（）A、4B、2C、1D、3E、82、以下关于生物素-亲和素系统（BAS）的说法错误的是（）A、1个亲和素分子可结合4个生物素分子B、1个生物素分子可以结合多个亲和素分子C、生物素易与抗体、酶、多聚核苷酸结合D、亲和素易与酶、铁蛋白、荧光素、核素结合E、亲和素和生物素.有极强的亲和力3、免疫组化技术的优点不包括（）A、高特异性B、高敏感性C、形态学的直观性D、精确定量分析E、能对抗原表达情况进行分析4、BAS在ELISA技术中应用最广泛的反应模式是（）A、ABAB、ABCC、BRABD、BAE、LAB5、免疫组化染色前，对标本进行固定的目的是（）A、保存组织细胞的抗原性B、防止细胞脱落C、防止细胞自溶D、终止胞内酶的活性E、使细胞内蛋白质凝固6、ABC-ELISA将酶标记在（）A、亲和素B、生物素C、抗体D、补体E、抗原7、关于亲和素-生物素系统的错误描述是（）A、用于间接包被B、用于终反应放大C、用于酶免疫测定D、用于胶体金测定E、不用于荧光免疫测定8、ABC-ELISA将酶标记在（）A、亲和素B、生物素C、抗体D、补体E、抗原9、关于生物素标记蛋白质的注意事项，下列说法错误的是（）A、根据抗原或抗体分子结构中所带可标记基团的种类以及分子的理化性质，选择相应的活化生物素和反应条件B、活化生物素与待标记抗原或抗体可以为任意比例C、在生物素与被标记物之间加入交联臂样结构可减少空间位阻影响D、生物素与抗原、抗体等蛋白质结合后，不影响后者的免疫活性E、生物素标记酶时会影响其免疫活性10、亲和素和生物素结合的特点是（）A、免疫反应B、不属于免疫反应C、特异性弱D、亲和力小E、不够稳定二、B型题1、 A.ABCBC.BABD.直接法BASE.间接法BAS<1> 、标记亲和素-生物素的方法为（）；<2> 、亲和素-生物素化酶复合物技术为（）；<3> 、生物素化第二抗体为（）；<4> 、生物素化第一抗体为（）。

生物素亲和素

生物素亲和素

生物素亲和素篇一：生物素标记蛋白操作方法下面的操作方法可以使约3－5分子的生物素与1分子的蛋白结合，对某些蛋白来说，生物素与蛋白的分子比可根据不同的生物素化要求进行调整。

1、溶解2－10mg蛋白于1ml的BuphTm磷酸盐缓冲液中，并计算溶解的毫摩尔数。

如果蛋白含有不恰当的缓冲液（如Tris或者甘氨酸），可以通过在PBS中透析或浓缩的方法除去。

计算：蛋白质量（mg）/蛋白分子量（MW）＝蛋白质的毫摩尔数。

2、在打开之前，平衡生物素至室温。

加2mgSulfo-NHS-Biotin于100ul超纯水中，加入足够量浓度的生物素，一般对于10mg/ml蛋白来说超过12倍分子数，对于2mg/ml蛋白溶液应超过20倍，或者该试剂也可以直接以粉末的形式加入蛋白溶液中。

（见下表）3、室温30分钟，或冰上放置2小时。

4、用30mlPBS预洗纯化柱，上样，加入与欲收集量相同的缓冲液，收集0.5ml或1ml于单独的管中。

5、以280nm的吸收值测定蛋白含量。

6、生物素化的蛋白4℃存放至使用，可加入叠氮钠、甘油等保存。

HABA法检测生物素标记效果试剂配制：①PBS（100mM磷酸盐，150mMNaclPH7.2）②HABA/亲和素溶液：10mg亲和素、600ul10mMHABA于19.4ml的PBS中，该溶液的A500大约在0.9-1.3之间，溶液于4℃保存可稳定2周。

如果有沉淀形成（HABA溶液）可过滤后使用。

比色法检测生物素/蛋白质摩尔质量比：1、吸取900ulHABA/亲和素溶液于1ml比色杯。

2、测定该溶液在500nm处的'吸收值并记录为“A500HABA/Avidin”。

3、吸取100ul生物素标记的蛋白于杯中并测定500nm的吸光度值，记为A500HABA/Avidin/Biotin(数值必须恒定15s以上)如果A500HABA/Avidin/Biotin的值不超过（≤）0.3，重新稀释待测样品并检测。

生物素-亲和素

生物素-亲和素


该技术将BA技术与免疫印迹技术相结合,进一
步提高检测灵敏度。
免疫印迹技术是在蛋白凝胶电泳和固相免疫
测定基础上发展起来的一种新的免疫学技术。是 凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异性、 敏感性、稳定性及可重复性的有机结合。
5. BA -组织化学技术
利用BA 技术将染料浓聚于靶细胞表面， 使其更利于观察， 提高了检测灵敏度。 Xia Y1 等在生物素化黑皮质素与黑色素瘤
性。用于标记蛋白质醛基、巯基和糖基的衍生 物有生物素酰肼（BHZ）及肼化生物素 （BCHZ）。
亲和素（ Avidin ）－抗生物素蛋白、抗生物素
是从鸡蛋清中提取的一种糖蛋白， 它由四个相同的氨基酸亚基组成， 亚基之间通过二硫键连接，亲和素 的每一个亚基含有一个与生物素结 合的位点，并与生物素或其衍生物 形成高度稳定的复合物。
1. BA-酶免疫技术
原理
亲和素可预包被在酶标板孔内，然后再 将生物素化抗体Ab(或抗原Ag)包被于孔
内。通过BA将免疫复合物与酶连接起来，
能有效地放大EIA法，使其灵敏性增强。
优点
生物素对抗体和酶的标记率高，又不影响其 他活性。 生物素亲和素的结合极为稳定，不会在孵育 和各种洗涤过程中脱落。 每个亲和素分子能结合4个生物素，能耦合 更多的联结生物素的酶分子，提高EIA的敏感 性。
۞ Morag
G.等使用硝基-(链霉)亲和素吸附于分离柱 上,分离提纯兔抗血清中的免疫球蛋白、抗-转移因 子等,每一例均可在解离生物素化探针后,恢复分离 柱的生物学特性。
۞在制备特异性破骨细胞cDNA库时,加入 生物素化的mRNA,然后通过固相亲和素提取。 用斑点印迹法分析,发现在此提取物中, 高度聚集了特异性破骨细胞cDNA。
生物素-亲和素免疫放大技术

生物素-亲和素免疫放大技术

第十一章生物素 -亲和素免疫放大技术一、生物素 - 亲和素系统的特点灵敏度高，特异性好，稳定性高，适用广泛。

二、生物素的理化性质与标记（一）生物素及其活化1.标记蛋白质氨基的活化生物素N- 羟基丁二酰亚胺酯（ BNHS）2. 标记蛋白质醛基的活化生物素酰肼（BHZ）和肼化生物胞素（BCHZ）3.标记蛋白质巯基的活化生物素3- （ N-马来酰亚胺 - 丙酰） - 生物胞素（ MPB）4.标记蛋白质核酸的活化生物素常用于标记核酸分子的活化生物素有光生物素、生物素脱氧核苷三磷酸、BNHS和 BHZ。

（二）生物素标记蛋白质生物素化蛋白质衍生物的特性生物素化蛋白质衍生物有两类：一种是生物素化的大分子生物活性物质（如抗原、抗体），另一种是标记材料（如酶）结合生物素后制成的标记物。

标记方法：（ 1）标记抗体、抗原：常用于标记抗体的活化生物是BNHS；对于偏酸性的抗原，标记时多采用 BHZ。

（ 2）标记酶：以生物素标记HRP为例。

标记注意事项：（ 1）应根据抗原或抗体分子结构中所带可标记基团的种类以及分子的理化性质，选择相应的活化生物素和反应条件；（2）标记反应时，活化生物素与待标记抗原或抗体应有适当的比例；（3）为减少空间位阻影响，可在生物素与被标记物之间加入交联臂样结构；（4）生物素与抗原、抗体等蛋白质结合后，不影响后者的免疫活性；标记酶时则结果有不同。

三、亲和素、链霉亲和素理化性质与标记1.亲和素及其活性：活性基团 - 色氨酸。

2.链霉亲和素及其活性：活性基团- 色氨酸。

3.亲和素、链霉亲和素的标记：最常用的是酶、FITC 和胶体金。

亲和素的标记（链霉亲和素的标记）（1） HRP-亲和素结合物的制备：改良过碘酸钠法，戊二醛法；（2）亲和素 - 生物素化HRP复合物的制备；（3）亲和素 - 生物素化碱性磷酸酶复合物的制备。

四、生物素 - 亲和素系统的应用1.生物素 - 亲和素系统基本类型及原理：基本类型有两种，一类以游离亲和素为中间物，分别连接包含生物素大分子的待检反应体系和标记生物素，称为BAB法；后来又在此基础上发展了亲和素 - 生物素化酶复合物技术（ ABC）。

生物素-亲和素标记技术完整讲解剖析

生物素-亲和素标记技术完整讲解剖析


4.2 在分子生物学中的应用
不对称PCR
低浓度引物 高浓度引物
4.2 在分子生物学中的应用 Southern 印迹杂交
4.2 在分子生物学中的应用
分子分子杂交的基本类型
固相杂交 液相杂交 原位杂交 基因芯片
4.2 在分子生物学中的应用
分子杂交的基本类型
液相杂交 将参加液相杂交的两条核酸链都游离在 溶液中，在一定条件下（溶液的离子强度 、温度、时间等）进行杂交，然后再将未 杂交的探针除去，即得到杂交后的核酸分 子。
三 实验方法及步骤
生物素-亲和素标记技术的主要方法 ：
（1）桥-亲和素-生物素标记法（BAB法） （2）亲和素-生物素-过氧化物酶法（ABC法） （3）标记生物素-抗生物素法 （ LAB法）
（1）桥-亲和素-生物素标记法（BAB法）
桥-亲和素-生物素标记法(bridged avidin-biotin technique，BAB)分为直
生物素-亲和素标记技术
第一组
一 背景 二 原理 三 实验方法及步骤 四 应用 五 反应特点 六 应用前景
一 背景
生物素：
又称维生素H 、辅酶R，是水溶性维生素，也属于维生素B族。
1936年，两位德国科学家Kogl和Tonnis从煮熟的鸭蛋黄中 分离提取出一种结晶物质，是酵母生长所必需的，称之为 “生物素”。生物素厂泛存在于自然界的各种生物中,是人类 和动物维持健康不可缺少的要素，并因而得名。因其在食物 中的分布很广，几乎每种食物中都含有少量的生物素，加之 人体每日的所需量又很少,所以，人们一般都不缺乏这种维生 素。
直接法步骤
（2）亲和素-生物素-过氧化物酶法 （ABC法）
即亲和素-生物素-过氧化物酶法(avidin-biotin complex technology，ABC)，其原理是预先按一定比例将亲和素(或链霉亲和 素)与酶标生物素结合，形成可溶性的亲和素(或链霉亲和素)-生物素 -过氧化物酶复合物，当其与检测反应体系中的生物素化一抗（直接 法）或生物素化二抗（间接法）相遇时，复合物中未饱和的亲和素 (或链霉亲和素)结合部位即可与抗体上的生物素结合。在亲和素-生 物素-过氧化物酶复合物形成时，一个标记了生物素的酶分子可通过 其生物素连接多个亲和素(或链霉亲和素)分子，一个亲和素(或链霉 亲和素)分子又可桥联多个酶标生物素分子，这样就形成具多级放大 作用的晶格样网状结构，其中网络了大量酶分子。ABC法背景染色淡， 方法简单，节约时间，可用于双重或多重免疫染色，尤其在组织切片 和细胞悬液中抗原的检测和亚细胞水平定位分析中应用较广。

生物素-亲和素系统相关技术3


3、BAS在放射免疫技术中的应用
4、
BAS在分子生物学中的应用
免疫-PCR
免疫PCR是在ELISA的基础上建立起来 的新方法，用PCR扩增代替ELISA的酶催化 底物显色。
PCR具有很强的放大能力，其可以定量 地检测DNA和RNA，具有非常高的敏感性和 特异性，因此，将与抗原结合的特异抗体通 过连接分子与DNA结合，再经PCR扩增，由 此定量检测抗原使敏感性高于ELISA和RIA。
PCR技术具有高度的灵敏性
PCR产物每轮循环增加一倍
30轮循环
扩增量达230个拷贝（109拷贝）
二、免疫PCR的发展
免疫PCR技术目前尚处于研究阶段，应用的
还不多；
实验表明免疫PCR的敏感性比ELISA高105倍，
且PCR产生的背景信号很弱，可以检测到几 百个分子的抗原，在理论上免疫PCR可以检 测到一个分子抗原，因此，免疫PCR特别适 用于检测一些含量特别少的抗原分子。
1.标记蛋白质氨基：N-羟基丁二酰亚胺酯
（BNHS）、长臂活化生物素（BCNHS）。
2.标记蛋白质醛基：酰肼（BHZ）和肼化生
物胞素（BCHZ）。
3.标记蛋白质巯基：3-（N-马来酰亚胺-丙酰）
-生物胞素（MPB）。
4.标记核酸：光生物素、生物素脱氧核苷三
磷酸、BNHS和BHZ。
1.标记蛋白质氨基：N-羟基丁二酰亚胺酯
降低ALP的活性。
活化生物素可与不同的大分子物质结合，应
根据可标记基团的种类及特性，选择相应的
活化生物素；
抗体：BNHS
偏酸性抗原：BHZ
核酸：光生物素
一个蛋白质分子可联结多个生物素分子，即
生物素化大分子具有多价性，它是BAS多级 放大作用的物质基础。

生物素-亲和素标记技术完整讲解


直接法：
+ B-E + A
ABC
+ABC
Ab-Ag-Ab-B + ABC
Ab-Ag-Ab-B-ABC
直接法 间接法
（3）标记生物素-抗生物素法
标记亲和素-生物素法(labeled avidin-biotin， LAB)直接法是以标记亲和素(或链霉亲和素)直接 与免疫复合物中的生物素化一抗连接进行酶呈色 反应，间接法是采用生物素化的二抗和抗原结合， 由于加入了二抗，较直接法检测灵敏度要高，对 免疫细胞中免疫球蛋白的定位具有特异性。LAB 法需以生物素标记一抗，应用不如ABC法普遍， 与ABC法相比，LAB法操作较简单，但灵敏度较 低
亲和素：
亲和素是一种糖蛋白，可由蛋清中提取。分子量60kD， 每个分子由4个亚基组成，可以和4个生物素分子亲密结合。 亲和素与生物素的结合，虽不属免疫反应，但特异性强，亲和力大， 两者一经结合就极为稳定。由于1个亲和素分子有4个生物素分子的 结合位置，可以连接更多的生物素化的分子，形成一种类似晶格的复合体。 因此把亲和素和生物素与ELISA偶联起来，就可大大提高ELISA的敏感度。
直接法步骤
（2）亲和素-生物素-过氧化物酶法 （ABC法）
即亲和素-生物素-过氧化物酶法(avidin-biotin complex technology，ABC)，其原理是预先按一定比例将亲和素(或链霉亲和 素)与酶标生物素结合，形成可溶性的亲和素(或链霉亲和素)-生物素 -过氧化物酶复合物，当其与检测反应体系中的生物素化一抗（直接 法）或生物素化二抗（间接法）相遇时，复合物中未饱和的亲和素 (或链霉亲和素)结合部位即可与抗体上的生物素结合。在亲和素-生 物素-过氧化物酶复合物形成时，一个标记了生物素的酶分子可通过 其生物素连接多个亲和素(或链霉亲和素)分子，一个亲和素(或链霉 亲和素)分子又可桥联多个酶标生物素分子，这样就形成具多级放大 作用的晶格样网状结构，其中网络了大量酶分子。ABC法背景染色淡， 方法简单，节约时间，可用于双重或多重免疫染色，尤其在组织切片 和细胞悬液中抗原的检测和亚细胞水平定位分析中应用较广。

第三版免疫学检验技术第章中级试题及答案

第九章酶免疫技术 一、A1 1、下图所示的为哪一种ELISA 技术的反应原理示意图（）。

A 、双抗原夹心法B 、双位点一步法C 、间接法测抗体D 、竞争法E 、捕获法 2、钩状效应是指用ELISA 一步法测定标本中待测抗原时，抗原浓度过（），实测值偏（）的现象，极易造成假阴性A 、低，高B 、高，高C 、高，低D 、低，低E 、高，不变3、ELISA 试验中最常用的标记酶是（）。

A 、AST B 、HRPC 、ACPD 、LDHE 、ALT 4、酶增强免疫测定技术是最早取得实际应用的（）。

A 、均相酶免疫测定B 、异相酶免疫测定C 、固相酶免疫测定D 、液相酶免疫测定E 、固相-液相酶免疫测定 5、利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体的方法，通常称为（）。

A 、双抗体夹心法B 、双位点一步法C 、间接法D 、竞争法E 、捕获法6、ELISA 中最常用的固相载体是（）。

A 、聚氯乙烯B 、聚苯乙烯C 、三聚氧胺D 、琼脂糖E 、尼龙膜 7、均相酶免疫测定不具有的特点是（）。

A 、常用于半抗原和小分子的检测B 、操作简便，易于自动化C 、不易受样品中的内源性酶的干扰D 、酶与抗原结合后仍保留酶和抗原的活性E 、灵敏度不及异相酶免测定 8、酶增强免疫测定技术（EMIT ）是一种（）。

A 、非均相酶免疫测定技术B 、均相酶免疫测定技术C 、酶免疫组织化学技术D 、酶免疫测定与电泳相结合的技术 E 、电泳技术9、ELISA 板包被后，最常用的封闭物质是（）。

A 、人白蛋白B 、人球蛋白C 、牛血清白蛋白 D 、牛血清球蛋白 E 、鼠白蛋白10、可用免疫渗滤试验和免疫层析试验检测的项目没有（）。

A 、抗HCV B 、HIV C 、HCG D 、HBsAg E 、HAV11、制备抗体酶结合物的方法通常采用（）。

A 、戊二醛交联法 B 、糖原染色法 C 、免疫印迹法 D 、酶耦联测定法 E 、捕获竞争法12、下列不属于ELISA 测定方法中所必需的试剂（）。

生物素-亲合素系统

生物素-亲合素系统生物素－亲合素系统（Biotin-Avidin—System，BAS）是70年代末发展起来的一种新型生物反应放大系统。

随着各种生物素衍生物的问世，BAS很快被广泛应用于医学各领域。

生物素亲合素系统1979年Guesdon利用生物素和亲合素间具有高度亲合力的特点，建立了标记亲合素和生物素法（LAB／BA）与桥联亲合素—生物素技术（BRAB）。

1981年Hsu首次报告了改进的亲合素—生物素—过氧化酶复合物法（ABC法）。

近年大量研究证实，生物素—亲合素系统几乎可与目前研究成功的各种标记物结合，如酶、荧光素、同位素、凝集素、铁蛋白、S PA等。

生物素—亲合素与标记试剂高亲合力的牢固结合及多级放大效应，使BAS免疫标记和有关示踪分析更加灵敏。

BAS已成为目前广泛用于微量抗原、抗体定性、定量检测及定位观察研究的新技术。

BAS用于检测的基本方法可分为三大类。

第一类是标记亲和素连接生物化大分子反应体系，称BA法，或标记亲和素生物素法(LAB)。

第二类以亲和素两端分别连接生物素化大分子反应体系和标记生物素，称为BAB法，或桥联亲和素-生物素法(BRAB)。

第三类是将亲和素与酶标生物素共温形成亲和素-生物素-过氧化物酶复合物，再与生物素化的抗抗体接触时，将抗原-抗体反应体系与ABC标记体系连成一体，称为ABC法。

尽管方法很多，但在目前国内主要还是BAS-ELISA法。

特别是其中的BA法和ABC法用得较多。

至于其它标记材料(如荧光素、铁蛋白和血蓝蛋白等) 的BAS检测系统，只要制备或得到了相应标记物，再根据B AS的基本原理及基本方法即可自行探索建立实验程序。

BAELISA原理BA-ELISA是在常规ELISA原理的基础上，结合生物素(B)与亲和素(A)间的高度放大作用，而建立的一种检测系统。

亲和素是卵白蛋白中提取的一种碱性糖蛋白，分子量为68kD a，由4个亚单位组成，对生物素有非常高的亲和力(结合常数高达1015M-1)。

生物素-亲和素系统试剂及其应用的研究

生物素-亲和素系统试剂及其应用的研究
章谷生
【期刊名称】《医学研究杂志》
【年(卷),期】1989(000)006
【摘要】近年来,利用生物素(biotin)与亲和素(avidin)之间高度的亲合力,以及它们既可偶联抗体等大分子生物活性物质,又可被酶等多种材料所标记的特性,研制成一种新型生物反应放大系统,即生物素-亲和素系统(biotin-avidin sys-tem,BAS),藉以建立多种高灵敏度、高特异性、高度稳定、方便易行的生物反应检测和分离纯化手段。

【总页数】2页(P1-2)
【作者】章谷生
【作者单位】
【正文语种】中文
【中图分类】R
【相关文献】
1.生物素—链霉亲和素系统试剂在检测HBsAg中的应用 [J], 程振球;朱晴晖
2.生物素—亲和素系统试剂在检测乙酰胆碱受体抗体上的应用 [J], 肖保国;李绍康
3.DNA探针的生物素标记试剂研究——Ⅱ.生物素化补骨脂素的合成和应用 [J], 王来新;邱淑燕;王春光;王申五;张礼和
4.不同生物素检测系统在核酸分子杂交检测中的应用——Ⅲ 链霉亲和素-碱性磷酸酶标记生物素检测系统 [J], 刘钟瑸;杨秋霞;王丽群;赵玉莹;康洋;杨贵贞
5.生物素—亲和素系统在家蚕病毒研究中的应用:Ⅱ.不同发育时期家蚕DNV蚕座感染与发病率关系的研究 [J], 张耀洲;郭锡杰;钱元骏
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Ag-Ab1-Ab2-B-A-E
+A-E
BAS实验方法及反应层次
方法
直接法 BA
反应层次
Ag-(Ab-B)-A*
BAB
ABC 间接法 BA BAB
Ag- (Ab-B)-A-B*
Ag- (Ab-B)-AB*C Ag-Ab1-(Ab2-B)-A* Ag-Ab1- (Ab2-B)-A-B*
ABC
Ag- Ab1- (Ab2-B)-AB*C
The reaction mixture is aspirated into the measuring cell where the microparticles are magnetically captured onto the surface of the electrode.Unbound substances are then removed with ProCell.Application of a voltage to the electrode then induces chemiluminescent emission which is measured by a photomultiplier. Results are determined automatically by the Elecsys software by comparing the electrochemiluminescence signal obtained from the sample with the cutoff value obtained by anti-HCV calibration.
HBsAgII
Sandwich principle.Total duration of assay:18 minutes. 1st incubation:50 μL of sample,two biotinylated monoclonal anti-HBsAg antibodies, and a mixture of monoclonal anti-HBsAg antibody and polyclonal anti-HBsAg antibodies labeled with a ruthenium complex form a sandwich complex. 2nd:incubation:After addition of streptavidincoated microparticles,the complex becomes bound to the solid phase via interaction of biotin and streptavidin.
特点:将BAB法中的A先与B-E结合，制备成复合物 ABC
+ B-E + A ABC
+ABC
Ab-Ag-Ab-B + ABC
Ab-Ag-Ab-B-ABC
BA法 Ag+B· Ab Ag-Ab· B
A· E
Ag-Ab· E B-A·
特点：以A-E/SA-E代替BAB法中的A，省
却了加B-E的步骤
Ag-Ab1-Ab2-B + A-E
标记核酸的活化生物素
标记蛋白质氨基的活化生物素
O C NH CH NH CH NH2 C CH2 CH2 C O (CH2)4COOH O O EDC C O N C O CH2 O C CH2
CH2
S
CH
NH
OH 碳二亚 胺
生物素
N-羟基丁二酰胺
生物素羟基 琥珀酰亚胺 酯（BNHS ）
活化生物素
抗原、抗体标记后活性不变；
可对标记材料（如酶）标记：碱性磷酸酶标记后 活性将降低；
选择活化生物素：依抗原或抗体分子所带可标记基团
的种类（氨基、醛基或巯基）以及分子的酸碱性； 控制生物素：蛋白质比例 生物素：IgG 用量比(mg/mg)宜为2:1, IgG应用浓度 0.5~5μg/ml; 生物素1~3个/Ag，3~5个/Ab；
使用交联臂减少空间阻力
第二节 亲合素、链霉亲合素的理 化性质与标记
亲合素(avidin, AV) 和链霉亲合素
(streptavidin, SA)是生物素的天然特异性结合
物。而且，二者均为大分子蛋白，因此几乎所
有用于标记的物质均可以同亲合素（AV）或链
酶亲合素（SA）结合。
一、理 化 特 性
四、生物素-亲合素系统在放射免 疫测定中的应用
BAS主要与免疫放射分析(IRMA)检测体系偶 联，用于对终反应的放大（BA法） BAS也可用于IRMA反应后B、F成分的分离
五、生物素-亲合素系统在分子生 物学中的应用
以生物素标记核酸探针进行的定位检测 用BAS制备的亲和吸附剂进行基因的分离 纯化 将免疫测定技术与PCR结合建立免疫PCR(immuno-PCR)用于抗原的检测
后，再与无水肼反应而成。
除醛基外， BCHZ还可标记氨基
标记蛋白质巯基的活化生物素
马来酰亚胺-丙酰-生物胞素（MPB) 能特异地与蛋白质巯基结合的活化 生物素
标记核酸的活化生物素
光敏生物素(photobiotin)
侧链上连接的芳香基叠氮物基团, 经光照后, 变为芳香 基硝基苯，可直接与腺嘌呤氨基结合, 形成B-核酸探针
二、生物素-亲合素系统在酶免疫 测定中的应用
BAS在ELISA中的应用 生物素-亲合素系统在均相酶免疫测定
固相化抗原或抗体
A
电化学发光免疫测定示意图
用于终反应的放大
三、生物素-亲合素系统在荧光免 疫技术中的应用
BAS用于荧光抗体技术，通常采用BA法，即用 荧光素直接标记亲合素（或链酶亲合素）； 也可采用游离亲合素（或链酶亲合素）搭桥， 两端分别连接生物素化抗体和荧光素标记的 生物素（BAB法）或荧光标记的抗亲合素（或 链酶亲合素）抗体的夹心法。
2.亲和素－生物素化HRP复合物的制备
B-E
+
A
ABC
链霉亲和素的标记 方法：过碘酸钠法 HHale Waihona Puke P+NaIO4+SA
透析+KBH4
沉淀
过碘酸盐氧化法
NaIO4
O O O O O O
酶-五炭糖环
+ NH2SAvidin
KBH4
O
O
O OH N Avdin
O N
H2O
O
N OH
O OH
O
SAvidin SAvidin
一、生物素-亲合素系统基本类型 及原理
BAB法：
Ag+B· Ab
Ag-Ab· B
A
Ag-Ab· B-A
B· E
Ag-Ab· B-A-B· E
特点：以游离A分别连接B-Ab和B-E
+A
+A
ABC法
⑴ ⑵ A+B· E Ag+B· Ab A- B· E----ABC Ag-Ab· B
ABC
Ag-Ab· B-ABC
Anti-HCV
Sandwich principle.Total duration:18minutes. 1st incubation:40μL of sample,60 μ L of reagent containing biotinylated HCV antigens and 60 μ L of a reagent containing HCV antigens labeled with a ruthenium complex react to form a sandwich complex. 2nd incubation:After addition of strepetavidin-coated microparticles,the complex becomes bound to the solid phase via interaction of biontin and streptavidin.
Anti-HAV IgM
μ-Capture test principle.Total duration of assay:18 minutes. 1st incubation:Pretreatment of 10 μL of the automatically 1:400 diluted sample(using Elecsys Diluent Universal )with anti-Fdy reagent to block specific in the presence of the monoclonal anti-HAV antibodies labeled with ruthenium complex.
Anti-HBe
Competition principle. 1st:incubation:Anti-HBe in the sample (35 μL) binds to the added HBeAg. 2nd incubation:After addition of biotinylated antibodies and ruthenium complex-labeled antibodies specific for HBeAg,together with streptavdin-coated microparticles,the still-free binding sites on the HBe-antigens become occupied.The entire complex is then bound to the solid phase via interaction of biotin and streptavdin.
I 咪唑酮环
羧基
Ⅱ
噻吩环
一、活化生物素
生物素侧链的末