金标层析法与金标渗滤法

胶体金检测试纸生产工艺本项目主要从事犬、猫传染病抗体胶体金检测试纸的生产，以微孔滤膜为固相载体，膜上包被已知抗体，待加入检测样本后，经毛细管虹吸作用或微孔滤膜的渗滤作用，使标本中的抗体与膜上包被的抗体或抗原结合，再通过胶体金标记物与复合物反应，可形成肉眼可见的红色产物。

目前应用最为广泛的胶体金免疫技术有侧向横流模式，又称金标免疫层析法（ImmUnOgoIdChrOmatograPhyASsay,GICA ）O金标免疫层析法试纸条主要是通过毛细管虹吸作用反应,它由以下几部分组成:样品垫、胶体金垫、NC 膜（硝酸纤维素膜）、吸水滤纸、以及PVC 底板，NC 膜（硝酸纤维素膜）上包括一条检测线（T 线）和一条质控线（C 线）一次层叠起来，如下图所示：图3 金标免疫层析法示意图在吸水材料的牵引下，待测抗原在试条上向上走，首先与金标抗体结合成抗原抗体复合物，抗原抗体复合物上行到检测线时，被测抗原的另一结合位点与包被在此处的单抗结合，形成两个抗体结合一个抗原（双抗体夹心）的金标复合物，因有金颗粒在此沉积，故T 线显红色。

未结合抗原的金标抗体上行到C 线时，与“抗金标抗体”结合，所以C 线也显红色。

检测结果判定：T 线与C 线均显线，表明检测结果为阳性；C 线显线，T 线不显，表明结果为阴性。

若C 线不显线，则检测结果无效。

工艺流程如下所示：NC«（跚咬纤假素膜）PVC 底板 测试线（TtK 1）M 析方向样品稀释液噪声：N ；一般固体废物：不合格品(S1)；废防粘纸(S2)；边角料(S3)；废包装物(S4)；危险废物：废一次性滴管(S5)玻璃器具清洗废水(S6)；玻璃器具淋洗废水(S7)；超声波清洗废水(S8)、超声波冲洗废水(S9)o图4胶体金检测试纸生产过程示意图工艺流程简述： (1)检测：外购硝酸纤维素膜、金结合垫、吸水垫、样品垫均人工目视进行检验。

①硝酸纤维素膜：人工目视干燥后的包被膜表面应洁净、无污染、破损等，如有，需用笔标出。

实验室常用检测方法原理临床检测常用反应原理设计，首先要找出所检测的化学特性，如测定体液（首先是血液）中酶的含量，血液中除少数酶（如凝血溶血酶、铜氧化酶及假性胆碱酯酶等）含量较多外，血液正常生理状况下含量微乎其微。

一般每毫升含皮克（Pg）水平，要直接测定如此微量物质是相当困难的。

用免疫化学方法可测定全部酶蛋白分子含量（不论其有无活性），而用化学方法测定只能测定酶的催化活性，间接计算出酶的含量。

目前利用酶具有催化活性这一特性，在临床上已普遍应用测定酶蛋白，同时还可以测定三大代谢的产物，如糖、脂类、蛋白质，这样也就建立起利用酶促反应的一级反应测定代谢物的方法。

一级反应的反应速度与底物浓度成正比，因此只有当酶反应为一级反应时，才能准确测定底物含量（如测定血糖、总甘油三酯、总胆固醇等）。

从此在临床试剂盒的方法中出现了以酶为试剂测定各种代谢产物。

现介绍临床检验常用检测方法原理及检测方法解释。

一、细胞计数原理血细胞悬浮在电解液中，用一定的电流通过传感器的内外两个电极，由于血细胞电阻抗很大，当血细胞通过两个电极时，电极间阻抗瞬间增大，形成幅度与血细胞体积成正比的电脉冲，根据脉冲的大小可测出细胞的体积。

二、尿液分析仪的检测原理将吸附有尿液的试剂带放在仪器比色槽内，试剂带上已产生化学反应的各种试剂垫被光源照射，其反射光被球面积分仪接收，球面积分仪的光电管被反射的双波长光（通过滤片的测定光和一束参考光）照射，各波长的选择由检测项目决定。

三、尿液试剂带的反应原理1.pH值测定：采用pH指示剂原理，常用甲基红和溴麝香草酚蓝组成的复合型指示剂，呈色范围从pH4.5～pH9，颜色由橘黄色、绿色变为蓝色，由此反映尿液的pH值。

2.尿蛋白质测定：利用pH指示剂蛋白质误差的原理。

3.尿葡萄糖测定：当前有两种完全不同的检测尿糖的方法，一种是基于葡萄糖氧化酶法原理，能特异地检出尿中的葡萄糖；另一种是基于铜还原法的原理，能检测葡萄糖和其他还原性物质。

胶体金是一种常用的标记技术，是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术，有其独特的优点。

近年已在各种生物学研究中广泛使用。

在临床使用的免疫印迹技术几乎都使用其标记。

同时在流式、电镜、免疫、分子生物学以至生物芯片中都可能例用到。

1971年Faulk和Taytor将胶体金引入免疫化学，此后免疫胶体金技术作为一种新的免疫学方法，在生物医学各领域得到了日益广泛的应用。

目前在医学检验中的应用主要是免疫层析法(immunochromatogra-phy)和快速免疫金渗滤法(Do t-immuogold filtration assay DIGFA)，用于检测HBsAg、HCG和抗双链DNA抗体等，具有简单、快速、准确和无污染等优点。

免疫胶体金技术的基本原理：胶体金是由氯金酸(HAuCl4)在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下，可聚合成一定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，形成带负电的疏水胶溶液，由于静电作用而成为稳定的胶体状态，故称胶体金。

胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。

胶体金除了与蛋白质结合以外，还可以与许多其它生物大分子结合，如SPA、PHA、ConA 等。

根据胶体金的一些物理性状，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结合物的免疫和生物学特性，因而使胶体金广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。

胶体金标记，实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。

吸附机理可能是胶体金颗粒表面负电荷，与蛋白质的正电荷基团因静电吸附而形成牢固结合。

用还原法可以方便地从氯金酸制备各种不同粒径、也就是不同颜色的胶体金颗粒。

这种球形的粒子对蛋白质有很强的吸附功能，可以与葡萄球菌A蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、牛血清白蛋白多肽缀合物等非共价结合，因而在基础研究和临床实验中成为非常有用的工具。

HCG金标免疫试验方法及注意事项1．金标免疫试验的原理将氯金酸(HAuCl4)用还原法制成一定直径的金溶胶颗粒(胶体金)标记抗体，(或金黄色葡萄球菌A蛋白SPA)。

金标为一种催化剂，经还原剂(如对苯二酸)处理，将显影剂中的银离子还原成不溶性金属银，沉淀在每个金颗粒的周围，银沉淀在光镜下可清楚地显示。

滴金免疫实验原理同一般免疫斑点实验，也是用已知抗原或抗体包被硝酸纤维素膜，再用金标记抗体或抗原进行快速测定。

临床应用的有两种方法：金标一步法(层析法)和金标二步法(斑点渗漏法)。

具体讲即用两个人HCG—β单克隆抗体，一个抗体吸附于硝酸纤维素薄膜(NC膜)上，另一抗体结合于金溶胶颗粒表面。

尿中HCG先与NC膜上的抗体-结合，然后再与金标单抗溶液反应，形成抗体一HCG一金标抗体的加心式复合物．红色的金斑点．胶体金溶液的制备是依所需胶体金颗粒的直径配制A液及B 液，见表4—7。

预热至6 0℃并保持此温度，磁力棒搅拌混合A液及B液，加热至沸，溶液由蓝紫变成橙红色，表明胶体金颗粒形成。

冷后补加重蒸馏水至100ml。

免疫金银染色法用5mm直径胶体金，滴金免疫技术用15mm胶体金。

2．金标免疫试验的方法(1)金标二步法(斑点渗漏法)：中心圆点为一株单抗(金一Ab—Abl一薄膜的红色斑点)，边上小点为抗鼠二抗(金一Ab—Ab2一薄膜的质控点)。

试剂盒包括：渗滤盒和金标记抗HCG一β亚单位单抗体。

渗滤盒为30mm长，6mm厚的正方形塑料盒，中央有8mm直径的圆孔。

盒内紧塞多层吸水填料，填料上为孔径0．45nm的硝酸纤维素薄膜，膜上包被有抗HCG的抗体。

操作方法为先用小吸管向检测盒圆孔中央滴3滴待检尿液。

待渗入；然后加金标记抗HCG—β亚单位单抗液(A试剂)两滴，待渗入后取出滤器；最后加B试剂(PBS)两滴，待干。

结果判断：阳性为小孔中央出现红色斑点，质控点呈蓝色，提示含有HCG。

阴性为小孔中央无红色斑点，仅质控点呈蓝色，提示不含HCG。

胶体金免疫层析试验须注意的几个问题1971年，Faulk和Taylor首先报道将胶体金与抗体结合，应用于电镜水平的免疫细胞化学研究。

1974年，Romano等用胶体金标记抗球蛋白抗体，建立间接免疫金染色法。

此后，胶体金作为一种新型免疫标记技术发展很快[1]。

目前在医学检验中的应用主要是胶体金免疫层析法（gold immunochromatography assay GICA）和胶体金免疫渗滤法（gold immunofiltration assay GIFA）。

1990年Beggs[2]和Osikowicz[3]等相继建立了免疫层析试验。

胶体金免疫层析试验是将各种反应试剂分点固定在同一试纸条上，待检标本加在试纸条的一端，将一种试剂溶解后，通过毛细作用在层析条上移行并与膜上另一种试剂接触，标本中的待测物同层析材料上针对待测物的受体（如抗原或抗体）发生特异性免疫反应。

层析过程中免疫复合物被聚集或截留在层析材料的一定区域（检测带），通过可目测的胶体金标记物得到直观的显色结果。

而游离标记物则越过检测带，达到与结合标记物自动分离之目的。

其特点是单份测定、简单、快速，除商品试剂外不需任何仪器设备，几分钟即可用肉眼观察结果。

目前已在临床检测中获得广泛应用，极大地简化了检验步骤，同时，也给试纸条制备者带来了一定的难度。

胶体金免疫层析试纸条有十几种原材料及辅助材料组成，要想达到临床要求需作大量的试验，根据我们多年的工作经验，现就胶体金免疫层析试验过程中必须注意的几个关键问题作以介绍。

1 胶体金颗粒大小的选择胶体金颗粒的大小与产品的灵敏度及特异性有关。

我们制备了如下胶体金液体各100ml，0.01％氯金酸水溶液中加入1％柠檬酸三钠的量分别为：①1.0ml；②1.5ml；③2.0ml；④2.5ml。

各取其50ml，调PH值为6.9进行抗HBsAg抗体标记,分别做灵敏度及特异性实验,结果见表1。

由表1可看出：胶体金颗粒越大，灵敏度越高，但特异性越差。

胶体金免疫分析技术详解随着免疫分析日益广泛应用于以临床为主以及非临床领域的诊断工业，免疫分析正在向两个方向发展:一类为全自动化的免疫分析;另一类为以硝酸纤维膜为载体的快速免疫分析。

前者需要价格昂贵的全自动仪器及与仪器严格配套的各种试剂盒，目前只能在医疗及检测中心应用,虽也能较快速给出结果，但仍需一定时间，不适合远离医疗及检测中心的地区，更不能用于“患者床旁检验”和普查的需要，在酶免疫分析的基础上，主要以硝酸纤维素膜为载体的快速诊断方法迅速和广泛地发展起来.这类方法目前在文献及市场上的命名还很不统一.它实际上属于快速斑点免疫结合分析，主要有以下两种方法：斑点免疫渗滤分析DIFA和斑点免疫层析分析DICA.本篇主要介绍以金作为标志物的胶体金免疫分析技术。

金标记免疫分析技术也称免疫胶体金技术,是于1971年建立的一种信号显示技术.此技术最初用于免疫电镜检查,由胶体金颗粒标记抗原或抗体，与组织或细胞中相应的抗体或抗原相结合，在电子显微镜的检查时可起特异的示踪作用。

此后，此技术与银染技术相结合建立的免疫金银染色法，使抗原抗体特异反应信号可在光学显微镜下观察。

近10多年来，利用硝酸纤维素膜（NC）等为固相载体，以胶体金标记的抗原或抗体与特异配体的反应在膜上进行，建立了快速的金标记免疫渗滤技术和金标记免疫层析技术，并在传染病、心血管病、风湿病、自身免疫病的免疫学检测中广泛应用.胶体金是指金微小粒子（0—100nm)分散在另一种物质中所形成的体系，通常指金以微小粒子分散在溶液中所形成的金溶胶,用此金溶胶标记蛋白质（抗原、抗体或SPA、SPG），胶体金颗粒具有高电子密度的特性，故在金标蛋白的抗原抗体结合处,显微镜下可见黑褐色颗粒；当这些标记物在相应的标记处大量聚集时,可在载体膜上呈现红色或粉红色斑点，从而用于抗原或抗体物质的半定量或定性。

与ELISA不同之处便是反应时间大大缩短，仅需要数分钟就完成了ELISA需数小时才能显示的结果。

上海维斯塔生物科技有限公司HIV抗体检测方法有哪些？HIV抗体是常规使用的HIV病原学诊断的方法。

HIV抗体检测方法有初筛试验和确认试验组成。

初筛检测的方法有间接酶联免疫吸附试验（ELISA）、明胶颗粒凝集试验（PA）和金标法（SPOT），确认检测的方法为蛋白印迹试验（WB）。

酶联免疫吸附试验（ELISA）用缓冲去垢剂溶解HIV感染的细胞来提取病毒抗原，以梯度离心将抗原纯化后固定于微孔板上，然后同标本和对照物反应。

目前，国际上普遍采用的是第三代合成的HIV抗原，就是采用目前国际上最先进的第三代合成抗原包被板。

AIDS患者血清中的抗—HIV能与其抗原结合，清洗后加酶联抗人Ig，使其与抗—HIV结合，清洗后加入底物，产生有色反应即为阳性。

还需用Western蛋白印迹法(WB)，免疫荧光法(IFA)或放射免疫沉淀试验(RIPA)进行复证。

目前应用的ELISA法有8种之多。

它们的特异性和敏感性超过99%。

用该法普查正常人群约有0.6—2.7的阳性，因而在正常人群中的阳性结果约为97%为假阳性，对高危人群的检测，其假阳性可降至70%。

颗粒凝集法（PA）PA为快速、简便的一种筛选方法。

其基本原理是将HIV裂解产物或DNA重组的HIV多肽包被到明胶颗粒上，使成致敏颗粒，如被测血清中含有特异抗体，可因抗体的桥连作用使致敏颗粒发生凝集。

如属阳性，应经WB证实。

PA不需任何特殊仪器，其结果用肉眼可判别。

全过程仅需5分钟。

缺点有假阳性。

金标法（SPOT）金标法，又叫“胶体金法”，医学上的名字叫“斑点免疫金渗滤试验”，针对HIV 的检查还有个名字“间接免疫荧光试验（IFA）。

采用双抗原夹心法免疫测定原理，选择经纯化的基因工程制备的抗原，分别作为包被抗原和胶体金结合抗原。

当待检标本中含有HIV抗体时，先上海维斯塔生物科技有限公司和金标记抗原结合，由于层析作用反应复合物沿硝酸纤维膜向前移动，当遇到包被抗原时，形成Ag-Ab-Ag-Au复合物富集在包被线上，形成红色沉淀线。