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第11章 生物素-亲合素放大技术

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9章生物素亲和素

9章生物素亲和素
物－活化生物素 (生物素化衍生物)
生物素活化
标记蛋白质醛基的活化生物素
标记蛋白质巯基的活化生物素
活化生物素易 与抗原、抗体 酶及核酸分子 中相应基团偶 联形成生物素 化标记物
标记蛋白质氨基的活化生物素
标记核酸的活化生物素
三、生物素标记蛋白质
1. 标记方式 生物素化蛋白质衍生物有二类： 一种是生物素化的大分子生物活性物 质（如生物素化抗原、抗体） 另一种是标记材料（如酶）结合生物 素后制成的标记物（如生物素 化酶）。
亲和素与链霉亲和素不同点
特点 等电点 分子量(KD) 是否有糖基 非特异吸附

AV 10.5 67 有 多
SAV 6 .0 65 无 少
三、SA和SAV的标记物 几乎所有用于标记的物质均可以同AV和 SAV结合， 125I、胶体金、荧光素、化学发光物 等 小分子物质 酶、抗原、抗体等大分子物质


BAS技术基本类型
1.BAB法（biotin--avidin bind，BAB ）， 也称为桥联亲和素－标记生物素法 （BRAB） 2.标记亲和素-生物素法（BA） （labeledavidin-biotin，LAB）


BAS技术基本类型
BAB法


（biotin--avidin bind，BAB）
及既可偶联生物大分子，又可连接荧光
素、酶等标记材料的特性，使该系统在
标记免疫分析技术领域中的应用具有很
强的稳定性和适用性。
第二节

生物素的理化性质及其标记物
一、生物素的特性 生物素（biotin，B）又称维生素H，辅酶R 分子量-----244.31 广泛分布于动、植物组织中，常从含 量较高的卵黄和肝组织中提取。生物素分 子有两个环状结构

猪肉中氯霉素残留的生物素-亲和素放大免疫检测方法

猪肉中氯霉素残留的生物素-亲和素放大免疫检测方法
０ ５ 、０ 、 ０ 和 ３ 的 血 清 和 ０ １ 和 １ 的 、 １ ％ ２ ％ ０ ．％
Ｂ Ａ 按照 （） 骤反应 。 Ｓ １步
霉素从 ２ ０ ０ ０年 《 国兽 药典 》 中 巾删 除 ， 于 ２ ０ 并 ０ ２年 ３ ５日发布 的“ 品 动物 禁用 的兽 药及 其 他 化合 月 食 物清 单” Ｃ 中， ＡＰ被 禁 止 所 有 用 途 用 于食 品 动 物 。 欧美 等发达 国家 已相 继禁止 或严格禁 止使用 。
种 检 测 系 统 。 目前 ， ＡＳ技 术 在 兽 药 残 留 检 测 中 Ｂ 已有 研 究 报 道 ， 在 生 物 学 领 域 已 经 得 到 广 泛 应 ］而
用 ， 为当今生物 医学 研究 工 作 中最具 使 用 价值 和 成
发展前途 的技术之一 ｌ 。 ５。
氯霉 素（ ＡＰ 残留 问题 已引起 国际组织和 世界 Ｃ ）
配 制系 列稀 释 的 Ｃ ＡＰ标 准 品 ， 采
用 方 阵 法 确 定 包 被 原 和 一 抗 的 最 适 浓 度 ， 以 此 浓 再
度， 根据 Ｏ Ｄ值和 Ｉ ｃ。 确定本 方法 的其他 条件 。（ ） １
Ｃ ＡＰ包 被 原 ｉ ０ Ｌ ／ ｌ ３ ℃ 反 应 一 定 时 间 。洗 ０ ｗｅ ， ７ ｌ 液 洗 ３ ， 遍 间 隔 １ ２ｍｉ 。 （） 闭 液 １ ０ Ｌ 遍 每 ～ ｎ ２封 ０ ／
文章 编 号 ：５ ９６ ０ （ ０ ０ ０ —０ ４０ ０ ２ — ０ ５ ２ １ ） ７０ ５ — ２
生 物 素一 和 素 放 大 免 疫 检 测 方 法 是 在 常 规 免 亲 疫 检 测 的基 础 上 Ｌ ］ 结 合 生 物 素一 和 素 系 统 （ ｉ １ ， 。 亲 ｂ ｏ
ｔ — ｖｄ ｎｓ ｓｅ Ｂ ） 高 度 放 大 作 用 ， 建 立 的 ｉ ａ ｉｉ ｙ ｔ ｍ， ＡＳ 的 ｎ 而

生物素-亲和素预定位技术在肿瘤诊断和治疗中的应用

生物素-亲和素预定位技术在肿瘤诊断和治疗中的应用

步法 、 ４步法和 ５步法等。多步法是在 ２步 法原 理的基础上 ， 由于需要清除体 内相关的影响因子， 而选择不 同的清除剂而
收稿 日期 ： ０ —２１ ２ ９１ ７ ０ 基金 项 目 ： 国家 自然科 学 基 金 面 上项 目 ： ６０ ８ ３ ７ ５４ ０
２ ０年 ２月第 １ ０１ ７卷 第 ｌ
５ ７
・
综
述 ・
生 物 素 ． 和 素 预 定 位 技 术 在 亲 肿 瘤 诊 断 和 治 疗 中 的应 用
邓新 荣 杜 ， 进。 罗志福 ，
（． １ 中国 原子 能科 学研 究 院 同位 素 研 究 所 ， 京 １２ １ ；． 北 ０４ ３ ２ 中国 同位 素 有 限公 司 ， 京 １０４ ） 北 ０ ０ ５ 用中具有 广泛 的应用前景。利用其作 用特点进 行肿瘤 显像诊 断和靶
向治 疗 的 研 究 是一 个 热 点 。 ２ 生 物 素一 亲和 素 系 统预 定 位 技 术 在肿 瘤 显 像 和 治 疗 中
应 用 的研 究现 状
肿瘤组织的浓聚 ， 提高了药物的有效性并减少 了毒副作用 。 预定位技 术 的 机 理 主 要 依 据 两 类 反 应 ： 和 素 （ 白素 ， 亲 卵
ａｉ ｎＡ） ｖ ｉ， 或抗 生 物 素 蛋 白链 菌 素 （ 霉 亲 和 素 ） ｓ ｅｔ ｉｉ， ｄ 链 （ｔ ｐａ ｄｎ ｒ ｖ
旦结合后很难分离 。但 当生 物素或 亲和 素的活性 受到 损
伤时 。 其结 合能 力 会 下 降 ０ 。
１２ 生物素 ． 亲和 素 系统的 特点
Ｂ Ｓ既 可偶 联 抗 体 等一 系列 大 分 子 活 性 物 质 ， 可 被 酶 Ａ 又
肿 瘤 预定 位 显 像 和 治 疗 的 具 体 方 案 可 以 分 为 ２步 法 、 ３

主管检验师临床医学检验免疫学和免疫检验 第十一章 生物素-亲和素放大技术

主管检验师临床医学检验免疫学和免疫检验 第十一章 生物素-亲和素放大技术

第十一章生物素-亲和素放大技术第一节生物素的理化性质与标记生物素（biotin）、亲和素（avidin）是一对具有高度亲和力的物质，它们的结合迅速、专一、稳定并具有多级放大效应。

生物素-亲和素系统（BAS）是一种以生物素和亲和素具有的多级放大结合特性为基础的实验技术，它既能偶联抗原抗体等大分子生物活性物质，又可被荧光素、酶、放射性核素等材料标记。

生物素（biotin，B）广泛分布于动、植物组织中，常从含量较高的卵黄和肝组织中提取。

一、活化生物素利用生物素的羧基加以化学修饰可制成各种活性基团的衍生物，称为活化生物素。

生物素活化后，可容易地与各种抗原、抗体、酶及核酸分子中相应基团偶联形成生物素化标志物。

（一）标记蛋白质氨基的活化生物素此种活化生物素的制备方法是将生物素与N-羟基丁二酰胺在碳二亚胺的作用下进行缩和，生成生物素N-羟基丁二酰亚胺醣（BLAHS）。

BLAHS分子酯键中的—C-=0基团可与蛋白质分子中赖氨酸的氨基形成肽键。

从而使蛋白质标记上生物素。

（二）标记蛋白质醛基的活化生物素用于此类标记的活化生物素有两种：生物素酰肼（BHZ）和肼化生物胞素（BGHZ）。

BHZ是水合肼与生物素的合成物，主要用于偏酸性糖蛋白的生物素标记。

（三）标记蛋白质巯基的活化生物素3-（N-马来酰亚胺-丙酰）-生物胞素（MPB）是能特异地与蛋白质巯基结合的活化生物素试剂。

（四）标记核酸的活化生物素活化生物素可通过缺口移位法、化学偶联法、光化学法及末端标记法等技术使生物素的戊酸侧链通过酰胺键与核酸分子相连，构成生物素标记的核酸探针。

二、生物素标记蛋白质（一）生物素化蛋白质衍生物的特性生物素化蛋白质衍生物有两类：1.生物素化的大分子活性物质，如抗原、抗体。

2.标记材料（如酶）结合生物素后制成的标志物。

（二）标记方法1.标记抗体、抗原选用第二抗体进行生物素标记，制备的标志物具有通用性。

2.标记酶生物素标记辣根过氧化物酶第二节亲和素、链霉亲和素的理化性质与标记亲和素和链霉亲和素是生物亲和素的天然特异性结合物。

亲和素和生物素系统

亲和素和生物素系统

标记亲和素-生物素法（labeled avidin biotin，LAB）
• 将亲和素与标记酶（HRP）结合，一个亲和素可 结合多个HRP
• 将生物素与抗体（一抗或二抗）结合，一个抗体 分子可连接多个生物素分子
• 细胞的抗原（或通过一抗）先与生物素化的抗体 结合，继而将酶标记亲和素结合在抗体的生物素 上，如此多层放大提高了检测抗原的敏感性。
• 抗体分子经生物素化后，其结合抗原的能 力不受损失，细胞经生物素化后仍能保持 正常的分裂、增殖能力，因此被用作抗体、 细胞的标记。
亲和素
• 亲和素（avidin）是一种分子质量为 68000Da的一、胶体 金等，结合的能力。
• 生物素和亲和素之间有极强的亲和力，比 抗体对抗原的亲和力要高出100 万倍。
物素标记抗体结合。由于采用了改良的亲 和纯化技术和酶标技术，LSAB 法敏感性更 高、背景更清晰。
演讲结束，谢谢大家支持
附PPT常用图标，方便大家提高工作效 率
生活
图标元素
医疗
图标元素
• 亲和素有4 个亚单位，它具有4 个同生物素 亲和力极高的结合位点，因其能使生物素 失活，故又称抗生物素。
链霉亲和素
• 链霉亲和素（streptavidin ）是一种从链霉 菌培养物中提取的蛋白质，相对分子质量 60000，且不含糖链。
• 同亲和素一样，链霉亲和素也具有4个生物 素结合位点，亲和力高达10－15 mol/L，是 一种更完美的生物素结合蛋白。因为它很 少有低聚糖残余成分，可保持中性等电点， 避免了组织中的非特异性染色。
• ABC 复合物不能饱和，即亲和素上的4 个结合位 点最多允许3 个位点与生物素化酶结合，留1~2 个位点与生物素化二抗结合。
• 抗原先后与特异性一抗、生物素化二抗、ABC 复 合物结合，最终形成巨大复合体，因该复合体网 络了大量酶分子，从而提高了检测的灵敏度。

生物素亲和素

生物素亲和素



分子式：C10H16O3N2S 分子量：244.31 等电点：PH=3.5 溶解特性：难溶于水，易 溶于二甲基甲酰胺(DMF) 两个环状结构： I环（咪唑酮环）为与亲 和素结合的主要部位； II环（噻吩环）为结合抗 体和其它生物大分子的部 位，C2上戊酸侧链的未端 羧基是结合生物大分子的 唯一结构
分子量：68 000
比活性：A≥12u/mgP


亲和常数：1015/mol
生物素酰肼(BHZ)：水合肼与生物素的合成物 主要用于标记偏酸性糖蛋白 肼化生物胞素(BCHZ) ：生物素与赖氨酸连接后， 再与无水肼反应而成。 除醛基外， BCHZ还可标记氨基
标记特点：BHZ与蛋白质中的 醛基结合而标记
马来酰亚胺-丙酰-生物胞素（MPB)：
能特异地与蛋白质巯基结合的活化生物素
活化生物素可克服以上缺点，既减少空间位阻 效应，又可扩大其结合的对象。
生物素侧链的末
端羧基经化学修
饰后制成带各种 活性基团的衍生
物－活化生物素
(生物素化衍生 物)
标记蛋白质氨基的活化生物素
N-羟基丁二酰亚胺酯（BNHS） 长臂活化生物素（BCNHS）
活化生物素易 与抗原、抗体 酶及核酸分子 中相应基团偶 联形成生物素 化标记物
注意事项：

选择活化生物素：依抗原或抗体分子所带可标记基 团的种类（氨基、醛基或巯基）以及分子的酸碱性；
控制生物素：蛋白质比例 生物素：IgG 用量比(mg/mg)宜为2:1，IgG应用浓度 0.5~5μg/ml；生物素1~3个/Ag，3~5个/Ab； 使用交联臂减少空间阻力


概念：是动物微生物中提取的一种含10%碳水化物的碱性糖 蛋白，可由蛋清中提取。 主要包括：卵白亲合素、链亲合素、卵黄亲合素及类亲合素 等。后两种因其特异性亲合力低，研究不多，前两种目前已 深入研究并得到广泛应用。 结构：4个相同亚基组成的四聚体糖蛋白，富含色氨酸，它 是与生物素结合的基团。

主管检验师资格考试临床免疫学和免疫检验 复习习题 第十一章 生物素-亲和素放大技术(附答案解析)

主管检验师资格考试临床免疫学和免疫检验复习习题第十一章生物素-亲和素放大技术（附答案解析）一、A1型题1、每个亲和素能结合生物素分子的数目是（）A、4B、2C、1D、3E、82、以下关于生物素-亲和素系统（BAS）的说法错误的是（）A、1个亲和素分子可结合4个生物素分子B、1个生物素分子可以结合多个亲和素分子C、生物素易与抗体、酶、多聚核苷酸结合D、亲和素易与酶、铁蛋白、荧光素、核素结合E、亲和素和生物素.有极强的亲和力3、免疫组化技术的优点不包括（）A、高特异性B、高敏感性C、形态学的直观性D、精确定量分析E、能对抗原表达情况进行分析4、BAS在ELISA技术中应用最广泛的反应模式是（）A、ABAB、ABCC、BRABD、BAE、LAB5、免疫组化染色前，对标本进行固定的目的是（）A、保存组织细胞的抗原性B、防止细胞脱落C、防止细胞自溶D、终止胞内酶的活性E、使细胞内蛋白质凝固6、ABC-ELISA将酶标记在（）A、亲和素B、生物素C、抗体D、补体E、抗原7、关于亲和素-生物素系统的错误描述是（）A、用于间接包被B、用于终反应放大C、用于酶免疫测定D、用于胶体金测定E、不用于荧光免疫测定8、ABC-ELISA将酶标记在（）A、亲和素B、生物素C、抗体D、补体E、抗原9、关于生物素标记蛋白质的注意事项，下列说法错误的是（）A、根据抗原或抗体分子结构中所带可标记基团的种类以及分子的理化性质，选择相应的活化生物素和反应条件B、活化生物素与待标记抗原或抗体可以为任意比例C、在生物素与被标记物之间加入交联臂样结构可减少空间位阻影响D、生物素与抗原、抗体等蛋白质结合后，不影响后者的免疫活性E、生物素标记酶时会影响其免疫活性10、亲和素和生物素结合的特点是（）A、免疫反应B、不属于免疫反应C、特异性弱D、亲和力小E、不够稳定二、B型题1、 A.ABCBC.BABD.直接法BASE.间接法BAS<1> 、标记亲和素-生物素的方法为（）；<2> 、亲和素-生物素化酶复合物技术为（）；<3> 、生物素化第二抗体为（）；<4> 、生物素化第一抗体为（）。

生物素亲和素

生物素亲和素篇一：生物素标记蛋白操作方法下面的操作方法可以使约3－5分子的生物素与1分子的蛋白结合，对某些蛋白来说，生物素与蛋白的分子比可根据不同的生物素化要求进行调整。

1、溶解2－10mg蛋白于1ml的BuphTm磷酸盐缓冲液中，并计算溶解的毫摩尔数。

如果蛋白含有不恰当的缓冲液（如Tris或者甘氨酸），可以通过在PBS中透析或浓缩的方法除去。

计算：蛋白质量（mg）/蛋白分子量（MW）＝蛋白质的毫摩尔数。

2、在打开之前，平衡生物素至室温。

加2mgSulfo-NHS-Biotin于100ul超纯水中，加入足够量浓度的生物素，一般对于10mg/ml蛋白来说超过12倍分子数，对于2mg/ml蛋白溶液应超过20倍，或者该试剂也可以直接以粉末的形式加入蛋白溶液中。

（见下表）3、室温30分钟，或冰上放置2小时。

4、用30mlPBS预洗纯化柱，上样，加入与欲收集量相同的缓冲液，收集0.5ml或1ml于单独的管中。

5、以280nm的吸收值测定蛋白含量。

6、生物素化的蛋白4℃存放至使用，可加入叠氮钠、甘油等保存。

HABA法检测生物素标记效果试剂配制：①PBS（100mM磷酸盐，150mMNaclPH7.2）②HABA/亲和素溶液：10mg亲和素、600ul10mMHABA于19.4ml的PBS中，该溶液的A500大约在0.9-1.3之间，溶液于4℃保存可稳定2周。

如果有沉淀形成（HABA溶液）可过滤后使用。

比色法检测生物素/蛋白质摩尔质量比：1、吸取900ulHABA/亲和素溶液于1ml比色杯。

2、测定该溶液在500nm处的'吸收值并记录为“A500HABA/Avidin”。

3、吸取100ul生物素标记的蛋白于杯中并测定500nm的吸光度值，记为A500HABA/Avidin/Biotin(数值必须恒定15s以上)如果A500HABA/Avidin/Biotin的值不超过（≤）0.3，重新稀释待测样品并检测。

生物素-亲和素


该技术将BA技术与免疫印迹技术相结合,进一
步提高检测灵敏度。
免疫印迹技术是在蛋白凝胶电泳和固相免疫
测定基础上发展起来的一种新的免疫学技术。是 凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异性、 敏感性、稳定性及可重复性的有机结合。
5. BA -组织化学技术
利用BA 技术将染料浓聚于靶细胞表面， 使其更利于观察， 提高了检测灵敏度。 Xia Y1 等在生物素化黑皮质素与黑色素瘤
性。用于标记蛋白质醛基、巯基和糖基的衍生 物有生物素酰肼（BHZ）及肼化生物素 （BCHZ）。
亲和素（ Avidin ）－抗生物素蛋白、抗生物素
是从鸡蛋清中提取的一种糖蛋白， 它由四个相同的氨基酸亚基组成， 亚基之间通过二硫键连接，亲和素 的每一个亚基含有一个与生物素结 合的位点，并与生物素或其衍生物 形成高度稳定的复合物。
1. BA-酶免疫技术
原理
亲和素可预包被在酶标板孔内，然后再 将生物素化抗体Ab(或抗原Ag)包被于孔
内。通过BA将免疫复合物与酶连接起来，
能有效地放大EIA法，使其灵敏性增强。
优点
生物素对抗体和酶的标记率高，又不影响其 他活性。 生物素亲和素的结合极为稳定，不会在孵育 和各种洗涤过程中脱落。 每个亲和素分子能结合4个生物素，能耦合 更多的联结生物素的酶分子，提高EIA的敏感 性。
۞ Morag
G.等使用硝基-(链霉)亲和素吸附于分离柱 上,分离提纯兔抗血清中的免疫球蛋白、抗-转移因 子等,每一例均可在解离生物素化探针后,恢复分离 柱的生物学特性。
۞在制备特异性破骨细胞cDNA库时,加入 生物素化的mRNA,然后通过固相亲和素提取。 用斑点印迹法分析,发现在此提取物中, 高度聚集了特异性破骨细胞cDNA。

生物素-亲和素免疫放大技术

第十一章生物素 -亲和素免疫放大技术一、生物素 - 亲和素系统的特点灵敏度高，特异性好，稳定性高，适用广泛。

二、生物素的理化性质与标记（一）生物素及其活化1.标记蛋白质氨基的活化生物素N- 羟基丁二酰亚胺酯（ BNHS）2. 标记蛋白质醛基的活化生物素酰肼（BHZ）和肼化生物胞素（BCHZ）3.标记蛋白质巯基的活化生物素3- （ N-马来酰亚胺 - 丙酰） - 生物胞素（ MPB）4.标记蛋白质核酸的活化生物素常用于标记核酸分子的活化生物素有光生物素、生物素脱氧核苷三磷酸、BNHS和 BHZ。

（二）生物素标记蛋白质生物素化蛋白质衍生物的特性生物素化蛋白质衍生物有两类：一种是生物素化的大分子生物活性物质（如抗原、抗体），另一种是标记材料（如酶）结合生物素后制成的标记物。

标记方法：（ 1）标记抗体、抗原：常用于标记抗体的活化生物是BNHS；对于偏酸性的抗原，标记时多采用 BHZ。

（ 2）标记酶：以生物素标记HRP为例。

标记注意事项：（ 1）应根据抗原或抗体分子结构中所带可标记基团的种类以及分子的理化性质，选择相应的活化生物素和反应条件；（2）标记反应时，活化生物素与待标记抗原或抗体应有适当的比例；（3）为减少空间位阻影响，可在生物素与被标记物之间加入交联臂样结构；（4）生物素与抗原、抗体等蛋白质结合后，不影响后者的免疫活性；标记酶时则结果有不同。

三、亲和素、链霉亲和素理化性质与标记1.亲和素及其活性：活性基团 - 色氨酸。

2.链霉亲和素及其活性：活性基团- 色氨酸。

3.亲和素、链霉亲和素的标记：最常用的是酶、FITC 和胶体金。

亲和素的标记（链霉亲和素的标记）（1） HRP-亲和素结合物的制备：改良过碘酸钠法，戊二醛法；（2）亲和素 - 生物素化HRP复合物的制备；（3）亲和素 - 生物素化碱性磷酸酶复合物的制备。

四、生物素 - 亲和素系统的应用1.生物素 - 亲和素系统基本类型及原理：基本类型有两种，一类以游离亲和素为中间物，分别连接包含生物素大分子的待检反应体系和标记生物素，称为BAB法；后来又在此基础上发展了亲和素 - 生物素化酶复合物技术（ ABC）。

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Ag-Ab1-Ab2-B-A-E
+A-E
BAS实验方法及反应层次
方法
直接法 BA
反应层次
Ag-(Ab-B)-A*
BAB
ABC 间接法 BA BAB
Ag- (Ab-B)-A-B*
Ag- (Ab-B)-AB*C Ag-Ab1-(Ab2-B)-A* Ag-Ab1- (Ab2-B)-A-B*
ABC
Ag- Ab1- (Ab2-B)-AB*C
The reaction mixture is aspirated into the measuring cell where the microparticles are magnetically captured onto the surface of the electrode.Unbound substances are then removed with ProCell.Application of a voltage to the electrode then induces chemiluminescent emission which is measured by a photomultiplier. Results are determined automatically by the Elecsys software by comparing the electrochemiluminescence signal obtained from the sample with the cutoff value obtained by anti-HCV calibration.
HBsAgII
Sandwich principle.Total duration of assay:18 minutes. 1st incubation:50 μL of sample,two biotinylated monoclonal anti-HBsAg antibodies, and a mixture of monoclonal anti-HBsAg antibody and polyclonal anti-HBsAg antibodies labeled with a ruthenium complex form a sandwich complex. 2nd:incubation:After addition of streptavidincoated microparticles,the complex becomes bound to the solid phase via interaction of biotin and streptavidin.
特点:将BAB法中的A先与B-E结合，制备成复合物 ABC
+ B-E + A ABC
+ABC
Ab-Ag-Ab-B + ABC
Ab-Ag-Ab-B-ABC
BA法 Ag+B· Ab Ag-Ab· B
A· E
Ag-Ab· E B-A·
特点：以A-E/SA-E代替BAB法中的A，省
却了加B-E的步骤
Ag-Ab1-Ab2-B + A-E
标记核酸的活化生物素
标记蛋白质氨基的活化生物素
O C NH CH NH CH NH2 C CH2 CH2 C O (CH2)4COOH O O EDC C O N C O CH2 O C CH2
CH2
S
CH
NH
OH 碳二亚 胺
生物素
N-羟基丁二酰胺
生物素羟基 琥珀酰亚胺 酯（BNHS ）
活化生物素
抗原、抗体标记后活性不变；
可对标记材料（如酶）标记：碱性磷酸酶标记后 活性将降低；
选择活化生物素：依抗原或抗体分子所带可标记基团
的种类（氨基、醛基或巯基）以及分子的酸碱性； 控制生物素：蛋白质比例 生物素：IgG 用量比(mg/mg)宜为2:1, IgG应用浓度 0.5~5μg/ml; 生物素1~3个/Ag，3~5个/Ab；
使用交联臂减少空间阻力
第二节 亲合素、链霉亲合素的理 化性质与标记
亲合素(avidin, AV) 和链霉亲合素
(streptavidin, SA)是生物素的天然特异性结合
物。而且，二者均为大分子蛋白，因此几乎所
有用于标记的物质均可以同亲合素（AV）或链
酶亲合素（SA）结合。
一、理 化 特 性
四、生物素-亲合素系统在放射免 疫测定中的应用
BAS主要与免疫放射分析(IRMA)检测体系偶 联，用于对终反应的放大（BA法） BAS也可用于IRMA反应后B、F成分的分离
五、生物素-亲合素系统在分子生 物学中的应用
以生物素标记核酸探针进行的定位检测 用BAS制备的亲和吸附剂进行基因的分离 纯化 将免疫测定技术与PCR结合建立免疫PCR(immuno-PCR)用于抗原的检测
后，再与无水肼反应而成。
除醛基外， BCHZ还可标记氨基
标记蛋白质巯基的活化生物素
马来酰亚胺-丙酰-生物胞素（MPB) 能特异地与蛋白质巯基结合的活化 生物素
标记核酸的活化生物素
光敏生物素(photobiotin)
侧链上连接的芳香基叠氮物基团, 经光照后, 变为芳香 基硝基苯，可直接与腺嘌呤氨基结合, 形成B-核酸探针
二、生物素-亲合素系统在酶免疫 测定中的应用
BAS在ELISA中的应用 生物素-亲合素系统在均相酶免疫测定
固相化抗原或抗体
A
电化学发光免疫测定示意图
用于终反应的放大
三、生物素-亲合素系统在荧光免 疫技术中的应用
BAS用于荧光抗体技术，通常采用BA法，即用 荧光素直接标记亲合素（或链酶亲合素）； 也可采用游离亲合素（或链酶亲合素）搭桥， 两端分别连接生物素化抗体和荧光素标记的 生物素（BAB法）或荧光标记的抗亲合素（或 链酶亲合素）抗体的夹心法。
2.亲和素－生物素化HRP复合物的制备
B-E
+
A
ABC
链霉亲和素的标记 方法：过碘酸钠法 HHale Waihona Puke P+NaIO4+SA
透析+KBH4
沉淀
过碘酸盐氧化法
NaIO4
O O O O O O
酶-五炭糖环
+ NH2SAvidin
KBH4
O
O
O OH N Avdin
O N
H2O
O
N OH
O OH
O
SAvidin SAvidin
一、生物素-亲合素系统基本类型 及原理
BAB法：
Ag+B· Ab
Ag-Ab· B
A
Ag-Ab· B-A
B· E
Ag-Ab· B-A-B· E
特点：以游离A分别连接B-Ab和B-E
+A
+A
ABC法
⑴ ⑵ A+B· E Ag+B· Ab A- B· E----ABC Ag-Ab· B
ABC
Ag-Ab· B-ABC
Anti-HCV
Sandwich principle.Total duration:18minutes. 1st incubation:40μL of sample,60 μ L of reagent containing biotinylated HCV antigens and 60 μ L of a reagent containing HCV antigens labeled with a ruthenium complex react to form a sandwich complex. 2nd incubation:After addition of strepetavidin-coated microparticles,the complex becomes bound to the solid phase via interaction of biontin and streptavidin.
Anti-HAV IgM
μ-Capture test principle.Total duration of assay:18 minutes. 1st incubation:Pretreatment of 10 μL of the automatically 1:400 diluted sample(using Elecsys Diluent Universal )with anti-Fdy reagent to block specific in the presence of the monoclonal anti-HAV antibodies labeled with ruthenium complex.
Anti-HBe
Competition principle. 1st:incubation:Anti-HBe in the sample (35 μL) binds to the added HBeAg. 2nd incubation:After addition of biotinylated antibodies and ruthenium complex-labeled antibodies specific for HBeAg,together with streptavdin-coated microparticles,the still-free binding sites on the HBe-antigens become occupied.The entire complex is then bound to the solid phase via interaction of biotin and streptavdin.
I 咪唑酮环
羧基
Ⅱ
噻吩环
一、活化生物素
生物素侧链的末