试验四间充质干细胞的培养及鉴定一

干细胞培养中的细胞鉴定与鉴定方法干细胞是一类具有自我更新能力和多向分化潜能的细胞，对于再生医学和组织工程学等领域具有重要意义。

在干细胞研究中，如何鉴定细胞的特性和状态是非常关键的，这决定了细胞是否具有干细胞特性以及是否处于特定分化状态。

本文将介绍干细胞培养中的细胞鉴定和鉴定方法。

细胞鉴定方法可以分为直接和间接两类。

直接方法是通过检测特定标记分子的表达来鉴定细胞的特性和状态。

间接方法是通过检测细胞的功能或特定的生物学特征来进行鉴定。

一、直接方法1. 免疫细胞化学染色：使用特异性抗体来检测特定标记分子的表达。

例如，使用抗伊普西岛素抗体（insulin）来检测胰岛干细胞的分化状态。

2.免疫荧光染色：利用荧光探针或荧光标记的抗体来检测细胞的表达。

例如，使用CD34抗体来检测造血干细胞的存在。

3.流式细胞术：通过标记特定的细胞表面标记物，然后用荧光染料进行细胞表达的定量检测。

这种方法可以同时检测多个标记物，非常适用于复杂的细胞鉴定。

4.蛋白质组学分析：通过质谱技术鉴定细胞中特定蛋白质的表达水平。

这种方法可以提供更全面的细胞特性信息。

5.基因组学分析：通过测定特定基因的表达水平来鉴定细胞的特性。

例如，使用RT-PCR（逆转录聚合酶链反应）来检测特定基因的mRNA水平。

二、间接方法1.功能鉴定：通过检测细胞的特定生物学功能来鉴定细胞的特性。

例如，使用CFU-GEMM（巨噬细胞-粒系-巨核细胞）分析来鉴定造血干细胞。

2.分化潜能鉴定：通过检测细胞向不同细胞类型分化的潜能来鉴定干细胞。

例如，使用胚胎体外培养（EB）法来鉴定胚胎干细胞的多向分化潜能。

3.遗传学鉴定：通过染色体分析或SNP分析等遗传学方法来鉴定细胞的遗传特性。

例如，通过染色体核型分析来鉴定细胞的倍性和染色体异常情况。

以上方法在干细胞培养中可以互相结合使用，以鉴定细胞的特性和状态。

同时，为了确保细胞的鉴定结果的准确性，还需要采取一系列措施来避免污染和非特异性反应。

小鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养、纯化及鉴定赵继学;王广义;张海玉;伏鑫【摘要】目的探讨分离、培养、纯化和鉴定小鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)方法,观察MSCs体外生长特征.方法取小鼠胫骨和股骨,取出骨髓细胞,用1.073 g/ml的Percoll分离液梯度离心,培养皿培养、换液除去非贴壁细胞,获得MSCs,通过传代对MSCs进行纯化和扩增培养.进行形态学观察,测定生长曲线,用流式细胞仪检测P3代MSCs细胞周期及表面抗原.结果新分离的MSCs呈小圆形,形态规整.培养传代后,细胞大小均匀,形态较一致,多为梭形.P1、P2、P3代MSCs生长曲线均呈S型.P3代MSCs 75.27%的细胞处于G0-G1期.P3代MSCs CD44表达阳性,表达率为88.71%,CD34表达阴性.结论利用密度梯度离心法联合贴壁培养法分离纯化骨髓MSCs,在含15%FBS的DMEM-LG培养基中培养MSCs,可获得稳定生长的昆明小鼠MSCs.培养的MSCs细胞系性状稳定,表型稳定均一,适于做进一步研究.%Objective To explore a new method for the isolation, cultivaton, purification and identification of MSCs and observe the biological features of mice MSCs in vitro. Methods Bone marrow was extracted from the tibia and thighbone of mice. The marrow liquid were isolated with 1. 073 g/ml ocrcoll. MSCs were obtained by removing the non-adherent cells. Then the MSCs were purified and expanded through passage in time. The growth curve was drawn and the morphology was observed. Cell cycle and the antigen expression of P3 MSCs were measured with FACS. Results The MSCs exhibited a small round shape after fresh separation. After cultivated and passaged,the MSCs were homogcnenously fusiform shaped. The growth curves of P1 ,P2 and P3MSCs were "S" shape. The cells of G0-G1 stage account for 75. 27%. The expression of CD 44 was positive, while the expression of CD34 was negative. Conclusion The method of density gradient centrifugation combined with adherent culture could isolate MSCs from bone marrow simplcly. DMEM-LG medium supplemented with 15% fetal bovine scrum is suitable for the culture of MSCs. The cultured MSCs lineage is stable and can be used for further research.【期刊名称】《中国实验诊断学》【年(卷),期】2012(016)001【总页数】3页(P11-13)【关键词】骨髓间充质干细胞;细胞培养;鉴定;小鼠【作者】赵继学;王广义;张海玉;伏鑫【作者单位】吉林大学第一医院儿外科,吉林长春130021;吉林大学第一医院普外科,吉林长春130021;吉林大学第一医院儿外科,吉林长春130021;中日联谊医院【正文语种】中文【中图分类】Q78骨髓间充质干细胞（MSCs）是骨髓中存在的除造血干细胞（HSCs）外的另一类干细胞。

临床研究用人间充质干细胞质量评价一、引言人间充质干细胞（MSCs）由于其多向分化潜能、免疫调节特性以及易于体外培养等特点，被广泛用于临床研究。

在众多疾病的治疗中，MSCs 都展现出了巨大的潜力。

然而，要确保其在临床研究中的有效性，首先需要对MSCs的质量进行严格控制和评价。

本文将探讨如何评价临床研究用MSCs的质量。

二、MSCs的质量评价标准1、细胞的纯度和活性：这是MSCs质量评价的核心指标。

纯度是指MSCs中目标细胞的比例，而活性则是指MSCs的增殖能力和分化能力。

2、细胞的遗传稳定性：通过基因测序等方法，可以检测MSCs是否存在基因突变，以及是否存在潜在的致癌风险。

3、细胞的免疫调节特性：MSCs具有免疫调节特性，可以通过抑制免疫反应来降低排斥反应的风险。

因此，评价MSCs的免疫调节特性也是非常重要的。

4、细胞的来源和生产过程：MSCs的来源和生产过程也会对其质量产生影响。

例如，来自患者的自身MSCs可能比来自捐献者的MSCs更适合用于治疗。

同时，生产过程中的质量控制，如无菌操作、细胞培养基的质量等，也会影响MSCs的质量。

三、MSCs质量评价的方法1、细胞形态观察：通过观察MSCs的形态，可以初步判断其是否具有正常的形态学特征。

2、生长曲线测定：通过绘制MSCs的生长曲线，可以评估其增殖能力。

3、细胞表面标志物检测：通过检测细胞表面标志物，可以确定MSCs 的纯度和活性。

4、染色体核型分析：通过染色体核型分析，可以评估MSCs的遗传稳定性。

5、免疫调节特性检测：通过检测MSCs对免疫反应的调节作用，可以评估其免疫调节特性。

6、生产过程质量控制：通过监控生产过程中的关键控制点，可以确保MSCs的生产过程符合质量标准。

四、结论人间充质干细胞（MSCs）在临床研究中的应用前景广阔，但其质量评价是关键环节。

通过对MSCs的纯度、活性、遗传稳定性、免疫调节特性以及生产过程的质量控制等多方面的评价，可以确保其满足临床研究的需求。

送检中检验实验室间充质干细胞质量标准1. 引言充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）作为一种多功能的细胞类型，具有广泛的临床应用前景。

随着充质干细胞的应用越来越广泛，不同实验室之间对于充质干细胞质量标准的一致性要求也逐渐提升。

本文旨在确立送检中检验实验室间充质干细胞质量标准，以促进充质干细胞研究的进一步发展。

2. 充质干细胞质量标准的选择为了确保实验室间充质干细胞质量标准的一致性，需要选择合适的评估指标。

以下是一些常用的充质干细胞质量标准指标：- 表面标记物：CD105、CD73、CD90阳性；CD45、CD34、CD14、CD11b、CD79a、CD19阴性。

- 多向分化潜能：具备成骨、成脂、成软骨等分化能力。

- 增殖能力：具备较高的增殖速度和活力。

- 免疫抑制功能：能够抑制免疫细胞的活化和增殖。

3. 充质干细胞质量标准的实验方法为了确定充质干细胞质量标准的实验方法，可以参考以下步骤：1. 充质干细胞的培养和扩增：选择合适的培养基和培养条件，确保充质干细胞的良好扩增。

2. 充质干细胞的表面标记物鉴定：通过流式细胞术或免疫荧光染色法，鉴定充质干细胞的表面标记物。

3. 充质干细胞的多向分化潜能鉴定：通过体外培养分化实验，观察充质干细胞在不同诱导条件下的分化能力。

4. 充质干细胞的增殖能力评估：通过MTT法等细胞增殖实验，评估充质干细胞的增殖能力。

5. 充质干细胞的免疫抑制功能评估：通过淋巴细胞增殖实验或ELISA法，评估充质干细胞的免疫抑制功能。

4. 实验室间质检的建立和维护为了确保实验室间充质干细胞质量标准的一致性，需要建立和维护质检体系。

以下是一些建议：- 建立标准化的实验操作流程和质检标准，确保每个实验室的操作规范一致。

- 定期组织质检活动，通过对比不同实验室的质检结果，发现和解决质检过程中的问题。

- 建立质检记录和数据库，记录每次质检的结果和不良事件的处理情况。

分离培养及鉴定骨髓间充质干细胞的方法探析论文分离培养及鉴定骨髓间充质干细胞的方法探析论文骨髓间充质干细胞（BMSCs）也被称为间质祖细胞，由于其巨大的增殖和多向分化潜能，被认为是再生医学、基因治疗和细胞治疗的理想种子来源，已被广泛进行研究[1-3].目前，BMSCs在动物实验和临床应用上取得了巨大的成果，在骨、软骨、肌腱、神经胶质修复、心脏疾病、心肌梗塞、肝脏损伤等方面取得了重大突破[4-6],并且可避免胚胎干细胞和异基因干细胞治疗所涉及的伦理道德和免疫排斥问题，有利于细胞移植。

但是骨髓中的BMSCs含量极少，约占骨髓全细胞的0.001%~0.010%[7];因此，需要在体外分离纯化、培养扩增来满足临床应用和实验研究。

研究表明，不同分离方法和首次换液方式对BMSCs的增殖培养有很大的影响[8].本试验通过观察2种不同分离方法和不同首次换液时间对兔BMSCs生物活性的影响，旨在建立一种有效的分离培养及鉴定BMSCs的方法，以便获得大量、高纯度、高活性、培养周期短的BMSCs,为下一步研究和临床实验提供基础。

1 材料与方法1.1实验动物1月龄雄性新西兰大耳白兔1只，由河南省实验动物中心提供。

1.2主要试剂和仪器胎牛血清（北京四季青）；DMEM-F12（Gibco）；胰蛋白酶（北京拜尔迪生物公司）；DMSO（Gibco）；红细胞裂解液（北京赛驰生物技术有限公司）；生物素标记山羊抗兔IgG、HRP标记链霉亲和素、DAB显色试剂盒、改良型苏木素（北京华肽先锋）；兔抗兔CD34、CD44、CD99抗体（北京博奥森）；封闭山羊血清（北京博奥森）。

HF151UV型CO2培养箱（Heal Force）；倒置显微镜（Leica）;800型离心机、85-2恒温磁力搅拌器：金坛市大地自动化仪器厂；数码相机：日本佳能IXUS 980IS;电子天平：METTLER TOLEDO AL104;超净工作台：AIR TECH;FX101-2型电热鼓风干燥箱：上海树立仪器仪表有限公司；pH计：上海雷磁仪器厂。

送检中检验机构间充质干细胞质量标准引言充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）作为一种多潜能的干细胞，被广泛应用于组织工程、再生医学以及免疫治疗等领域。

由于充质干细胞的质量直接关系到其临床应用的效果和安全性，各个检验机构在进行充质干细胞的质量检验时需要遵循统一的标准。

本文档旨在制定一份统一的充质干细胞质量标准，以确保不同检验机构之间的一致性。

标准内容1. 充质干细胞定义充质干细胞为一类具有自我更新和多向分化潜能的成人软组织起源的凋亡细胞。

2. 充质干细胞分离与培养2.1 分离方法：推荐使用胶原酶及胰酶对组织进行消化分离。

分离过程中需注意细胞的存活率和纯度。

2.2 培养条件：充质干细胞应在适当的培养基中进行培养，包括适宜的营养液、培养基浓度及PH值等。

3. 充质干细胞鉴定3.1 表面标记物：充质干细胞常表达CD73、CD105、CD90，并不表达CD34、CD45和CD11b等表面标记物。

3.2 多向分化潜能：充质干细胞应具备成骨、成脂以及成软骨的分化潜能。

4. 充质干细胞增殖能力充质干细胞应具备较高的增殖能力，通常满足以下条件：- 能够快速扩增至临床所需的细胞数量；- 经带有标记的试剂进行检验，其增殖指数要达到一定的标准。

5. 充质干细胞免疫学特性5.1 免疫抑制作用：充质干细胞应具备对淋巴细胞等免疫细胞的抑制作用。

5.2 免疫抗原性：充质干细胞应具备较低的免疫原性，以减少免疫排斥反应。

结论本文档提供了送检中检验机构间充质干细胞质量标准的基本内容，以确保对充质干细胞的质量检验具有一致性。

各个检验机构应根据实际需求，在此基础上进行进一步的细节制定，以提高充质干细胞的质量控制水平。

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isct 间充质干细胞鉴定标准理论说明1. 引言1.1 概述在细胞治疗和再生医学领域，间充质干细胞（ISCT）作为一种重要的细胞资源，引起了广泛的关注。

ISCT具有多向分化潜能、免疫调节作用及促进组织修复的能力，被认为是一种理想的干细胞来源。

然而，由于缺乏统一和规范的鉴定标准，在实践应用中存在着不确定性和挑战。

1.2 文章结构本文将对ISCT进行深入探讨，并重点介绍其鉴定标准的理论说明。

文章包括以下几个部分：引言、ISCT间充质干细胞、鉴定标准理论说明、实践应用与挑战以及结论与展望。

1.3 目的本文旨在系统梳理当前关于ISCT鉴定标准的理论知识，并探讨该领域面临的实践应用和挑战。

通过对ISCT表面标记物使用、功能性特征评估方法以及分子生物学检测手段应用等方面原理的介绍，希望能够提供给读者一个全面的理论基础，并展望ISCT鉴定标准未来的发展方向。

同时，对于临床转化前景展望、存在的问题与挑战以及解决方案和研究进展等方面也将进行讨论。

以上是本文“1. 引言”部分的详细内容。

该部分概述了文章的主题和目的，并介绍了本文的结构。

接下来将继续展开描述ISCT间充质干细胞及其鉴定标准相关内容。

2. ISCT间充质干细胞2.1 定义与特征ISCT（国际干细胞治疗学会）定义了间充质干细胞（MSCs）作为一类多潜能的成体干细胞，具有自我更新和多向分化的能力。

这些细胞可以从不同来源获得，包括骨髓、脐带血、脂肪组织等。

ISCT认为，MSCs应满足以下三个基本标准：1) 在培养条件下，MSCs应具备黏附能力；2) MSCs应表达特定的表面标记物，如CD73、CD90和CD105，并且在同时应该缺乏（或仅有极低水平）CD34、CD45、HLA-DR等造血和免疫相关标记物；3) MSCs应能够分化为成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞等不同种类的细胞。

此外，ISCT提出了额外的功能性特点来进一步确认MSCs。

这些功能性特点包括：1) 免疫调节作用：MSCs可以抑制免疫反应，并通过调节T淋巴细胞、B 淋巴细胞和自然杀伤细胞等免疫细胞的功能来达到免疫调节作用；2) 细胞迁移能力：MSCs具有从注射部位向受损组织迁移的能力；3) 分泌多种生物活性分子：MSCs可以产生多种生长因子、细胞因子和表观遗传调控因子，对损伤修复和组织再生具有重要作用。

间充质干细胞培养方法1. 间充质干细胞MSC基本形态2. 干细胞应用与干细胞调控;3. 间充质干细胞MSC生长过程4. 间充质干细胞MSC培养的合适气体环境5. 细胞培养板的选择6. 如何选用细胞培养基7. 如何维持培养液p H8. 血清与干细胞的培养9. 胎牛血清F B S 是否需要灭活10. 细胞的细菌、真菌污染及排除11. 细胞培养污染的预防12. 使用胰蛋白酶时加入E DTA的目的是什么13. 胶原酶的种类和选型14. 胶原酶V S胰酶15. 干细胞的种类和表面标记16. 间质干细胞培养原理概述17. 间质干细胞成脂和成骨诱导分化18. 干细胞老化的表现和处理19. 细胞传代消化过程指导20. 冷冻保护剂作用和选择21. 细胞冻存指导22. 干细胞冷冻和复苏23. 移植细胞的基因修饰1．间充质干细胞MSC基本形态体外培养细胞根据它们在培养器皿是否能贴附于支持物上生长特征,可分为贴附型生长细胞,常表现为成纤维型细胞和上皮细胞;悬浮型细胞在培养中悬浮生长;间充质干细胞MSC基本形态：形态与成纤维细胞类似,细胞在支持物表面呈梭形或不规则三角形生长,细胞中央有卵圆形核,胞质向外伸出2－3 厘米个长短不同的突起;可看到细胞成螺旋状生长;2．干细胞应用与干细胞调控干细胞的调控是指给出适当的因子条件,对干细胞的增殖和分化进行调控,使之向指定的方向发展;2.1内源性调控干细胞自身有许多调控因子可对外界信号起反应从而调节其增殖和分化,包括调节细胞不对称分裂的蛋白,控制基因表达的核因子等;另外,干细胞在终末分化之前所进行的分裂次数也受到细胞内调控因子的制约;1胞内蛋白对干细胞分裂的调控干细胞分裂可能产生新的干细胞或分化的功能细胞;这种分化的不对称是由于细胞本身成分的不均等分配和周围环境的作用造成的;细胞的结构蛋白,特别是细胞骨架成分对细胞的发育非常重要;如在果蝇卵巢中,调控干细胞不对称分裂的是一种称为收缩体的细胞器,包含有许多调节蛋白,如膜收缩蛋白和细胞周期素A;收缩体与纺锤体的结合决定了干细胞分裂的部位,从而把维持干细胞性状所必需的成分保留在子代干细胞中;2转录因子的调控在脊椎动物中,转录因子对干细胞分化的调节非常重要;比如在胚胎干细胞的发生中,转录因子Oct4 是必需的;Oct4 是一种哺乳动物早期胚胎细胞表达的转录因子,它诱导表达的靶基因产物是FGF-4 等生长因子,能够通过生长因子的旁分泌作用调节干细胞以及周围滋养层的进一步分化;Oct4 缺失突变的胚胎只能发育到囊胚期,其内部细胞不能发育成内层细胞团;另外白血病抑制因子LIF对培养的小鼠ES 细胞的自我更新有促进作用,而对人的成体干细胞无作用,说明不同种属间的转录调控是不完全一致的;又如Tcf/Lef 转录因子家族对上皮干细胞的分化非常重要;Tcf/Lef 是Wnt 信号通路的中间介质,当与β-Catenin 形成转录复合物后,促使角质细胞转化为多能状态并分化为毛囊;2.2外源性调控除内源性调控外,干细胞的分化还可受到其周围组织及细胞外基质等外源性因素的影响;1分泌因子间质细胞能够分泌许多因子,维持干细胞的增殖,分化和存活;有两类因子在不同组织甚至不同种属中都发挥重要作用,它们是TGFβ家族和Wnt 信号通路;比如TGF 家族中至少有两个成员能够调节神经嵴干细胞的分化;最近研究发现,胶质细胞衍生的神经营养因子GDNF不仅能够促进多种神经元的存活和分化,还对精原细胞的再生和分化有决定作用;GDNF 缺失的小鼠表现为干细胞数量的减少,而GDNF的过度表达导致未分化的精原细胞的累积;Wnts 的作用机制是通过阻止β-Catenin 分解从而激活Tcf/Lef 介导的转录,促进干细胞的分化;比如在线虫卵裂球的分裂中,邻近细胞诱导的Wnt 信号通路能够控制纺锤体的起始点和内胚层的分化;2膜蛋白介导的细胞间的相互作用有些信号是通过细胞-细胞的直接接触起作用的;β-Catenin 就是一种介导细胞粘附连接的结构成分;除此之外,穿膜蛋白Notch及其配体Delta 或Jagged 也对干细胞分化有重要影响;在果蝇的感觉器官前体细胞,脊椎动物的胚胎及成年组织包括视网膜神经上皮、骨骼肌和血液系统中,Notch 信号都起着非常重要的作用;当Notch 与其配体结合时,干细胞进行非分化性增殖；当Notch 活性被抑制时,干细胞进入分化程序,发育为功能细胞;3整合素Integrin与细胞外基质整合素家族是介导干细胞与细胞外基质粘附的最主要的分子;整合素与其配体的相互作用为干细胞的非分化增殖提供了适当的微环境;比如当β1整合素丧失功能时,上皮干细胞逃脱了微环境的制约,分化成角质细胞;此外细胞外基质通过调节β1整合素的表达和激活,从而影响干细胞的分布和分化方向;2.3干细胞的可塑性越来越多的证据表明,当成体干细胞被移植入受体中,它们表现出很强的可塑性;通常情况下,供体的干细胞在受体中分化为与其组织来源一致的细胞;而在某些情况下干细胞的分化并不遵循这种规律;1999 年Goodell 等人分离出小鼠的肌肉干细胞,体外培养5 天后,与少量的骨髓间质细胞一起移植入接受致死量辐射的小鼠中,结果发现肌肉干细胞会分化为各种血细胞系;这种现象被称为干细胞的横向分化trans-differentiation ;关于横向分化的调控机制目前还不清楚;大多数观点认为干细胞的分化与微环境密切相关;可能的机制是,干细胞进入新的微环境后,对分化信号的反应受到周围正在进行分化的细胞的影响,从而对新的微环境中的调节信号做出反应;3．间充质干细胞MSC生长过程潜伏期→指数增生期→停滞期1潜伏期latent phase 细胞接种后,先经过一个在培养液中呈悬浮状态的悬浮期;此时,细胞质回缩, 胞体呈圆球形,然后细胞贴附于载体表面,称贴壁,悬浮期结束;细胞贴壁速度与细胞种类, 培养基成分,载体的理化性质等密切相关;一般情况下,原代培养细胞贴壁速度慢,可达10-24 小时或更多, 而传代细胞系贴壁速度快, 通常10-30分钟即可贴壁;细胞贴壁后还需经过一个潜伏阶段,才进入生长和增殖期;原代培养细胞潜伏期长,约24-96 小时或更长, 连续细胞系和肿瘤细胞潜伏期短,仅需6-24 小时;2指数增生期logarithmic growth phase这是细胞增殖最旺盛的阶段,分裂相细胞增多;指数增生期细胞分裂相数量可作为判定细胞生长是否旺盛的一个重要标志;通常以细胞分裂相指数Mitotic index, MI 表示,即细胞群中每1000 个细胞中的分裂相数;一般细胞的分裂指数介于0.1%-0.5% ,原代细胞分裂指数较低,而连续细胞和肿瘤细胞分裂相指数可高达3％－5％;指数增生期的细胞活力最好时期,是进行各种实验最佳时期,也是冻存细胞的最好时机;在接种细胞数量适宜情况下,指数增生期持续3－5 天后,随着细胞数量不断增多、生长空间减少,最后细胞相互接触汇合成片;正常细胞相互接触后能抑制细胞运动,这种现象称接触抑制现象contact inhibition;而恶性肿瘤细胞无接触抑制现象,能继续移动和增殖,导致细胞向三维空间扩展,使细胞发生堆积piled up;细胞接触汇合成片后,虽然发生接触抑制,但只要营养充分,细胞仍能进行增殖分裂,因此细胞数仍然在增多;但是,当细胞密度进一步增大,培养液中营养成分减少,代谢产物增多时,细胞因营养枯竭和代谢产物的影响,导致细胞分裂停止,这种现象称密度抑制现象Density Inhibition;3停滞期Stagnate phase 细胞数量达到饱和密度后,如不及时进行传代,细胞就会停止增殖,进入停止期;此时细胞数持平,故也称平台期Plateau phase;停滞期细胞虽不增殖,但仍有代谢活动;如不进行分离传代,细胞会因培养液中营养耗尽、代谢产物积聚、pH 下降等因素中毒,出现形态改变,贴壁细胞会脱落,严重的会发生死亡,因此,应及时传代;4．间充质干细胞MSC培养的合适气体环境干细胞相关的培养液都必须在5％CO2 的气体环境中培养使用;否则会对细胞产生影响;气体是哺乳动物细胞培养生存必需条件之一,所需气体主要有氧气和二氧化碳;氧气参与三羧酸循环,产生供给细胞生长增殖的能量和合成细胞生长所需用的各种成分;开放培养时一般把细胞置于95%空气加5%二氧化碳混合气体环境中;二氧化碳既是细胞代谢产物也是细胞生长繁殖所需成分,它在细胞培养中的主要作用在于维持培养基的pH 值;大多数细胞的适宜pH 为7.2-7.4,偏离这一范围对细胞培养将产生有害的影响;一般情况下,细胞耐酸性比耐碱性大一些,在偏酸环境中更利于细胞生长;5．细胞培养板的选择细胞培养板依底部形状的不同可分为平底和圆底U 型和V 型；培养孔的孔数有6、12、24、48、96、384、1536 孔等；根据材质的不同有Terasaki 板和普通细胞培养板;具体选择时根据培养细胞的类型、所需培养体积及不同的实验目的而定;1平底和圆底U 型和V 型培养板的区别和选择不同形状的培养板有不同用途;培养细胞,通常是选用平底的,这样便于镜下观测、有明确的底面积、细胞培养液面高度相对一致;因此做MTT 等实验时,无论是贴壁和悬浮细胞,一般选用平底板;测吸光值一定要使用平底的培养板;要特別注意材质,标示“Tissue Culture TC Treated”是养细胞用的; U 型或V 型板,一般在某些特殊要求時才使用;如在免疫学方面,当做两种不同淋巴细胞混合培养時,需要二者相互接触刺激,这时一般会选用U 型板,因为细胞会由于重力的作用而聚集在很小的范围内內;圆底培养板还会用于同位素掺入的实验,需要用细胞收集仪收集细胞的培养,如“混合淋巴细胞培养”等;V型板常用做细胞杀伤、免疫学血凝集实验;细胞杀伤这种实验也可用U 型板替代加入细胞后,低速离心;2Terasaki 板和普通细胞培养板的区别Terasaki plate主要是用于晶体学研究,产品设计便于对晶体的观察与结构分析;有两种sitting 和handing drop 两种方法,两种方法应用产品的外形结构也不同;材料上选择crystal class polymer ,特殊的材料有利观察晶体结构;细胞培养板主要是PS 材料,材料是treated sufface,便于细胞贴壁生长与伸展;当然还有浮游细胞的生长材料,同时还有low binding surface3细胞培养板与酶标板的区别酶标板一般要比细胞培养板贵,细胞板主要做细胞培养,也可以用来测蛋白浓度；酶标板包括包被板和反应板,一般不用做细胞培养,它主要做免疫酶联反应后的蛋白检测,需要更高的要求和特定的酶标工作液;4 常用不同培养板的孔底面积及推荐加液量不同孔板所加培养液的液面都不宜太深,一般在2~3mm 范围,结合不同孔的底面积就可算出各培养孔的适宜加液量参考下表;若加液量过多会影响气体氧气交换,而且在搬动过程中易溢出造成污染;具体所加细胞密度依实验的目的不同灵活掌握;常用的培养器皿培养器皿底面积cm2 加培养液量mL 可获细胞量96 孔培养板0.32 0.1 10524 孔培养板2 1.0 5×10512 孔培养板4.5 2.0 1066 孔培养板9.6 2.5 2.5×1064 孔培养板28 5.0 7×1063.5cm 培养皿8 3.0 2.0×1066cm 培养皿21 5.0 5.2×1069cm 培养皿49 10.0 12.2×10610cm 培养皿55 10.0 13.7×10625cm 塑料培养瓶25 5.0 5.2×10675cm 塑料培养瓶75 15~30 2×10725cm 玻璃培养瓶19 4.0 3×106100cm 玻璃培养瓶37.5 10.0 6×106250cm 玻璃培养瓶78 15.0 2×1072500cm 旋转培养瓶700 100~250 2.5×108注：各种单层生长的细胞在培养皿中长满的细胞数,主要取决于器皿底表面积和细胞体积的大小;上表以293 细胞为例给出的可获细胞量仅作参考;6．如何选用细胞培养基培养基是维持体外细胞生存和生长的基本溶液,是组织细胞培养时最重要的条件;细胞培养基大致有：1合成培养基主要成分为：氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐、辅助物质核酸降解物、氧化还原剂等;常用的有：①199细胞培养基及其改良品种; 1950年由Morgan 等设计,除BSS 外,含有53 种成分,添加适量的血清后,可广泛用于多种细胞培养、病毒学、疫苗生产等; 199 HB细胞培养基,主要应用于Vero 细胞、地鼠肾细胞转瓶培养生产狂犬、乙脑等疫苗,具有高缓冲性能,能够有效提高病毒滴度;②BME细胞培养基;基础Eagle 培养基Basal Medium Eagle,1955 年由Eagle 设计,BSS＋12 种氨基酸＋谷氨酰胺＋8种维生素;简单、便于添加,适于各种传代细胞系和特殊研究用,在此基础上改良的细胞培养基品种有MEM、DMEM、IMDM 等;③MEM细胞培养基;低限量Eagle 培养基Minimal Essential Medium,1959 年修改配方,删去赖氨酸、生物素,增加氨基酸浓度,适合多种细胞单层生长,是一种最基本、适用范围最广的培养基,是一种被广泛应用的培养基;需要注意的是,MEM 细胞培养基有含Earle's 平衡盐的类型,也有含Hanks'平衡盐的类型；有高压灭菌型的,也有过滤除菌型的；还有含非必需氨基酸的类型;生产和科研时,应根据实际情况注意选择合适的MEM 细胞培养基;另外,因MEM 培养基营养成分所限,针对生产之特定细胞培养与表达时,并不一定是使用效果最佳或者最经济的培养基;④DMEM细胞培养基及其改良品种; DMEM 由Dulbecco 改良的Eagle 培养基,各成份量加倍,分低糖1000mg/L、高糖4500mg/L ;细胞生长快;附着稍差的肿瘤细胞、克隆培养用高糖效果较好,常用于杂交瘤的骨髓瘤细胞和DNA 转染的转化细胞培养;例如CHO 细胞表达生产乙肝疫苗、CHO 细胞表达EPO;⑤IMDM 细胞培养基; IMDM 是由Iscove's 改良的Eagle 培养基,增加了几种氨基酸和胱氨酸量;可用于杂交瘤细胞培养,以及无血清培养的基础培养基;⑥RPMI-1640 细胞培养基; Moore 等人于1967 年在Roswell Park Memorial Institute 研制,针对淋巴细胞培养设计,BSS＋21种氨基酸＋维生素11 种等,广泛适于许多种正常细胞和肿瘤细胞,也用做悬浮细胞培养;⑦Fischer’s细胞培养基;用于白血病微粒细胞培养;⑧HamF10、F12 细胞培养基; 1963 年、1969 年由Ham 设计,含微量元素,可在血清含量低时用,适用于克隆化培养;F10适用于仓鼠、人二倍体细胞,F12 适用于CHO 细胞;⑨DMEM/F12细胞培养基; DMEM 和F12 细胞培养基按照1:1 比例混合效果最佳,营养成分丰富,且可以使用较少血清,或作为无血清培养基的基础培养基;2低血清细胞培养基主要应用于VERO 细胞、BHK21 细胞等细胞在转瓶、微载体反应器中的培养;3无血清培养基是设计用来在无血清条件下促使特殊类型的细胞生长或进行专门应用的培养基;需要添加生长因子和或细胞因子,含有个别蛋白或大量蛋白组分;4替代天然培养基培养基中不包含有蛋白、水解产物或未知结构的组分,所有的成分均有已知的化学结构;面对如此多的细胞培养基,对细胞培养基的选用,建议：①可以查阅相关文献,或在购买细胞株时咨询选用最适合细胞株的培养基,或购买相配套的细胞培养基产品;②许多培养基都适合多种细胞株的培养,可以采用现有的培养基进行试验;③根据细胞株的特点、实验的需要来选择培养基;如小鼠细胞株多选1640；进行细胞杂交、基因转移实验,可选择IMDM;④结合细胞特性及培养基的培养效能,用多种培养基培养目的细胞,观察其生长状态,可以用生长曲线、克隆形成率等指标判断,根据实验结果选择最佳培养基;注：目前也有不少商业化的msc培养基,如百恩维的间充质干细胞无血清培养基,间充质干细胞培养基低血清7．如何维持培养液p H配好的培养液变碱变紫红是正常的现象;暴露在空气中的培养液,因为大气中二氧化碳的浓度很低,培养液中的HCO3 -被渐渐耗掉,培养液的pH值也逐渐升高,变成了紫红色;如果培养基pH值偏碱的程度不大,可将装培养液的瓶口拧松,放置于二氧化碳培养箱中一段时间,让培养箱中的CO2进入培养液,pH 值就可以纠正;如果pH值偏离的程度很大,可以通过添加少量无菌的H Cl 或者NaOH调节pH,便可以使用;将配制好的培养基小剂量分装,可以避免反复开盖引起其中的二氧化碳逸出而造成pH升高;同时因NaHCO3遇热不稳定,会分解释放出CO2 ,而使培养基的pH升高,偏碱;因此在配置使用培养的过程中应注意：1动作迅速,不可使培养液长时间处于较高室温下；2配置过程中,混匀时切不可加热;混匀后应立即放入4°C 冰箱,待过滤时再取出；3使用完毕应尽快将瓶口封好,放于4°C 冰箱保存;通过在培养液中同时添加Hepes 也可以有效的稳定pH 值;Hepes 羟乙基哌嗪乙硫磺酸是一种非离子两性缓冲液,它在pH 7.2～7.4范围内具有较好的缓冲能力;其最大优点是在开放式培养或细胞观察时能维持较恒定的pH 值;在这种培养条件下,细胞培养瓶的盖子应拧紧,以防止培养液中所需的少量碳酸盐散入空气中;该缓冲液使用的终浓度为10～50mmol/L,一般培养液内含20mmol/L Hepes 便可达到缓冲能力;Hepes 的使用方法有以下两种：1Hepes 可按所需的浓度直接加入到配制的培养液中,再过滤除菌;每1000ml 培养液中加入2.38 克HEPES,溶解后用1N NaOH 调pH 至7.2,过滤除菌后使用;此时HEPES 的使用浓度为10 mmol/L;2配成100x 贮存液1 mol/L,使用前取99mL 培养液加入lmL 贮存液,最终应用浓度仍为10 mmol/L;1 mol/L 100xHepes 贮存液配制方法：取23.8g Hepes 溶于90ml 双蒸水中,用1N NaOH 调pH 至7.5～8.0,然后用水定容至100mL,过滤除菌,分装小瓶2mL/瓶,4℃或-20℃保存;8．血清与干细胞的培养干细胞在体内存在的量很少,处在一个个环境相对稳定的“niche”中,所以一旦完成分离进入体外环境,最重要的就是保证细胞的活力不受影响,那么就必须提供一个相对稳定的培养环境;这些环境就是靠培养基和培养箱来提供了;培养液中最重要的莫过----血清,特别是对干细胞来说;所以为了最优的干细胞培养效果,推荐选用对应的干细胞专用血清;牛血清是最常用的,但是根据血清的来源不同又可以分为小牛血清、新牛血清、胎牛血清;胎牛血清应取自剖腹产的胎牛；新牛血清取自出生24 小时之内的新生牛；小牛血清取自出生10－30 天的小牛;显然,胎牛血清是品质最高的,因为胎牛还未接触外界,血清中所含的抗体、补体等对细胞有害的成分最少,所以也成为了干细胞培养的首选; 培养中如何正确的使用血清避免不好的影响呢血清的浓度：对大部分的干细胞,最佳的血清浓度是10%;过高的血清浓度会导致细胞出现分化的现象,如果是需要高浓度的血清,培养的时间也不能超过两周,否则会导致细胞分化能力下降;过低的血清会导致细胞的增殖速度下降;血清的溶解：必须在4℃进行,最好过夜溶解;这样可以减少沉淀的产生,避免营养物质的流式;同时也要避免血清的过滤,如果需要过滤可以和培养基一起过滤;细胞培养液中添加的血清有牛血清、马血清、人血清等,其中牛血清是最常用的血清,分为胎牛血清和新生小牛血清;胎牛血清是从母牛破腹取出的胎牛中分离出的血清,价格昂贵;新生小牛血清是从刚出生的尚未哺乳的小牛中分离出来的血清,如厂家能做到这一点,新生小牛血清的质量与胎牛血清的质量相差不大;如小牛出生后已哺乳,从这种小牛中取出的血清中可能含有较多的生物活性物质,其质量明显不如前两种;血清的质量,种类及使用的浓度都有可能影响细胞的生长,而不同批次的血清支持细胞生长的能力也不同,尤其是对克隆细胞的生长,某些批次血清可能含有毒性或抑制细胞生长的物质;注意以下几点：1需要长期保存的血清必须储存于-20℃或-80℃低温冰箱中;4℃冰箱中保存时间切勿超过1 个月;由于血清结冰时体积会增加约10％,因此,血清在冻入低温冰箱前,必须预留一定体积空间,否则易发生污染或玻璃瓶冻裂;2瓶装血清解冻需采用逐步解冻法：-20 ℃或-80 ℃低温冰箱中的血清放入4℃冰箱中溶解1 天;然后移入室温,待全部溶解后再分装;在溶解过程中需不断轻轻摇晃均匀小心勿造成气泡,使温度与成分均一,减少沉淀的发生;切勿直接将血清从-20 ℃进入37℃解冻,这样因温度改变太大,容易造成蛋白质凝集而出现沉淀;影响使用效果3热灭活是指56℃, 30 分钟加热已完全解冻的血清;加热过程中須規則搖晃均勻;此热处理的目的是使血清中的补体成分complement 灭活;除非必须,一般不建议作此热处理,因为热处理会造成血清沉淀物显著增多,而且还会影响血清的质量;补体参与反应有：细胞毒作用, 平滑肌细胞收缩, 肥大细胞和血小板释放组胺, 增强吞噬作用, 促进淋巴细胞和巨噬细胞发生化学趋化和活化;4 切勿将血清在37℃放置太久,否则血清会变得浑浊,同时血清中的有效成分会破坏而影响血清质量;5血清中的沉淀物絮状物：主要是血清中的脂蛋白变性及解冻后血清中纤维蛋白造成,这些絮状物不会影响血清本身的质量;可用离心3000rpm, 5 分钟去除,也可不用处理;显微镜下“小黑点”：经过热处理过的血清,沉淀物的形成会显著增多;有些沉淀物在显微镜下观察象“小黑点”,常误认为血清受污染;一般情况下,此小黑点不会影响细胞生长;9．胎牛血清F B S 是否需要灭活灭活的目的是去除血清中的补体成分,避免补体对细胞产生细胞毒害作用;胎牛血清FBS对许多细胞系均有促生长作用,主要适用于细胞株的保藏及特殊用途的细胞株的体外培养;胎牛血清是取自剖腹产的胎牛;因为胎牛还未接触外界,血清中所含的抗体、补体等对细胞生长有害的成分最少,质量是最高的;所以不必要灭活;10．细胞的细菌、真菌污染及排除真菌污染是细胞培养过程中最常见的一种,尤其在梅雨季节进行细胞培养更易污染;污染培养细胞的多为烟曲霉、黑曲霉、毛霉菌、孢子霉、白念珠菌、酵母菌等;霉菌污染后多数在培养液中形成白色或浅黄色漂浮物;一般肉眼可见,较易被发现,短期内培养液多不混浊,倒置显微镜下可见于细胞之间纵横交错穿行的丝状、管状、及树枝状菌丝,并悬浮飘荡在培养液中;很多菌丝在高倍镜可见到有链状排列的菌珠；念珠菌或酵母菌形态呈卵形,散在细胞周边和细胞之间生长;镜下看时,要将培养瓶用酒精棉球擦干净,以防止与瓶外尤其瓶底外面生长的菌丝相混淆;真菌污染后,细胞生长变慢,但最后由于营养耗尽及毒性作用而使细胞脱落死亡;细菌是一种原核细胞微生物,其大小以微米μm计;常见的污染细菌有革兰氏阴性菌和大肠杆菌、假单胞菌等,革兰氏阴性菌中白色葡萄球菌等比较常见;一旦发生细菌污染较易发现,多数情况下培养液短期内颜色变黄,表明有大量酸性物质产生,出现明显混浊现象；有时静置的培养液液体初看不混浊,但稍加振荡,就有很多混浊物漂起;倒置显微镜下观察,可见培养液中有大量圆球状颗粒漂浮;必要时可取少量培养液涂片染色检查以证实细菌种类；有的培养液改变不明显而又疑有污染,可取出少量培养液用普通肉汤接种或用未加双抗药物的培养液接种,也可取10ml 细胞悬液以100rpm 离心5min,沉淀中加入无抗生素的培养液2ml,置于37℃培养,24h 可得结果;污染后细胞发生病理改变,胞内颗粒增多、增粗, 最后变圆脱落死亡,造成试验失败和细胞株系丢失;细菌和真菌污染多在传代、换液、加样等开放性操作之后发生,而且由于增生迅速,多再发生污染48h 以内就已明显;在实验的最初两天密切观察实验样品是否有污染发生,有利于及时采取措施予以补救或排除;培养细胞一经污染,多数较难处理;如果污染细胞价值不大,宜弃之；有细胞株留存的或可购置的,可在寻找原因后彻底消毒操作室和二氧化碳培养箱若发现真菌污染,可在污染孔内加入1mol/L氢氧化钠或硫酸铜。

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间充质干细胞成脂成骨分化实验方法学开发思路和流程干细胞是一种具有自我更新能力和多潜能分化的细胞，可以分化成为各种类型的细胞，包括脂肪细胞和骨细胞。

间充质干细胞（MSCs）是一种重要的干细胞类型，它们存在于各种组织中，如骨髓、脂肪组织和胎盘组织等。

间充质干细胞成脂成骨分化的实验方法学开发，是生物医学研究中一个重要的课题。

本文将从方法学开发的思路和流程入手，对间充质干细胞成脂成骨分化实验方法学进行探讨。

一、研究背景间充质干细胞成脂成骨分化是指间充质干细胞在一定的诱导条件下分化为脂肪细胞或骨细胞的过程，这一过程在细胞生物学和再生医学领域具有重要意义。

成脂成骨分化的研究有助于深入了解骨质疏松症、骨折愈合和脂肪代谢等疾病的发病机制，同时也为干细胞治疗提供了理论基础。

因此，开发一套可靠的实验方法学对于间充质干细胞成脂成骨分化研究至关重要。

1.确定分化诱导条件间充质干细胞在体外培养时，可通过添加不同的生长因子、细胞因子或药物来诱导其分化为脂肪细胞或骨细胞。

因此，确定最佳的分化诱导条件是方法学开发的第一步。

此过程需要考虑到诱导因子的种类、浓度、培养时间等因素，以及不同来源的间充质干细胞在分化过程中的差异性。

2.确定评价指标分化过程中，需要通过一系列的生物化学和分子生物学方法来评价间充质干细胞的脂肪细胞或骨细胞特征。

这些评价指标包括脂肪细胞的油红O染色、脂肪球形成实验，以及骨细胞的矿化实验、ALP染色等。

确定合适的评价指标对于评估分化效果至关重要。

3.确定实验方案在确定了分化诱导条件和评价指标后，需要制定详细的实验方案。

包括细胞的处理方法、诱导条件的优化、实验的时间节点等，以便后续实验的顺利进行。

1.间充质干细胞的提取和培养首先需要从适当的组织中分离和提取间充质干细胞，并进行细胞培养。

这一步需要注意细胞的纯度和活性，以保证后续实验的准确性。

2.分化诱导实验将培养好的间充质干细胞分别进行脂肪和骨分化诱导实验，根据预先确定的诱导条件进行处理。