．1神经干细胞的原代培养
1)在无菌工作台上取24小时新生SD大鼠4只，乙醚气体麻醉后(也
可无需麻醉)，用酒精消毒皮肤。
2)无菌工作台中，用带有无菌手套的左手拿握住消毒后的新生大鼠，
充分暴露头部，右手使用已灭菌后的眼科剪打开新生大鼠脑部，按无菌操
作规则断头取脑，PBS漂洗3次后，用D．Hanks液漂洗1次，在解剖显
微镜下切取前脑侧脑室周围脑组织(含海马)，仔细剔除脑膜和血管等结缔
组织后，放入D．Hanks液中冲洗。
．3)在无菌工作台上，用眼科剪将脑组织剪碎至大约0．5mm2的小块，
用吸管反复轻柔吹打成细胞悬液。收集细胞悬液后先后在100目和200
目铜网上过滤，从而获得单细胞悬液。
4)细胞计数：用O．4％台盼蓝与细胞悬液按比例均匀混合，血球计数
板在显微镜下计数台盼蓝呈阴性的活细胞，小细胞团按单个细胞计数。
5)细胞计数后，放入50ml一次性培养瓶中培养(4～5)x105个活离的细胞(已经凋亡或者其它细胞)无需胰蛋白酶消化液消化剥离，培养期间密切观察细胞生长情况。(无血清条件培养液有能刺激NSC分裂增殖的细胞因子，所以只有NSC能存活)
．2神经干细胞的传代
大鼠脑NSC在培养2．-一3d成云雾状，不规则的球形细胞团，4---，6d
后成为悬浮生长的神经球。将悬浮细胞液吸出，采用1000r／min离心
5min，弃上清，加入无血清条件培养基，仍用细口径直吸管吹打为单细胞
悬液，将细胞重悬，调整细胞浓度为(4～5)×105／ml，依照原条件继续培养。
同时取出部分细胞用于NSC的鉴定。
Nestin免疫组化检测步骤：
1)将分离出的部分NSC浓悬液，1000 r／min离心5 min，弃上清；
2)加入2ml配制好的4％多聚甲醛，室温固定15---，20分钟；
3)PBS浸洗3min 2次，去上清；
4)Triton液破膜10 min；
5)PBS浸洗3min洗3次，离心去上清，用残留的一滴PBS重悬细
胞，将细胞滴在涂有O．1％多聚赖氨酸处理过载玻片上。自然干燥，让细
胞贴在载玻片上；
6)3％I-1202浸润细胞10 min灭活内源性过氧化物酶；
7)滴入正常5％胎牛血清室温封闭20min。甩去多余液体，不洗；
8)滴加1：300稀释后的兔抗鼠单克隆nestin抗体4。C过夜。PBS
洗2 min 3次；
9)将抗体轻轻甩去，用PBS缓冲液加满洗涤3次，每次5min；
10)滴加第二抗体，37℃孵育40min后轻轻甩去二抗后用PBS洗涤3
次，每次5min；
11)滴加DAB显色剂后镜下控制显色1 5min，用清水终止显色；
研究论文
12)滴加苏木素复染2min后用自来水终止DAB显色，用O．5％盐酸
酒精分化5s后立刻用自来水轻柔冲洗至玻片变蓝。13、)分别在80％、90％、无水乙醇染色缸中各蘸一下，滴加少量二甲
朱琼，女，1990年生，重庆市人，汉族，2009年第三军医大学毕业，在读硕士，主要从事神经干细胞治疗阿尔茨海默病的作用及机制研究。 通讯作者：徐亚丽，博士，副主任医师，副教授，解放军第三军医大学第二附属医院超声科，重庆市 400037 Zhu Qiong, Studying for master’s degree, Department of Ultrasound, Second Affiliate Hospital of Third Military Medical University, Chongqing 400037, China Corresponding author: Xu Ya-li, M.D., Associate chief physician, Department of Ultrasound, Second Affiliate Hospital of Third Military Medical University, Chongqing 400037, China 神经干细胞的培养鉴定及分化 朱 琼1，皋月娟2，高顺记1，陈 重1，刘 政1，徐亚丽1(1解放军第三军医大学第二附属医院超声科，重庆市 400037；2解放军第三○二医院超声科，北京市 100039) 引用本文：朱琼，皋月娟，高顺记，陈重，刘政，徐亚丽. 神经干细胞的培养鉴定及分化[J].中国组织工程研究，2017，21(17):2708-2713. DOI: 7.17.014 ORCID: 0000-0002-1810-5009(朱琼) 文章快速阅读： 不仅能分化为多种类型的神经细胞替代缺失神经组织，同时能产生多种细胞因子，如脑源性神经营养因子、神经生长因子及胶质源性神经营养因子等，并促进突触发生，调节其可塑性，且能重建部分环路和功能，是神经元替代治疗的理想靶细胞。 细胞分化：指同一来源的细胞逐渐由全能到多能，最后到单能，从而产生形态功能不同的细胞群的过程，其本质是基因组在时间和空间上的选择性表达。如神经干细胞能分化为多种类型神经细胞：星形胶质细胞、小胶质细胞及神经元。同时该过程受局部微环境调节，多种理化因素都能诱导全能细胞产生分化，如血清诱导神经干细胞分化。 摘要 背景：神经干细胞在神经损伤修复和退行性疾病中有广泛的应用前景，体外培养鉴定及促神经元诱导分化是后续研究的基础。 目的：采用悬浮神经球培养法分离培养神经干细胞并对其鉴定，了解生物学特性。 方法：采用悬浮神经球培养法从C57BL/6胎鼠大脑半球分离培养神经干细胞，观察形态特征及超微结构，CCK-8法绘制生长曲线，流式细胞仪检测细胞周期，免疫荧光法检测特异性标志蛋白Nestin 的表达；用体积分数为1%和10%的血清诱导分化后，免疫荧光法检测GFAP 、βⅢ-tubulin 和MBP 的表达。 结果与结论：①体外培养得到悬浮生长的神经球，生长曲线和细胞周期表明细胞增殖力强；②透射电镜观察到神经干细胞核浆比高，呈未分化状态；③Nestin 免疫荧光阳性；④不同体积分数的血清诱导后均可分化为星形胶质细胞、神经元和少突胶质细胞，体积分数为1%血清能诱导分化得到更多的神经元细胞；⑤结果表明，采用悬浮神经球培养法成功分离培养得到了神经干细胞，低体积分数血清有利于神经干细胞向神经元分化。 关键词： 干细胞；分化；神经干细胞；培养；鉴定；血清；诱导分化；国家自然科学基金 主题词： 神经干细胞；细胞, 培养的；血清；细胞分化；组织工程 基金资助： Cultivation, identification and differentiation of neural stem cells Zhu Qiong 1, Hao Yue-juan 2, Gao Shun-ji 1, Chen Zhong 1, Liu Zheng 1, Xu Ya-li 1 (1Department of Ultrasound, Second Affiliate Hospital of Third Military Medical University, Chongqing 400037, China; 2Department of Ultrasound, the 302nd Hospital of PLA, Beijing 100039, China) Abstract BACKGROUND: Neural stem cell transplantation is an emerging therapeutic option in the recovery of neural lesions and neurodegenerative diseases. Neural stem cell culture and differentiation lay a foundation for the further study. OBJECTIVE: To improve the techniques for the isolation, cultivation, differentiation and identification of neural stem cells, and to explore the biological characteristics of cells. METHODS: The neural stem cells from C57BL/6 fetal rats were isolated and cultured in vitro using neurophere culture method followed by morphological and ultrastucture examination. The growth curve and cell cycle of passage 3 cells were drawn and analyzed. Nestin expression was tested by immunofluorescence. Neural stem cells induced in 1% and 10% fetal bovine serum were identified using anti-GFAP, anti-βIII -tubulin and anti-MBP by immunofluorescence. RESULTS AND CONCLUSION: The neurospheres exhibited strong cell proliferation ability. Under transmission electron microscope, there was a high nuclear/cytoplasmic ratio in the neural stem cells, indicating a low differentiation degree. Immunofluorescence analysis revealed that neural stem cells were positive for Nestin. The induced cells were positive for GFAP, βIII -tubulin, and MBP, indicating these cells were induced to differentiate into astrocytes, neurons and oligodendrocytes, and there were more neurons in 1% fetal bovine serum than those
项目名称：肿瘤干细胞的动态演进及干预研究首席科学家：刘强中山大学 起止年限：2012.1至2016.8 依托部门：教育部
一、关键科学问题及研究内容 拟解决的关键科学问题： 肿瘤干细胞的动态演进及干预研究。本项目将围绕“肿瘤干细胞的动态演进及干预研究”这一关键科学问题，选择造血和消化系统恶性肿瘤为研究对象，以肿瘤干细胞动态演进过程为切入点，通过体内外功能实验及临床标本验证“干性”及转移潜能调控中的关键基因，明确肿瘤干细胞演进的分子机制、关键调控分子和信号通路，探索靶向肿瘤干细胞演进过程的干预方法和手段，阐明肿瘤干细胞的演进过程及靶向干预肿瘤细胞动态演进过程的干预新模式。本研究将为肿瘤干细胞的动态演进模型及创新性靶标药物的临床应用提供充实的理论和实验依据，为攻克肿瘤开创新的突破口。 围绕拟解决的关键科学问题，本项目的主要研究内容是： 1. 肿瘤干细胞的起始与动态演进机制：本课题组将运用TEL-AML1及PML-RARα白血病相关模型，探索白血病干细胞的动态演进过程（白血病起源细胞→白血病前癌干细胞→白血病干细胞）：（1）TEL-AML1 相关白血病起始和发展过程中起源细胞、Pre-LSC和LSC的鉴定，以及这些干细胞动态演进的遗传和表观遗传调控机制；（2）PML-RARα相关白血病起始和发展过程中不同阶段的干细胞鉴定和动态演进机制。另一方面，本课题组还将探讨肝癌干细胞在肝癌发生发展过程（原发、复发及转移）中的动态演进过程。 2. 肿瘤干细胞“干性”的分子调控及临床意义：（1）应用新一代高通量测序技术，系统分析全基因组、全外显子组、转录组、表观遗传组、代谢组等变化，绘制造血和消化系统肿瘤干细胞异质性相关基因序列谱、表达谱和表观遗传学图谱，分析肿瘤干细胞“干性”相关的调控分子及关键信号通路；（2）运用小鼠模型等体内外功能实验对候选分子在肿瘤干细胞动态演进过程中的功能进行鉴定，并通过临床标本检验肿瘤干细胞动态演进模型的临床意义；（3）结合本课题组已有工作基础，展开肿瘤干细胞细胞周期、非对称分裂等分子调控方面的细致研究。 3. 肿瘤干细胞转移潜能获得的分子机制：肿瘤干细胞的“干性”决定着其转移潜能，EMT作为肿瘤转移的重要机制，与肿瘤干细胞的动态演进过程紧密关联，剖析二者之间的相互作用，将为寻找肿瘤发生及转移的靶点提供有力的理论基础：（1）
脂肪干细胞的提取及鉴定 一、脂肪干细胞(ASCs)的提取及鉴定 1、实验技术及原理: 运用细胞培养技术、流式细胞术(体外扩增后ACSs的表型会发生改变，主要体现在细胞表面蛋白和细胞因子表达的变化)，差异离心术(可将基质血管细胞沉淀与悬浮的成熟脂肪细胞分离，沉淀中除ASCs，还包括血细胞、成纤维细胞和内皮细胞，基质血管细胞沉淀可以接种到孰料培养瓶中，基质细胞可贴壁，造血和其他杂质细胞不贴壁，在随后的传代过程中被出去，最终得到的ASCs可再很长时间内保持摸分化状态)。取C57BL,6 WT小鼠2只，常规麻醉消毒，取腹股沟脂肪组织剪碎至糊状，PBS液冲洗去麻药及血液，0.075%II型胶原酶消化(37?，30分钟)以去除外基质，生理盐水终止胶原酶的消化，离心(1200g,10分钟)，去上清液及未消化的脂肪，10%FBS的DMEM重悬细胞沉淀，0.16mol/L氯化氨溶解剩余红细胞，离心洗涤，过200目铜网，得到单个核细胞。?镜下计数，按10个细胞/ml种植在培养瓶中，37?5%CO2孵箱培养，24小时后第一次换液，以后3天换液一次，80%融合后0.25% Trypsin,0.02%EDTA消化传代。细胞镜下作形态学观察及取第三代细胞用流式细胞仪作细胞周期及细胞免疫表型(CD29/CD44)的鉴定。 2、实验用品: 2.1 材料:C57BL,6 WT小鼠 2.2 试剂:PBS液，0.075%II型胶原酶消化，10%FBS，低糖DME M 2.3 仪器设备:超净工作台、恒温培养箱、普通显微镜、倒置显微镜、离心机、离心管、解剖剪、眼科剪、镊子(尖头、平头和有沟镊)、小烧杯，200目铜网过滤器，低糖DMEM、血球计数板、橡皮瓶塞、酒精灯、换药碗 3、细胞培养的方法与步骤:
神经干细胞体外培养与鉴定 一前言 神经干细胞(Neural stem cells, NSC S)是神经系统内能产生神经元和胶质细胞的未分化原始细胞【1-2】。文献报道，NSC具有无限增殖、自我更新和多向分化能力，在适宜的环境条件下，能分化形成各种靶组织细胞【3-5】。此外，NSC 还可用作为是细胞移植治疗的有效载体，被广泛用于神经疾病细胞或载体治疗。根据目前的研究结果，其主要作用包括下列三方面：①NSC分化成宿主细胞来替代丢失细胞的作用；②分泌多种细胞因子发挥生物学功能；③桥接作用【6-8】。基于NSC的上述特性，从而奠定了NSC在细胞替代治疗中有广泛应用前景，而如何获取NSC则是科学研究和临床实践中首先面临的关键问题。本实验拟建立绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）转基因小鼠NSCs原代和传代培养技术，为后面的实验提供方法支持。 二实验所需仪器、试剂及其配制 （一）实验仪器 光学显微镜（Olympus,Japan） 倒置荧光显微镜（LEICA DMIRB） 冰冻切片机（Leica CM1900，Germany） 光明DZKW型电热恒温水浴锅（北京市光明医疗仪器厂） XK96-A快速混匀器（姜堰市新康医疗器械有限公司）HT-200 电子天平（成都普瑞逊电子有限公司川制）FA1004型精密电子天平(上海良平仪器仪表有限公司) MP 8001单臂脑立体定位仪(深圳市瑞沃德科技有限公司) 10μl微量进样器（Pressure-Lok，PRECISION SAMPLING CORP，BATON ROUGE， LOUISIANA，Made in USA） 0.5ml、1ml Eppendorff管（Ependorff） 手术器械：眼科剪、解剖剪、显微剪、显微有齿镊及无齿镊、蚊式钳、刀柄刀片等。
干细胞在治疗运动神经元病中的应用研究进展 陈 博※(综述),王丹丹(审校) (协和干细胞基因工程有限公司,天津巿脐带血干细胞库,天津300384) 中图分类号:R338 文献标识码:A 文章编号:100622084(2010)0821147202 摘要:运动神经元病病因至今不明,目前尚无有效药物。成体干细胞因为具有自我复制和多项分化潜能等特点,其移植治疗运动神经元病也成为研究热点。成体干细胞包括脐血源性神经干细胞、自体神经干细胞、自体骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞。各种细胞在取材、临床应用、治疗效果方面都有优缺点。国内外对运动神经元病的治疗研究较少,细胞的选择尚需探索。 关键词:运动神经元病;骨髓间充质干细胞;脐带间充质干细胞 A Rev i ew on Research Progress of Appli ca ti on of Ste m Cells to Trea ti n g D isea ses i n M otor Neu2 ron D isea se CHEN B o,WAN G D an2dan.(U nion S te m Cell&Gene Engineering L i m ited Co m pany, Tianjin Cord B lood B ank,Tianjin300384,China) Abstract:The cause ofMot orNeur on D isease(MND,mot or neur on disease)re mains unknown,and s o far,there are not effective drugs.Due t o its capability t o differentiate int o multi p le cell types as well as self2renew continuously,ste m cell,es pecially Somatic ste m cell′s researching on treat m ent of the MND with trans p lanting has als o become int o a hot s pot in medical arena.Somatic ste m cells include neural ste m cells,mesechy mal stem cell and human umbilical cord mesenchy mal ste m cells.Vari ous cells has its res pective advantage in s ource,clinical app licati on and treat m ent.There is less research on MND treat m ent,s o it′s i m portant t o choose the most suitable measure ments. Key words:Mot or neur on disease;Bone mesenchy mal ste m cell;Human umbilical cord mesen2 chy mal ste m cells 运动神经元病(mot or neur on disease,MND)是以 选择性侵犯脊髓前角细胞、脑干运动神经元、大脑皮 质锥体细胞和锥体束为主的一组慢性进行性变性疾 病,病因及发病机制复杂,目前尚无有效药物。临床 表现分为肌萎缩侧索硬化、进行性脊肌萎缩症、进行 性延髓麻痹、原发性侧索硬化。干细胞移植为神经 系统疾病的治疗提供了一种新的手段。干细胞按其 起源分为胚胎干细胞和成体干细胞。由于伦理性、 取材困难及致瘤性等原因,胚胎干细胞的研究与使 用受到了限制[1]。目前多数研究中的干细胞为神经 干细胞(neural ste m cells,NSC)和间充质干细胞 (mesenchy mal ste m cells,MSCs),现就这两种干细胞 在治疗MND的应用予以介绍。 1 脐血源性神经干细胞移植 国内有研究报道,脐带血体外培养分化为神经 干细胞,对33例因创伤性脊髓损伤和硬膜外血肿造 成的急性压迫性损害患者进行神经干细胞移植,植 术后7～10d,33例患者损伤的脊髓功能均有改善, 神经干细胞移植后2周至16个月随访资料显示,33 例患者的脊髓功能呈继续改善的趋势[2]。也有研究 者将脐带血间充质干细胞进行分离、培养以及诱导 其向NSC分化,并应用于MND患者的治疗。通过对 11例MND患者治疗前后场致离子显微镜检查评分 及总T细胞进行流式细胞检测发现:脐带血间充质 干细胞来源的神经干细胞移植治疗短期内通过一定 的免疫调节作用,可以改善MND患者的临床症状和 日常生活能力[3]。2 自体神经干细胞移植 国外有研究者将鼠嗅鞘细胞和鼠间充质干细胞移植入肌萎缩侧索硬化动物模型,进行疗效比较。结果显示,两种细胞移植都具有良好的安全性,其中嗅鞘细胞组与对照组临床差异不明显,而MSCs组(雌性)比对照组存活时间明显延长[4]。多发性硬化症(multi p lescler osis,MS)是一种中枢神经系统多部位脱髓鞘改变的自身免疫性疾病,急性期免疫反应导致的轴突损伤 以及慢性期的脱髓鞘导致患者的神经功能缺失。免疫调节治疗和免疫抑制治疗是目前治疗MS的主要方法,但仅对部分患者有效。因此,NSC移植有可能成为治疗MS的另一种方法。研究显示,将NSC或者少突胶质细胞前体细胞移植到MS模型大鼠脑内后,在脱髓鞘部位可见到髓鞘再生[5,6]。恰当的移植途径以及病变部位的免疫微环境,对髓鞘再生的抑制作用是NSC移植治疗MS的关键。 3 自体骨髓M SC s移植治疗M N D 骨髓间充质干细胞是一类存在于骨髓网状间质内的非造血干细胞,具有分化成各种间叶组织细胞的潜能,在一定条件下可自我复制并能分化成多种细胞,其中包括神经细胞和神经胶质细胞,同时骨髓干细胞还能分泌多种神经营养因子,对神经细胞的修复产生促进作用。神经干细胞在临床上较难获得且在伦理学上存在一定的问题,而骨髓基质干细胞可以作为同种同体来源细胞,较易获得且不存在伦理问题;作为移植供体细胞骨髓基质干细胞和神经干细胞同样具有以下特性:①可以在体外迅速扩增。 ②无或低免疫原性。③能够在宿主脑内长期存活并与宿主神经元整合形成突触联系。④可以稳定的分化并长期表达外生性基因,例如酪氨酸羟化酶。此外,骨髓基质干细胞对神经于细胞还有着明确的促存活和分化的能力[7]。骨髓基质干细胞较神经干细胞更具临床优势,有可能作为自体细胞应用于组织工程和作为良好的移植细胞应用于替代治疗[8]。 在治疗MND的基础研究方面。主要使用人
脐带血间充质干细胞的分离培养和鉴定 【摘要】目的分离培养脐带血间充质干细胞并检测其生物学特性。方法在无菌条件下用密度梯度离心的方法获得脐血单个核细胞，接种含10%胎牛血清的DMEM培养基中。单个核细胞行贴壁培养后，进行细胞形态学观察，绘制细胞生长曲线，分析细胞周期，检测细胞表面抗原。结果采用Percoll(1.073 g/mL)分离的脐血间充质干细胞大小较为均匀，梭形或星形的成纤维细胞样细胞。细胞生长曲线测定表明接后第5天细胞进入指数增生期，至第9天后数量减少;流式细胞检测表明50%～70%细胞为CD29和CD45阳性。结论体外分离培养脐血间充质干细胞生长稳定，可作为组织工程的种子细胞。 【关键词】脐血;间充质干细胞;细胞周期;免疫细胞化学 Abstract: Objective Isolation and cultivation of mesenchymal stem cells (MSCs) in human umbilical cord in vitro, and determine their biological properties. Methods The mononuclear cells were isolated by density gradient centrifugation from human umbilical cord blood in sterile condition, and cultured in DMEM medium containing 10% fetal bovine serum. After the adherent mononuclear cells were obtained, the shape of cells were observed by microscope, then the cell growth curve, the cell cycle and the cell surface antigens were obtained by immunocytochemistry and flow cytometry methods. Results MSCs obtained by Percoll (1.073 g/mL) were similar in size, spindle-shaped or star-shaped fibroblasts-liked cells. Cell growth curve analysis indicated that MSCs were in the exponential stage after 5d and in the stationary stages after 9d. Flow cytometry analysis showed that the CD29 and CD44 positive cells were about 50%～70%. Conclusions The human umbilical cord derived mesenchymal stem cells were grown stably in vitro and can be used as the seed-cells in tissue engineering. Key words:human umbilical cord blood; mesenchymal stem cells; cell cycle; immunocytochemistry 间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)在一定条件下具有多向分化的潜能，是组织工程研究中重要的种子细胞来源。寻找来源丰富并不受伦理学制约的间充质干细胞成为近年来的研究热点[1]。脐血(umbilical cord blood, UCB)在胚胎娩出后，与胎盘一起存在的医疗废物。与骨髓相比，UCB来源更丰富，取材方便，具有肿瘤和微生物污染机会少等优点。有人认为脐血中也存在间充质干细胞(Umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells，UCB-MSCs)。如果从脐血中培养出MSCs，与胚胎干细胞相比，应用和研究则不受伦理的制约，蕴藏着巨大的临床应用价值[2,3]。本研究将探讨人UCB-MSCs体外培养的方法、细胞的生长曲线、增殖周期和细胞表面标志等方面，分析UCB-MSCs 作为间充质干细胞来源的可行性。
神经原代干细胞的取材及培养 长期以来，人们认为中枢神经系统成熟的神经元很难或不能在进行分裂和增殖，属于终末分化细胞。因而中枢神经系统的损伤、变性导致的神经元丢失及缺损难以修复，神经功能的重建被视为几乎不可能。神经干细胞在体外分离培养和增殖的成功，为中枢神经系统再生和功能重建提供了新的可能途径。 一、神经干细胞 神经干细胞是指具有分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的能力，能自我更新并能提供大量脑组织细胞的细胞群，具有自我更新能力和多向分化潜能，对损伤和疾病具有反应能力。原代培养的单细胞在24h内自动聚集成团，这是神经干细胞在体外培养过程中的一个重要特征。 神经干细胞具有的特点有：①有增殖能力。②有自我维持和自我更新能力，对称分裂后形成的两个子细胞为干细胞，不对称分裂后形成的两个子细胞中的一个为干细胞，另一个为祖细胞，祖细胞在特定条件下可分化为多种神经细胞。③具有多向分化潜能，在不同因子下，可以分化成不同类型的神经细胞，损伤或疾病可以刺激神经干细胞分化。总之，自我更新能力和多向分化潜能是神经干细胞的两个基本特征。 二、实验步骤：神经干细胞原代取材及培养 1.原代取材 （1）脱颈处死2周龄孕鼠，孕鼠腹部以75%酒精消毒后，手术剪打开腹腔，取出子宫，剪开子宫，取出胎鼠，置于含冰冷PBS液的10cm培养皿中。 （2）将胎鼠断头，用眼科剪分离颅骨及硬脑膜，取出脑组织，在显微镜下充分取出脑膜和血管组织。 （3）将脑组织用PBS清洗三次，剪成1mm3大小的组织块，至于含DMEM/F12的离心管中，吸管轻吹打10次，静置离心管1~2min，取细胞悬液。重复2-3次。 （4）细胞悬液以700r/min离心6min,吸除上清，获得细胞沉淀。用(DMEM/F12+1%N2+2%B27+bFGF20mg/ml+EFG20mg/ml)重悬后，过200目筛网，并计数。（5）按5×105/ml密度接种，置于37℃，5%CO2培养。2天后隔天换液。通常一周左右，神经球长出。 2.传代培养 （1）在光镜下观察细胞球中心已出现灰黑色区域时进行传代，将培养基转移至15ml离心中，800r/min离心5min，弃上清。 （2）加入0.125%胰酶+0.02%EDTA消化2-3min，加入胰酶抑制剂终止消化，轻轻吹打神经球至至细胞悬液，800r/min离心5min，弃上清。 （3）加入适量干细胞培养液Neurobasal +1%N2+2%B27+20ng/ml bFGF，20ng/ml EGF（添加谷氨酰胺），调整细胞浓度为5×105/ml，置于37℃，5%CO2继续传代培养。
运动神经元病吃什么药 文章目录*一、运动神经元病吃什么药*二、运动神经元病的典籍偏方*三、运动神经元病的护理知识 运动神经元病吃什么药1、维生素E和维生素B族口服。 2、辅酶肌注,胞二磷胆碱肌注等治疗,可间歇应用。 3、针对肌肉痉挛可用地西泮,口服,氯苯氨丁酸,分次服。 4、可试用于治疗本病的一些药物,如促甲状腺激素释放激素,干扰素,卵磷脂,睾酮,半胱氨酸,免疫抑制剂以及血浆交换疗法等,但它们的疗效是否确实,尚难评估。 运动神经元病的典籍偏方飞步汤(《千家妙方》) 组成:龟板,熟地黄,知母,黄柏,陈皮,白芍,牛膝,狗骨,杜仲,续断,菟丝子,当归,茯苓,白术,炙甘草。 功效:滋阴降火,强筋健骨,健脾益气。 适应证:肝肾不足,阴虚火旺兼见脾虚肉痿之运动神经元病 患者。 用法:每日剂,每日2次,水煎温服。 运动神经元病的护理知识1、保持乐观愉快的情绪。长期出现精神紧张、焦虑、烦燥、悲观等情绪,会使大脑皮质兴奋和抑制过程的平衡失调,所以需要保持愉快的心情。
2、生活节制注意休息、劳逸结合,生活有序,保持乐观、积极、向上的生活态度。做到茶饭有规律,生存起居有常、不过度劳累、心境开朗,养成良好的生活习惯。忌烟酒。 3、饮食应以清淡而富有营养为主。多吃蔬菜、水果、牛奶、甲鱼等富含多种氨基酸、维生素、蛋白质和易消化的滋补食品。少吃油腻过重的食物;少吃狗肉、羊肉等温补食物;少吃不带壳的海鲜、笋、芋等容易过敏的“发物”;少吃含化学物质、防腐剂、添加剂的饮料和零食。忌食过酸、过辣、过咸等刺激物。 饮食: 治疗运动神经元损害和肌源损害以及等症的同时,无论病人的病情是脾虚所弱型、脾肾阴虚型、脾肾阳虚型、肝血不足型、气血两亏型、心血不足型、肺虚痰湿型等哪种类型,都是少食寒凉,多食温补。 例如:芥菜、绿豆、海带、紫菜、西泮菜、白菜、黄花菜、西瓜、苦瓜、冬瓜等都属寒凉食品,病人尽量避免服食。 一般患者宜多食甘温补益食品,如:小米、大枣、山楂、山药、当归、赤小豆、莲子、葡萄干、核桃仁、生姜、牛肉、羊肉、乌鸡等,还可以买瓶纯天然蜂王浆,最有利于增强自身免疫力。
人表皮干细胞的体外分离、培养及鉴定 何黎顾华 昆明医学院第一附属医院皮肤性病科云南 [摘要] 目的：探索实验条件下人表皮干细胞的体外分离、培养及鉴定。 方法：利用细胞工程方法进行组织分离及细胞培养：通过免疫组化方法，利用角蛋白单克隆抗体对培养的角质形成细胞进行鉴定，并利用表皮干细胞的相对特异标识分子——CK19对其进行检测分析。 结果：表皮自真皮较完整分离，电镜及免疫组化证实培养细胞为角质形成细胞，免疫组化结果显示：CK反应阳性，部分细胞CK19阳性，表明有表皮干细胞存在。 结论：体外分离、培养角质形成细胞成功，且分离得到的角质形成细胞中有表皮干细胞存在。 [关键词]：角质形成细胞表皮干细胞细胞培养角蛋白——19 对于烧伤、急性创伤、某些疾病导致的皮肤缺损，尤其是大面积烧伤一直以自体皮移植作为首选方案，而自体皮肤不足是临床遇到的主要问题。随着细胞培养技术和组织工程的出现，使许多脏器或组织体外重建成为可能。人工皮肤的研制就是一个典型例子。在这一技术中，种子细胞——角质形成细胞的体外培养，以及体外分离到的角质形成细胞中是否有在体外能大量增殖的表皮干细胞决定了能否成功构建人工皮肤。为此本课题采用组织分离方法及细胞培养方法进行角质形成细胞体外分离及培养；通过免疫组化方法，利用人广谱单克隆抗体对培养细胞进行鉴定；并利用CK19对体外培养细胞中是否有表皮干细胞进行检测。 材料和方法 一、材料 1、取材 选择6-26岁健康男性，行包皮环切术切除的包皮。 2、主要培养基及试剂 (1)磷酸盐缓冲溶液（PBS和D-Hank’s液）：（2）培养基：K-SFM（Gibco公司），编号：37010，内含2.5ug表皮细胞生长因子（EGF）和25mg小牛垂体(BPE)：（3）分离酶：dispase（4）胰蛋白酶；（5）抗人广谱角蛋白单克隆抗体；（6）CK19单克隆抗体；（7）SP 超敏免疫组化试剂盒。 二、方法 1、取材
小鼠骨髓间充质干细胞的分离培养与鉴定 发表时间：2012-05-24T09:50:06.677Z 来源：《医药前沿》2012年第1期供稿作者：林芸1 蔡鹏威2 陈为民1 孟春3 [导读] 分离、培养符合实验要求的小鼠骨髓间充质干细胞并进行鉴定，为进一步的研究打基础。 林芸1 蔡鹏威2 陈为民1 孟春3 ( 1 福建医科大学省立医院临床学院血液科福建福州 3 5 0 0 0 1 ) ( 2 福建省立医院检验科福建福州 3 5 0 0 0 1 ) ( 3 福州大学生物工程学院福建福州 3 5 0 0 0 1 ) 【摘要】目的分离、培养符合实验要求的小鼠骨髓间充质干细胞并进行鉴定，为进一步的研究打基础。方法采用贴壁培养法培养小鼠骨髓间充质干细胞，观察细胞的形态及生长特性，并应用流式细胞仪对细胞表面抗原CD34、CD45、CD29、CD44进行表型鉴定。结果原代分离的间充质干细胞在接种后培养24小时，细胞开始贴壁，胞体呈圆形或多边形，培养第3-5天，细胞开始较紧密贴附壁上并开始有细胞呈梭形，培养第7天开始观察到细胞分裂，随着细胞数的增加，细胞的生长速度变快，逐渐成漩涡状排列，培养第12天贴壁细胞长满瓶底的80%，并融合成片。传代后细胞生长迅速，培养7天左右即可长满瓶底的80%。传至10代仍具有良好的增殖活性。流式细胞仪检测第4代及第8代MSCs细胞均不表达CD34、CD45，但表达CD29、CD44，纯度分别为73.8% 、91.65%。结论采用贴壁培养法可获得生长状态良好、增殖能力强的间充质干细胞，随传代数增加，其纯度增加，且该方法简单、实用。 【关键词】骨髓间充质干细胞细胞培养流式细胞术表型鉴定 【中图分类号】R392.2 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2012）01-0082-02 间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）起源于中胚层，具有高度增殖和自我更新的能力，有向骨、软骨、脂肪、血管内皮细胞、神经星型胶质细胞等分化的潜能[1]，可分化成骨髓基质支持造血，并可分泌多种细胞因子促进造血干细胞增殖分化，同时它能抑制同种异体反应性T淋巴细胞，在同种异基因造血干细胞移植后的造血重建及免疫调节，预防移植物抗宿主病等方面有广阔的应用前景[2]，但骨髓间充质干细胞含量极低，仅占骨髓单个核细胞的0.001%-0.010%[3]，因此，培养出生长状态良好，足够数量的骨髓间充质干细胞是应用的前提。 1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物雄性，C57B L/6小鼠，清洁级，8周龄，体重18-20g，购于吴氏动物实验中心。 1.1.2 实验仪器与试剂低糖DMEM培养基（Gibco公司），特级胎牛血清（Hy c l o ne公司），胰蛋白酶（Si gma公司），青霉素钠（Si gma公司），链霉素（Si g m a公司），5%C O2培养箱（日本三洋公司），流式细胞仪(BD FA CSCalibur)，倒置显微镜（OLYMPUS），大鼠抗小鼠单克隆抗体：CD29-PE、CD44-FITC、CD34-PE、CD45-FITC（BD公司）。 1.2 方法 1.2.1 小鼠骨髓间充质干细胞的分离及原代培养取8周龄雄性C57BL/6小鼠，颈椎脱臼法处死，75%酒精浸泡5分钟，取出双侧腿骨，置于装有P BS溶液的培养皿中小心剔除粘连于骨上的肌肉组织，移入装有预冷的含10%特级胎牛血清、青霉素钠100U/ml、链霉素0.1g/L 的低糖DMEM培养液的培养皿中，剪去腿骨两端，用1m l注射器抽取培养液反复冲洗骨髓腔，直至骨发白，收集冲洗液，反复吹打使细胞打散，静置10分钟，小心将上清移至灭菌的10m l离心管中，4℃3000r p m离心3分钟，弃上清，用含10%特级胎牛血清的L-DMEM培养液重悬细胞，反复吹打混匀，4℃3000r p m离心3分钟，弃上清，再用含10%特级胎牛血清的L-D M EM培养液重悬细胞，反复吹打混匀，4℃3000r p m离心3分钟，弃上清，再用含10%特级胎牛血清的L-DMEM培养液重悬细胞，反复吹打混匀，调整细胞密度为5×105个/ml接种于25cm2培养瓶中，置于5%C02，37℃，饱和湿度95%的培养箱中培养4小时后，轻轻吸出上清，并加入新鲜培养液。培养24小时后轻轻吹打，使未贴壁的细胞悬浮，吸出上清，加入新鲜的培养液，继续培养。以后每天换液1次，并观察细胞形态。 1.2.2 小鼠骨髓间充质干细胞的传代培养原代细胞生长接近瓶底的80%时，吸去上清，加入0.125%胰蛋白酶，37℃条件下消化并观察细胞形态，待细胞呈球形、不在粘连时吸弃胰酶，加入新鲜培养液重悬细胞，4℃3000r pm离心3分钟，弃上清，再加入培养液重悬细胞，反复吹打混匀，按1:2比例接种到新的培养瓶，置于5%C02，37℃，饱和湿度95%的培养箱中继续培养，仍然每天换液，直至细胞贴壁融合成片，接近瓶底80%时，重复以上操作，再次传代。 1.2.3 小鼠骨髓间充质干细胞的表型鉴定收获第4代及第8代生长良好的细胞，胰酶消化后，4℃1000r p m离心5分钟，弃上清，PBS洗涤细胞2次，每代细胞分别设2管，调节每管细胞数为5×105,分别加入C D29和C D44、CD34和CD45单抗，室温孵育30分钟，PBS洗涤细胞3次，流式细胞仪检测分析，同时用PBS作为一抗设置阴性对照。 2 结果 2.1 小鼠骨髓间充质干细胞的原代培养及扩增培养4小时后吸出上清，加入新鲜培养液后，大多数悬浮细胞被吸出，瓶中细胞数目明显减少，并且都呈现球转，折光率较强，原代分离的间充质干细胞在接种后培养24小时，细胞开始贴壁，胞体呈圆形或多边形，培养第3-5天，细胞开始较紧密贴附壁上并开始有细胞呈梭形，并不断长大、变长，但未观察到细胞分裂，培养第7天开始观察到细胞分裂（图1），随着细胞数的增加，细胞的生长速度变快，逐渐成漩涡状排列，培养第12天贴壁细胞长满瓶底的80%，并融合成片（图2）。传代后细胞生长迅速，培养7天左右即可长满瓶底的80%。传至10代仍具有良好的增殖活性。
运动神经元病临床诊断治疗指南 【概述】 运动神经元病(motor netlron disease，MND)为一组病因不清的系统性疾病。主要累及上、下运动神经元的慢性进行性变性疾病。根据受损的病变部位不同而分为进行性脊肌萎缩症、进行性延髓麻痹、原发性侧索硬化和肌萎缩侧索硬化数种类型。 一、肌萎缩侧索硬化 【临床表现】 肌萎缩侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)可分为三型，即散发型(或称经典型)、家族型(5％～10％)和关岛型。 散发型表现为中年或中年以后起病，40岁以下起病者亦不少见。国内报告最早发病为18岁。男性多于女性。起病隐袭，呈慢性进展病程，部分患者为亚急性病程，少数起病后呈急剧进展，可于病后半年左右死亡。早期出现肌肉无力、肌肉萎缩及肌纤颤。常自上肢远端手部肌肉开始，可自一侧手肌
开始，数月后可波及对侧；也可双侧手肌同时受累，随后波及前臂肌肉及上臂和肩胛部肌肉。部分患者可以三角肌或冈上、下肌无力开始，造成肩胛下垂，抬肩或臂上举无力。少数患者可以下肢起病，表现为下肢无力、沉重、走路无力，骨盆带肌肉受累后可有上台阶、楼梯、蹲下起立困难，下肢肌肉萎缩。随着病情的发展，肌无力和萎缩可延至颈部、躯干、面肌及延髓支配的肌肉，表现为抬头困难、转颈障碍，呼吸肌受累出现呼吸困难，延髓支配肌肉受累则有吞咽困难、咀嚼费力、舌肌萎缩、发音障碍等。延髓麻痹通常出现于疾病晚期，但也可于手肌萎缩不久后出现，少数情况下为首发症状。肌纤颤为常见的症状，可在多个肢体中发生。在舌体由于肌膜薄而可看到肌纤维颤动。本病很少有感觉障碍，客观感觉异常少见，有少数患者可有痛性痉挛。绝大多数患者无括约肌障碍。本病的生存期随临床类型而有不同，短者数月，长者可十余年，最长可至35年，平均生存3年左右。严重者多因延髓麻痹或呼吸麻痹而死亡。
．1神经干细胞的原代培养 1)在无菌工作台上取24小时新生SD大鼠4只，乙醚气体麻醉后(也 可无需麻醉)，用酒精消毒皮肤。 2)无菌工作台中，用带有无菌手套的左手拿握住消毒后的新生大鼠， 充分暴露头部，右手使用已灭菌后的眼科剪打开新生大鼠脑部，按无菌操 作规则断头取脑，PBS漂洗3次后，用D．Hanks液漂洗1次，在解剖显 微镜下切取前脑侧脑室周围脑组织(含海马)，仔细剔除脑膜和血管等结缔 组织后，放入D．Hanks液中冲洗。 ．3)在无菌工作台上，用眼科剪将脑组织剪碎至大约0．5mm2的小块， 用吸管反复轻柔吹打成细胞悬液。收集细胞悬液后先后在100目和200 目铜网上过滤，从而获得单细胞悬液。 4)细胞计数：用O．4％台盼蓝与细胞悬液按比例均匀混合，血球计数 板在显微镜下计数台盼蓝呈阴性的活细胞，小细胞团按单个细胞计数。 5)细胞计数后，放入50ml一次性培养瓶中培养(4～5)x105个活离的细胞(已经凋亡或者其它细胞)无需胰蛋白酶消化液消化剥离，培养期间密切观察细胞生长情况。(无血清条件培养液有能刺激NSC分裂增殖的细胞因子，所以只有NSC能存活) ．2神经干细胞的传代 大鼠脑NSC在培养2．-一3d成云雾状，不规则的球形细胞团，4---，6d 后成为悬浮生长的神经球。将悬浮细胞液吸出，采用1000r／min离心 5min，弃上清，加入无血清条件培养基，仍用细口径直吸管吹打为单细胞 悬液，将细胞重悬，调整细胞浓度为(4～5)×105／ml，依照原条件继续培养。 同时取出部分细胞用于NSC的鉴定。 Nestin免疫组化检测步骤： 1)将分离出的部分NSC浓悬液，1000 r／min离心5 min，弃上清； 2)加入2ml配制好的4％多聚甲醛，室温固定15---，20分钟； 3)PBS浸洗3min 2次，去上清； 4)Triton液破膜10 min； 5)PBS浸洗3min洗3次，离心去上清，用残留的一滴PBS重悬细 胞，将细胞滴在涂有O．1％多聚赖氨酸处理过载玻片上。自然干燥，让细 胞贴在载玻片上； 6)3％I-1202浸润细胞10 min灭活内源性过氧化物酶； 7)滴入正常5％胎牛血清室温封闭20min。甩去多余液体，不洗； 8)滴加1：300稀释后的兔抗鼠单克隆nestin抗体4。C过夜。PBS 洗2 min 3次； 9)将抗体轻轻甩去，用PBS缓冲液加满洗涤3次，每次5min； 10)滴加第二抗体，37℃孵育40min后轻轻甩去二抗后用PBS洗涤3 次，每次5min； 11)滴加DAB显色剂后镜下控制显色1 5min，用清水终止显色； 研究论文 12)滴加苏木素复染2min后用自来水终止DAB显色，用O．5％盐酸 酒精分化5s后立刻用自来水轻柔冲洗至玻片变蓝。13、)分别在80％、90％、无水乙醇染色缸中各蘸一下，滴加少量二甲
一、脂肪干细胞（ASCs）的提取及鉴定 1、实验技术及原理： 运用细胞培养技术、流式细胞术（体外扩增后ACSs的表型会发生改变，主要体现在细胞表面蛋白和细胞因子表达的变化），差异离心术（可将基质血管细胞沉淀与悬浮的成熟脂肪细胞分离，沉淀中除ASCs，还包括血细胞、成纤维细胞和内皮细胞，基质血管细胞沉淀可以接种到孰料培养瓶中，基质细胞可贴壁，造血和其他杂质细胞不贴壁，在随后的传代过程中被出去，最终得到的ASCs可再很长时间内保持摸分化状态）。取C57BL／6 WT小鼠2只，常规麻醉消毒，取腹股沟脂肪组织剪碎至糊状，PBS液冲洗去麻药及血液，0.075%II型胶原酶消化（37℃，30分钟）以去除外基质，生理盐水终止胶原酶的消化，离心（1200g,10分钟），去上清液及未消化的脂肪，10%FBS的DMEM重悬细胞沉淀，0.16mol/L 氯化氨溶解剩余红细胞，离心洗涤，过200目铜网，得到单个核细胞。镜下计数，按10⒋个细胞/ml种植在培养瓶中，37℃5%CO2孵箱培养，24小时后第一次换液，以后3天换液一次，80%融合后0.25% Trypsin,0.02%EDTA消化传代。细胞镜下作形态学观察及取第三代细胞用流式细胞仪作细胞周期及细胞免疫表型 （CD29/CD44）的鉴定。 2、实验用品： 2.1 材料：C57BL／6 WT小鼠 2.2 试剂：PBS液，0.075%II型胶原酶消化，10%FBS，低糖DMEM 2.3 仪器设备：超净工作台、恒温培养箱、普通显微镜、倒置显微镜、离心机、离心管、解剖剪、眼科剪、镊子（尖头、平头和有沟镊）、小烧杯，200目铜网过滤器，低糖DMEM、血球计数板、橡皮瓶塞、酒精灯、换药碗 3、细胞培养的方法与步骤： 3.1无菌操作的要领和要求。 3.2细胞原代培养： 3.2.1操作步骤 a．培养用品消毒后，安放在超净工作台内，紫外线消毒，做好洗手等准备工作。 b. 取材：取C57BL／6 WT小鼠2只，常规麻醉消毒，取腹股沟脂肪组织剪碎至糊状，PBS液冲洗去麻药及血液。 c. 消化：将漂洗后的组织至于平皿中,加入胶原酶（0.075%II型胶原酶, PH），用量（0.1-0.3ug/ml或200U/ml），再用移液管移至烧瓶中，置于37℃水浴或恒温箱中30分钟），每隔5-10min振荡一次。30min后，生理盐水终止胶原酶的消化。 d. 离心和计数：将离心管做好标记，平衡后以（1200g,1200r/min 10分钟），去上清液及未消化的脂肪，10%FBS的DMEM重悬细胞沉淀，0.16mol/L氯化氨溶解剩余红细胞，将收集的细胞悬液经200目铜网过滤，1200r/min 离心10分钟（先后顺序），得到单个核细胞。加入培养液吹打混匀后取样计数。根据计数结果调整细胞浓度为10⒋个细胞/ml。