下载文档原格式
QIAGEN EndoFree Plasmid Maxi KitCatalog numbers 12362 室温下15-25度存放2年。
在开始之前作如下准备1）按照说明把RNase A加到Buffer P1 中，混匀，放到2-8度储存。
选作：按照1:1000的比例把LyseBlue 加到Buffer P12）pre-chill Buffer P3 4°C存放。
3）检查Buffer P2 是否有SDS沉淀物，可以放到37℃短暂温热以便溶解分子沉淀物。
4）准备异丙醇。
5）用试剂盒提供的无内毒素的水中加入40ml的96-100%的酒精。
大量质粒提取过程在LB培养基中种植转化的E.coli菌。
使用100ml（高复制数的质粒）或者250ml（低复制数的质粒）过夜培养。
操作步骤如下1.收获LB培养过夜的细菌，在6000g，4℃条件下离心15min。
2.加入10ml Buffer P1（根据SBI要求加倍，用20ml）重悬细菌。
3. 加10ml Buffer P2（根据SBI要求加倍，用20ml），剧烈晃动离心管4-6次使其彻底混匀，室温放置5min。
如果使用了LyseBlue试剂，溶液应该变成均匀蓝色。
4.在孵育期间，打开针口的密封盖.并把过滤器放到合适的架子上。
5.加入10ml冰浴的Buffer P3（根据SBI要求加倍，用20ml）到此溶菌产物中，剧烈晃动离心管4-6次使其混匀。
如果加入了LyseBlue试剂，混匀试剂直到没有颜色。
6.将溶菌产物倒入针口密封的过滤器中，室温放置10min，不要插入活塞。
打开针口的密封盖，轻轻挤压活塞将溶菌产物过滤到一新的50ml离心管中。
7. 加2.5ml Buffer ER到过滤的溶菌液中，充分混匀10次后冰上孵育30min。
8.将QIAGEN-tip 500的柱子挂在另一离心管上，加入10ml Buffer QBT，让管中溶液通过重力滴下排空。
9.将第7步冰上孵育的溶菌液加入QIAGEN-tip柱子中让其透过树脂慢慢滴下。
全血DNA 抽提(QIAGEN，德国)
采用血液基因组DNA 提取试剂盒按说明书进行操作，简述如下：
(1)先将无水乙醇加到漂洗液PW 和缓冲液GD 中，并将血液标本置于室温下平衡至标本完全溶解。
(2)取经RNaseA 酶处理过的离心管，按顺序编号后加入500μl 混匀的标本，随后
加入细胞裂解液CL lml，充分混匀后10000rpm 离心1min。
弃去上清，留下细胞
核沉淀。
(3)加入200μ1 缓冲液GS，振荡混匀。
随后加入20μ1 蛋白酶K 溶液，充分混匀。
加缓冲液GB 200μ1，充分混匀后，56℃水浴10min 至溶液变清亮。
取出后，加
无水乙醇200μl，混匀。
(4)上部物质转移到吸附柱内，12000rpm 离心30s。
弃去液体，并将吸附柱CB3 套在收集管上。
(5)加入500 μl 缓冲液GD，12000rpm 离心30s，弃去液体，将吸附柱CB3 放入收集管中。
(6)加入700μl 漂洗液PW，12000rpm 离心30s，弃去液体，将吸附柱CB3 放入收集管中。
(7)加入500μl 漂洗液PW，12000rpm 离心30s，弃去液体。
12000rpm 继续离心2min，弃去液体。
并把吸附柱置于室温数分钟，彻底晾干吸附材料中的漂洗液。
(8)将吸附柱套上一个干净的离心管中。
向吸附膜中间位置悬空滴加80μl 洗脱缓冲液TB，室温放置5min，12000rpm 离心2min。
将溶液收集到离心管中并标号，置于-20℃冰箱中冻存备用。
质粒DNA中提方法（QIAfilter midi kit 25）适用于100 微克的高质粒或粘粒DNA，使用QIAfilter注射器样元件代替常规离心法以清除细菌裂解物。
低拷贝质粒，加入氯霉素放大后应视为高拷贝。
为质粒选择适当的培养体系。
在开始之前的注意事项■如果是低拷贝，最好增加裂解buffer的用量，以提高裂解效率，裂解缓冲卷，从而增加DNA 产量。
■可选：删除样品的步骤用符号表示☞为监测分析凝胶（见第34 页）的过程。
■加入buffer P3后，样品不再需要冰浴。
在开始之前做的东西■把提供的RNase A 添加到buffer P1 中。
一瓶RNase A (使用之前简要地离心）加入一瓶buffer P1 ，终浓度为100 ug/ml。
■检查buffer P2 是否由于低温存储产生SDS沉淀。
如有必要，37 ° C下使SDS溶解。
.■在4 °C预冷buffer P3。
■可选：使用前将提供的LyseBlue 试剂添加到buffer P1 混合。
每个buffer P1 瓶加入一小瓶LyseBlue （在使用之前简要离心），达到1: 1000 稀释。
LyseBlue 可以提供视觉识别从而防止常见处理错误，如细胞裂解导致效率低下和不完全沉淀的SDS、基因组DNA污染、细胞碎片等。
过程1.摇菌：新鲜划线的选择性平板（接种含有适当的选择性抗生素）挑一个单菌落放入2-5 ml LB 培养基中。
在37 ° C 摇菌约8 h （约300 rpm）。
使用4倍体系容积的试管或锥形瓶。
2.稀释选择性LB 培养基1/500 -1/1000。
若为高拷贝质粒，接种到25 毫升或● 100毫升的介质具有▲ 25—50 µ l 或● 100 – 200 µ l 起始培养液。
若为低拷贝质粒，接种▲ 50 — 100 毫升或● 250 毫升的介质具有▲ 100 – 200 µ l 或● 250-500 µ l 起始培养基。
Q I A G E N-D N A甲基化试剂盒说明中文版-CAL-FENGHAI.-(YICAI)-Company One1QIAGEN EpiTect® Bisulfite•重亚硫酸盐处理DNA时，需要经高盐浓度、高温和低PH条件，会导致DNA断裂和片段化，并在随后的纯化过程中丢失，所以需要大量的input DNA•重亚硫酸盐转化未甲基化的胞嘧啶，转化率超过99%•Bisulfite Mix 足够做8个反应，用时要将Bisulfite Mix溶于800μl RNase-freewater中，溶解的Bisulfite Mix 在-20℃可以保存4周•DNA Protect Buffer 能保护重亚硫酸盐处理的DNA在高温、低ph条件下被片段化•Carrier RNA 能提高小量DNA（小于500pg，体积大于40μl）绑定在回收柱滤膜上的效率，帮助核酸沉淀；总量大于100ng的基因组DNA没有必要加Carrier RNA•EpiTect Bisulfite Kit在-20℃可以保存3年；可以适用于大范围的DNA量，input DNA范围为1ng~2μg；模板DNA片段范围可以在500bp~30kb 之间ProtocolDNA量在1ng~2μg之间，体积20μl以上开始前的准备重点：•Bisulfite Mix 足够做8个反应，如果样本少于8个，可以把溶解的Bisulfite Mix 保存于-20℃，4周内并不会影响其性能•DNA Protect Buffer在加入DNA–Bisulfite Mix后会由绿变蓝（step 2），表明溶液混合很充分且PH值正确•所有的离心分离步骤均在室温（15–25°C）下完成开始前准备的东西：•加入30ml乙醇（96%~100%）到Buffer BW中，室温（15–25°C）保存，使用之前摇匀•加入27ml乙醇（96%~100%）到Buffer BD中，2~8℃保存，使用之前摇匀，使用之后要立即盖上盖子。
DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen, Hilden, Germany)试剂盒中文操作说明书作者: Allanflying (站内联系TA) 发布: 2012-09-11一．利用DNeasy® Blood & Tissue试剂盒提取样本总DNA1．前处理：注意：1）石蜡包埋组织的DNA一般小于650bp，还要视样本类型与保存年限而定。
2）固定剂一般为福尔马林或酒精。
不推荐用蛾酸固定的样本。
3）溶解时间随样本类型和溶解状态而定。
4）产量视样本类型和保存年限而定。
推荐用50-100ul的AE缓冲液洗脱纯化的DNA。
5）开始前要预热孵化器或水浴锅至37℃，用于操作步骤9）。
1.石蜡包埋组织的前处理操作步骤：1）将小片石蜡包埋的组织（小于25mg）放入2ml离心管中（自备）。
2）加入1200ul的二甲苯，用力涡旋震荡。
3）最大转速室温（15-25°）离心5分钟。
4）移液枪吸去上清。
小心不要吸去沉淀。
5）往沉淀中加1200ul的（96-100%）酒精（目的是洗去剩余二甲苯），轻柔地震荡。
6）最大转速室温（15-25°）离心5分钟。
7）移液枪吸去上清。
小心不要吸去沉淀。
8）重复一次步骤5-7。
9）37°孵育10-15分钟，孵育过程打开离心管盖，直到酒精蒸发干净。
10）加入180ul的ATL缓冲液，继续提取组织总DNA中的步骤2。
2．福尔马林组织的前处理操作步骤：1）用PBS润洗组织样本（小于25mg）两次（目的是去除固定剂）。
2）去PBS，继续提取组织总DNA中的步骤1.2．动物组织总DNA的提取注意：1）ATL缓冲液和AL缓冲液可能存储后沉淀，如果沉淀，在56°孵育直至沉淀溶解。
2）在AW1缓冲液和AW2缓冲液中加入一定量（见瓶身）的（96%-100%）酒精，然后才使用。
3）打开水浴锅至56℃，用于步骤2。
4）如果是冻存的样本，拿出来室温预热，避免反复冻融。
1) 实验试剂的准备a. 配置QIAamp DNA FFPE Tissue试剂盒缓冲液检查Buffer ATL及Buffer AL原液是否有沉淀物形成。
有沉淀形成时，须升温至70℃同时适度晃动，使沉淀物全部溶解。
b. 配置Buffer AW1在19ml Buffer AW1原液中加入25ml(96-100%)无水酒精，盖紧瓶盖并摇匀。
在试剂瓶上作已加入无水酒精的标记，同时须标注配置时间。
配置好的溶液可在室温(15-20℃)下保存一年。
c. 配置Buffer AW2在13ml Buffer AW2原液中加入30ml(96-100%)无水酒精，盖紧瓶盖并摇匀。
在试剂瓶上作已加入无水酒精的标记，同时须标注配置时间。
配置好的溶液可在室温(15-20℃)下保存一年。
2) 操作步骤a. 使用刻刀修整石蜡组织上组织周围多余的石蜡。
b. 根据组织大小不同切取10μm厚的石蜡组织切片4~10张。
如石蜡标本组织面暴露于空气中时间过长，须舍弃前2~3张石蜡组织切片。
c. 将切取的石蜡组织切片置入已做好标记的1.5ml eppendorf tube中，加入1ml 二甲苯。
盖紧盖子并使用vortex振荡器充分振荡10s。
d. 使用Thermo离心机在全速状态下离心2min。
实验全程须保持在室温状态下进行(15~25°C)。
e. 离心结束后，使用移液器吸取并遗弃上部已溶解石蜡的二甲苯溶液，操作中应注意不要将下方的组织也同时丢弃。
f. 加入1ml 96％~100%无水酒精，再次vortex振荡器充分振荡。
目的是用酒精充分溶解组织中残留的二甲苯。
g. 在室温下全速离心2min。
h. 使用移液器吸取并遗弃上部已溶解二甲苯的酒精溶液，操作中应使用细小的移液器头并应注意不要移去下方荡洗后的组织。
i. 在室温下打开eppendorf tube盖子，静置至所有残余酒精全部挥发。
j. 加入180μl buffer ATL及20μl蛋白酶K，vortex振荡器充分振荡。
QIAGEN RNA cleanup试剂盒操作说明Buffer RPE使用之前加入4倍体积的无水乙醇（11ul原液+ 44ul无水乙醇。
1、RNA样品用RNAase水补齐至100ul,然后加入350ul Buffer RLT，充分混匀。
2、向以上稀释的RNA液中加入250ul无水乙醇，用移液枪充分混匀，切记勿用离心机。
随后立即进行步骤3。
3、将以上700ul样品液转移至吸附柱，（吸附柱放置于2ml收集管中），盖上管盖。
以≥8000g 转速离心15s，弃掉收集管中废液。
可选: 如果需要执行在吸附住上进行DNase消化，则需按如下步骤进行：（1）向吸附柱中加入350ul Buffer RW1，盖上管盖，以≥8000g（≥10000rpm）转速离心15s。
弃掉收集管中的废液。
（2）向70ul Buffer RDD中加入10ul DNase 1，混合颠倒离心管，短暂离心。
（3）对准吸附柱薄膜中央加入80ul DNase 1 混合液，室温放置15min。
（4）向吸附柱中加入350ul Buffer RW1，盖上管盖，以≥8000g（≥10000rpm）转速离心15s。
弃掉收集管中的废液。
4、向吸附柱中加入500ul Buffer RPE,盖上管盖。
以≥8000g转速离心15s，清洗滤膜。
弃掉收集管中的废液。
5、重复操作4。
可选：将吸附柱放置于新的2ml 收集管中。
盖上管盖，以最大转速离心1min。
6、将吸附柱放置于新的 1.5ml收集管中，对准吸附柱薄膜中央加入30-50ul RNase-Free Water 。
盖上管盖，≥8000g转速离心1min，洗脱RNA。
7、如果想获得更高的RNA浓缩液（预期的RNA产量＞30ug），重复步骤6向吸附柱中加入新的30-50ul RNase-Free Water ，或者重新利用第6步洗脱的RNA液重新加入吸附柱中洗脱。
重复利用第6步中的1.5ml收集管。
1:细菌的溶菌酶破碎2:细菌的溶菌酶破碎和机械破碎3:细菌的机械破碎4:细菌的溶菌酶裂解和蛋白酶K的消化5:细菌的溶菌酶裂解、蛋白酶K的消化及机械破碎6:固体培养基细菌的裂解7:使用RNeasy Mini Kit从细菌溶解物中提纯总RNA。
8:使用RNeasy Midi Kit从细菌溶解物中提纯总RNA。
章节说明该手册含有两种不同类型方案。
我们提供了多种方案，其中方案1-6是针对制备细菌溶解物，方案7-8是针对如何从细菌溶解物中提取全RNA。
你需要在方案1-6中选择一种操作，而后在方案7-8中任选其一。
制备细菌溶解物的各个方案都介绍了破碎细菌时如何固定RNA。
如何选择不同的实验方案由细菌细胞壁的稳定性所决定。
细菌细胞壁的稳定性受多个因素影响，包括细菌种类、生长阶段和培养基的成分。
细菌必须完全破碎以确保RNA的有效提取。
制备细菌溶解物的各个方案都包含了不止一步。
■酶消化：细菌细胞壁可以被溶菌酶进行消化（例如溶菌酶、溶葡球菌酶）。
我们认为溶菌酶的作用对于所有的革兰氏阳性、阴性细菌均是有效的。
■蛋白酶K消化：在复杂培养基上生长的细菌大部分蛋白质可以被蛋白酶K消化以提高RNA 的纯化率。
我们认为蛋白酶K对于可在复合培养基中生长的细菌均是有效的。
蛋白酶K常常用于提高革兰氏阳性细菌RNA。
另外，若从大量原材料中提取RNA，蛋白酶K可以有效提高RNA产率。
■机械破碎：细菌细胞壁的机械破碎可以使用组织研磨机和玻璃微珠。
机械破碎法对于绝大多数的细菌来说都是适用的。
机械破碎法与酶消化法相结合可以极大程度的提高RNA产率。
尽管本手册中的机械破碎方案均为使用组织研磨机，但采用其他的破碎方法是完全可行的。
考虑到细菌种类的多样性以及培养条件的多样性，细菌溶解物的制备方案（方案1-6）必须谨慎选择。
在第10页中介绍了制备细菌溶解物的不同方案，第11页（表格一）则提供了这些方案概况以便于参考选择。
方案一：细菌的酶消化该方案仅涉及到酶消化。
使用前注意事项：⏹所有离心操作在室温（15℃-25℃）下进行⏹沉渣用Buffer AL和Buffer ATL重溶⏹在浓缩的Buffer AW1和Buffer AW2中加入乙醇⏹冰冻组织和细胞球在室温下平衡⏹在56℃孵育箱中预处理⏹固定组织、昆虫、细菌或其他材料的预处理请参见使用手册1a. 组织：将组织切碎成小块（脾脏≤10mg，其他组织≤25mg），装入1.5ml离心管中，鼠尾则取1cm（大鼠）或2cm（小鼠）。
加入180μl Buffer ATL。
加入20μl 蛋白激酶K，振荡混匀，56℃孵育至组织完全裂解，孵育过程中间断振荡。
进入步骤2前振荡15秒。
1b. 无核血液：将20μl蛋白激酶K移至1.5ml或2ml离心管，加入50-100μl 抗凝处理过的血液。
用PBS调整体积至220μl，进入步骤2。
1c. 有核血液：将20μl蛋白激酶K移至1.5ml或2ml离心管，加入5-10μl抗凝处理过的血液。
用PBS调整体积至220μl，进入步骤2。
1d. 培养细胞：最多可用5×106个细胞，300×g（190rpm）离心5min。
用200μl重悬，加入20μl蛋白激酶K进入步骤22.加入200μl Buffer AL，振荡混匀，血标本需在56℃下孵育10min。
3.加入200μl 乙醇，振荡混匀。
4.将上述混合物用移液枪移至2ml离心管中的DNeasy Mini 滤柱中，6000×g（8000rpm）离心1min，弃去滤出液及离心管。
5.将滤柱放入新的2ml收集管中，加入500μl Buffer AW1，≥6000×g离心1min，弃去滤出液及收集管。
6.将滤柱放入新的2ml收集管中，加入500μl Buffer AW2，20000×g（14000rpm）离心3min，弃去滤出液及收集管。
7.将滤柱移至新的1.5ml或2ml离心管。
8.将200μl Buffer AE加至滤柱膜中央以洗提DNA，室温（15℃-25℃）下孵育1分钟。
Qiagen基因组提取试剂盒中⽂操作说明QIAamp DNA Blood Mini Kit简介：QIAGEN公司出品的QIAamp DNA Blood Mini Kit适⽤于使⽤微型离⼼机或真空处理从全⾎、⾎浆、⾎清、⾎沉、淋巴细胞以及体液样品中提取总(基因、线粒体和病毒)DNA。
该试剂盒可处理带有EDTA、柠檬酸盐和肝素等常规抗凝剂的新鲜或冷冻的全⾎样本，样品量可达200µl。
整套基因组的操作时间约为20–40分钟，⼀般可从200µl健康全⾎中获得4–12 µg DNA，洗脱体积可在50–200µl范围。
抽提原理：样品中的DNA可以特异性结合到QIAamp的硅胶膜上，通过两次洗涤可以将PCR抑制剂，如：⼆价阳离⼦和蛋⽩完全去除，最后结合在离⼼柱上的纯核酸可⽤⽔或试剂盒中的缓冲液进⾏洗脱收集。
开始前的注意事项：1. 所以的离⼼步骤需要在室温（15-25℃）进⾏2. 如果样品中含有的基因组当量少于10000，请添加载体DNA（carrier DNA）3. 200µl全⾎样品可以得到约3-12µgDNA开始前的准备⼯作：1. 将样品平衡到室温（15-25℃）2. 将⽔浴或是⾦属浴加热到56℃，以备第4步使⽤3. 将Buffer AE或蒸馏⽔平衡到室温，⽤于第11步的洗脱4. 确保Buffer AW1、AW2以及QIAGEN蛋⽩酶已经按照说明配置完毕5. 如果在Buffer AL中出现沉淀物，请在56℃孵育使其溶解操作步骤：以下为整个基因组提取操作的流程图，由于真空装置并⾮所有的实验室都配置，所以这⾥介绍的是离⼼法（流程图左侧）。
以下译介⾃QIAGEN官⽅出品的说明部分，⿊粗体为实验操作的主体部分。
1. 吸取20µl QIAGEN蛋⽩酶（或者蛋⽩酶K）⾄1.5ml离⼼管的底部。
2. 加⼊200µl待提取基因组的样品⾄离⼼管中。
QIAGEN试剂盒提取RNA说明书中⽂翻译1:细菌的溶菌酶破碎2:细菌的溶菌酶破碎和机械破碎3:细菌的机械破碎4:细菌的溶菌酶裂解和蛋⽩酶K的消化5:细菌的溶菌酶裂解、蛋⽩酶K的消化及机械破碎6:固体培养基细菌的裂解7:使⽤RNeasy Mini Kit从细菌溶解物中提纯总RNA。
8:使⽤RNeasy Midi Kit从细菌溶解物中提纯总RNA。
章节说明该⼿册含有两种不同类型⽅案。
我们提供了多种⽅案，其中⽅案1-6是针对制备细菌溶解物，⽅案7-8是针对如何从细菌溶解物中提取全RNA。
你需要在⽅案1-6中选择⼀种操作，⽽后在⽅案7-8中任选其⼀。
制备细菌溶解物的各个⽅案都介绍了破碎细菌时如何固定RNA。
如何选择不同的实验⽅案由细菌细胞壁的稳定性所决定。
细菌细胞壁的稳定性受多个因素影响，包括细菌种类、⽣长阶段和培养基的成分。
细菌必须完全破碎以确保RNA的有效提取。
制备细菌溶解物的各个⽅案都包含了不⽌⼀步。
■酶消化：细菌细胞壁可以被溶菌酶进⾏消化（例如溶菌酶、溶葡球菌酶）。
我们认为溶菌酶的作⽤对于所有的⾰兰⽒阳性、阴性细菌均是有效的。
■蛋⽩酶K消化：在复杂培养基上⽣长的细菌⼤部分蛋⽩质可以被蛋⽩酶K消化以提⾼RNA 的纯化率。
我们认为蛋⽩酶K对于可在复合培养基中⽣长的细菌均是有效的。
蛋⽩酶K常常⽤于提⾼⾰兰⽒阳性细菌RNA。
另外，若从⼤量原材料中提取RNA，蛋⽩酶K可以有效提⾼RNA产率。
■机械破碎：细菌细胞壁的机械破碎可以使⽤组织研磨机和玻璃微珠。
机械破碎法对于绝⼤多数的细菌来说都是适⽤的。
机械破碎法与酶消化法相结合可以极⼤程度的提⾼RNA产率。
尽管本⼿册中的机械破碎⽅案均为使⽤组织研磨机，但采⽤其他的破碎⽅法是完全可⾏的。
考虑到细菌种类的多样性以及培养条件的多样性，细菌溶解物的制备⽅案（⽅案1-6）必须谨慎选择。
在第10页中介绍了制备细菌溶解物的不同⽅案，第11页（表格⼀）则提供了这些⽅案概况以便于参考选择。
Qiagen 公司焦磷酸测序PCR试剂盒PyroMark® PCR Kit中文说明书PyroMark PCR试剂盒（部件号978703和978705）。
在室温下（15-25℃）可储存3天，如需保存时间较长，应储存在-20°C。
有关详细信息，请参阅PyroMark PCR技术手册，可以在/找到手册。
提供技术援助，请拨打免费电话00800-22-44-6000，或在/ 找到区域的电话号码。
开始前的注意事项■一个引物必须在其5' 添加端生物素®以便焦磷酸测序的模板制备。
■我们建议用PyroMark Assay Design Software 2.0设计引物■如果要用Q-Solution，请执行不加Q-Solution的平行扩增。
■我们建议添加CoralLoad®，这能集中最好的PCR性能。
1、解冻所需的溶液（表1所列），每个彻底混合。
根据表1建立反应。
PyroMark PCR Master Mix含有终浓度为1.5mmol的MgCl2，这在大多数情况下提供了令人满意的结果。
如果需要较高的浓度Mg2 +，使用25 mM MgCl2。
2、轻轻上下吹打反应混合物使彻底混合，分配相应的量到PCR管中。
3、每个PCR管中加入模板DNA（≤500ng/反应），我们建议10ng的人类基因组DNA或10-20ng重亚硫酸盐转化的DNA。
4、根据表2的热循环编程。
如果使用热循环仪没有热盖，用100μL矿物油覆盖反应。
5、将PCR管放进PCR仪，并开始循环程序。
表1. 没有模板DNA的反应混合组成表2. PyroMark PCR预混优化循环协议补充意见预变性15 min 95℃热启动Taq DNA聚合酶被激活3步循环：变性30 s 94℃退火30 s 60℃对于基因组DNA56℃对于亚硫酸氢盐转化的DNA 延伸30 s 72℃循环次数45最后一次延长保存10 min∞72 ℃4℃6、用PyroMark q24和PyroMark Q96 MD型仪器焦磷酸测序时需要5-10μLPCR产物，用PyroMark Q96型号是需要为10-20μL。
质粒大提说明书QiagenOrder: 010-********Toll-free: 800-990-6057 /400-810-6057TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO., LTD 版本号: DP141210产品内容产品组成 DP117 (10 preps)平衡液BL (Buffer BL) 30 ml溶液P1 (Buffer P1) 100 ml溶液P2 (Buffer P2) 100 ml溶液P4 (Buffer P4) 100 ml漂洗液PW (Buffer PW) 70 ml洗脱缓冲液TB (Buffer TB) 30 mlRNase A (100 mg/ml) 500 μl过滤器CS1 (Filtration CS1) 10个吸附柱CP6 (Spin Columns CP6) 10个收集管(50 ml) (Collection Tubes 50 ml) 20个储存条件该试剂盒置于室温(15-25℃)干燥条件下，可保存12个月，更长时间的保存可置于2-8℃。
2-8℃保存条件下，若溶液产生沉淀，使用前应将试剂盒内的溶液在室温放置一段时间，必要时可在37℃水浴中预热10 min ，以溶解沉淀。
第一次使用前将RNase A 加入溶液P1中，混匀后置于2-8℃保存，可稳定保存12个月以上。
单独包装的RNase A 在室温可稳定保存12个月以上。
EndoFree Maxi Plasmid Kit无内毒素质粒大提试剂盒（离心柱型）目录号：DP117本试剂盒采用独特的硅胶膜吸附技术，高效专一地结合质粒DNA。
同时采用特殊的溶液P4和过滤器CS1，可有效的去除内毒素、蛋白等杂质；整个提取过程仅需1h，方便快捷。
使用本试剂盒提取的质粒DNA可适用于各种常规操作，包括酶切、PCR、测序、连接、转化和转染多种细胞等实验。
推荐每次菌液使用量：高拷贝质粒推荐使用量为100 ml，得率一般在500-1500 μg左右；低拷贝质粒推荐使用量为200 ml，得率一般在200-600 μg左右。
miScript PCR 系统操作手册试剂盒成分：miScript Reverse Transcription KitmiScript Primer AssaysmiScript SYBR® Green PCR Kit10x miScript Primer Assay 和10x miScript Precursor Assay是干粉状的，需要稀释。
首先短暂离心小管，然后加入550μl TE，pH 8.0，最后在漩涡震荡仪上4-6次。
为了保持引物的活性，在冷冻条件下将稀释的引物分装成小管。
实验步骤：反转录反应1、在冰上融化RNA，室温下(15–25ºC)融化5x miScript RT Buffer 和RNasefree water 。
先轻弹每个小管使其充分混匀，然后短暂离心以收集管壁和管盖上的液体，最后放置在冰上。
2、在冰上配制reverse-transcription master mix。
配好后混合并放置在冰上。
如果miScript Reverse Transcriptase Mix是从-20°C 冰箱拿出来的话，那么在使用完毕后立刻放入冰箱。
如果要配制多次反应，先在一个大管中准备Mix，并且多配制10%。
3、将miScript Reverse Transcriptase Mix分装到每个小管中，然后加入RNA。
4、在37°C下孵育60分钟5、在95°C下孵育5分钟以灭活miScript Reverse TranscriptaseMix6、如果马上进行PCR，讲产物放置在冰上；如果不立刻做PCR，那么将反转录产物放置在-20°C实验步骤：Real-Time PCR检测miRNA或Noncoding RNA1、融化2x QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix，10x miScriptUniversal Primer, 10x miScript Primer Assay, template cDNA, 和RNase-free water。
QIAGEN EpiTect® Bisulfite
•重亚硫酸盐处理DNA时，
需要经高盐浓度、高温和低PH
条件，会导致DNA断裂和片段
化，并在随后的纯化过程中丢
失，所以需要大量的input DNA
•重亚硫酸盐转化未甲基化
的胞嘧啶，转化率超过99%
•Bisulfite Mix 足够做8个
反应，用时要将Bisulfite Mix
溶于800μl RNase-free water中，
溶解的Bisulfite Mix 在-20℃可
以保存4周
•DNA Protect Buffer 能保
护重亚硫酸盐处理的DNA在高
温、低ph条件下被片段化
•Carrier RNA 能提高小量
DNA（小于500pg，体积大于
40μl）绑定在回收柱滤膜上的
效率，帮助核酸沉淀；总量大
于100ng的基因组DNA没有必
要加Carrier RNA
•EpiTect Bisulfite Kit 在-20℃
可以保存3年；可以适用于大
范围的DNA量，input DNA范
围为1ng~2μg；模板DNA片段
范围可以在500bp~30kb之间
DNA量在1ng~2μg之间，体积20μl以上
开始前的准备重点：
•Bisulfite Mix 足够做8个反应，如果样本少于8个，可以把溶解的Bisulfite Mix 保存于-20℃，4周内并不会影响其性能
•DNA Protect Buffer在加入DNA–Bisulfite Mix后会由绿变蓝（step 2），表明溶液混合很充分且PH值正确
•所有的离心分离步骤均在室温（15–25°C）下完成
开始前准备的东西：
•加入30ml乙醇（96%~100%）到Buffer BW中，室温（15–25°C）保存，使用之前摇匀•加入27ml乙醇（96%~100%）到Buffer BD中，2~8℃保存，使用之前摇匀，使用之后要立即盖上盖子。
储存一段时间后底部可能会出现白色沉淀，沉淀不影响Buffer BD的性能，但是还是要避免将沉淀吸到回收柱中。
•加入310μl RNase-free water到冻干的carrier RNA（310 μg）中，配成1 μg/μl的溶液。
当一次处理48个样本，将溶解的carrier RNA加入到Buffer BL的瓶子中，摇匀并确认瓶盖标签。
如果处理的样本较少，则将溶解的carrier RNA分装，并储存于-20℃，分装的carrier RNA能保存1年。
如果少于48个样本要在2周之内完成处理，则参照表1的体积比取一定体积的Buffer BL与carrier RNA混合。
DNA量大于100ng不需要加carrier RNA。
如果Buffer BL有沉淀，则需加热（最高不超过70℃）并温和搅拌使其溶解。
表1 Buffer BL与carrier RNA的体积比
•室温平衡样本和Buffers
重亚硫酸盐转化DNA
1.融化DNA备用，溶解Bisulfite Mix，加入800μl RNase-free water，混匀5min使其完全溶
解。
如有必要，60℃加热并混匀Bisulfite Mix–RNase-free water溶液使其溶解。
注意不要将溶解的Bisulfite Mix置于冰上。
2.在200μl离心管中配制重亚硫酸盐转化反应液，参照表2配制反应体系，DNA体积不足
20μl则用RNase-free water补足。
（处理低浓度DNA（1~500ng或小于500pg）时，DNA 体积增加到40μl，DNA Protect Buffer减少为15μl，总体积140μl不变）
表2 重亚硫酸盐转化反应体系
3.盖上PCR管盖，混匀反应液，置于室温（15–25°C）。
DNA Protect Buffer在加入DNA–Bisulfite
Mix后会由绿变蓝，表明混匀充分且PH值正确。
4.在循环加热器上进行重亚硫酸盐转化DNA反应，反应条件参照表3。
整个反应过程需要
5h。
表3 重亚硫酸盐转化反应条件
5.将PCR管放入循环加热器中，开始转化反应。
注意PCR管中不要加入矿物油，保证管盖
密封。
已经转化的DNA可以在循环加热器中保存过夜，不会影响其性能。
纯化重亚硫酸盐转化的DNA
6.待转化反应完成之后，取出PCR管，瞬时离心，再将PCR管中的反应液转到一个1.5ml
的干净的离心管中。
转移反应液不影响其性能。
7.在每个样本中加入560μl现配的Buffer BL（参照表1加入10μg/ml carrier RNA），涡流混
匀并瞬时离心。
如果DNA大于100ng，则不需要加入carrier RNA。
（处理FFPE样本或DNA量小于500pg的样本时，加入现配的Buffer BL的体积减少为310μl（加入10μg/ml carrier RNA），混匀离心，之后再加入250μl 96~100% 乙醇，混匀15s后瞬时离心）
8.将收集管和回收柱按样本编号并放置在架子上，将1.5ml离心管中的样本混合液全部转
移到相应的回收柱内。
9.以离心机最大转速离心1min，弃收集管内的液体，再将回收柱放回收集管中。
10.在每个回收柱内加入500 μl Buffer BW（wash buffer），用最大转速离心1min，弃收集管
内的液体，再将回收柱放回收集管中。
11.在每个回收柱内加入500 μl Buffer BD（desulfonation buffer，脱磺酸基），盖上回收柱盖
子，室温（15–25°C）放置15min。
如果Buffer BD中有沉淀，避免将沉淀加到回收柱内。
装有Buffer BD的瓶子在使用后要立即盖上盖子，避免接触的空气中的CO2发生酸化。
12.以离心机最大转速离心1min，弃收集管内的液体，再将回收柱放回收集管中。
13.在每个回收柱内加入500 μl Buffer BW，用最大转速离心1min，弃收集管内的液体，再
将回收柱放回收集管中。
14.重复步骤13一次。
15.将回收柱放到一个新的2ml收集管中，以离心机最大转速离心1min，移除所有的残余
液体。
16.（推荐）将回收柱放到一个干净的1.5ml离心管中，56℃加热5min，使残余的液体完全
蒸发。
17.再将回收柱转移到一个新的1.5ml离心管中，在每个回收柱的滤膜上加20μl Buffer EB，
然后15000g（12000rpm）离心1min洗脱DNA。
要增加洗脱的DNA产量，可以再加20μl Buffer EB ，最大转速离心洗脱一次。
洗脱的DNA如果要存放不超过24h，建议2~8℃保存；如果需要存放超过24h，建议-20℃保存。
使用该试剂盒洗脱的已经转化的DNA可以在-20℃保存至少3年，其质量和性能不会降低。
