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人胎脑神经干细胞的体外分离、培养与鉴定方庆;朱庆丰;尹国才;陈新生【期刊名称】《中国医药导报》【年(卷),期】2012(9)27【摘要】Objective To explore the methods of isolation, cultivation and differentiation of human fetal neural stem cells, and to observe the characteristics of proliferation and differentiation of neural stem cells in vitro. Methods The neural stem cells were isolated from human fetal hippocampus at embryonic age 14 weeks by induction of labor with water bag. A serum free medium containing basic fibroblast growth factor (bFGF) and epidermal growth factor (EGF) was used to cultured and expanded neural stem cells. The cells were cultured, passed and differentiated. Cultured and differentiated cells were identified with immunofluorescence test. Results The human neural stem cells having the abilities of self-renew and multipotency were successfully isolated and cultured from human fetal brain with serum free medium. They were found to form typical neurospheres in suspension and express Nestin antigen. The cells could be amplified and passed continuously. Neural stem cells were induced to differentiate and express specific antigens of neuron and astrocyte in serum medium. Conclusion The neural stem cells isolated from human fetal brain have the abilities of self-replication, multipotency and amplification in vitro. It has useful appliacation in further basic and clinicalresearch.%目的探索人胎脑神经干细胞的体外分离培养条件,从而在体外大量增殖神经干细胞,并观察神经干细胞增殖和分化的特点.方法采用含碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和表皮细胞生长因子(EGF)的无血清培养技术,从14周自愿水囊引产人胎脑海马皮质中分离出神经干细胞,并进行培养、传代、分化观察,应用免疫荧光细胞化学技术对培养的细胞及其分化的细胞进行鉴定.结果从14周人胎脑皮质中成功分离出具有自我更新和多分化潜能的神经干细胞,在无血清培养时细胞呈悬浮状态生长,形成神经球,该细胞具有连续增殖能力,可传代培养,表达神经巢蛋白抗原(Nestin);在含血清培养时诱导神经干细胞分化,分化后的细胞表达神经元细胞和胶质细胞的特异性抗原.结论在含有EGF和bFGF的无血清培养液中,从人胎脑能分离培养出具有自我复制和分化潜能的神经干细胞,并能在体外扩增,可进一步用于基础及临床研究.【总页数】3页(P19-20,24)【作者】方庆;朱庆丰;尹国才;陈新生【作者单位】安徽医科大学附属安庆医院神经外科,安徽安庆,246003;安庆师范学院生命科学系,安徽安庆,246003;安庆师范学院生命科学系,安徽安庆,246003;安徽医科大学附属安庆医院神经外科,安徽安庆,246003【正文语种】中文【中图分类】R421【相关文献】1.人胎肝间充质干细胞体外分离培养和生物学鉴定 [J], 何念海;赵文利;王宇明2.人胎肝干细胞体外分离、培养及鉴定 [J], 高沿航;李玉林;李艳茹;吴珊;全成实;王芯蕊;张丽红3.人胎脑神经干细胞体外培养及分化研究 [J], 巨容;杜江;兰和魁;王斌;封志纯4.人胎儿骨髓基质干细胞的分离、体外培养和鉴定 [J], 陈金武;吴军正;张军;李焰;刘斌5.人胎肝干细胞的体外分离培养与鉴定 [J], 毛海洲;陈耀凯;王宇明;张磊;刘国栋因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
神经干细胞体外培养与鉴定一前言神经干细胞(Neural stem cells, NSC S)是神经系统内能产生神经元和胶质细胞的未分化原始细胞【1-2】。
文献报道，NSC具有无限增殖、自我更新和多向分化能力，在适宜的环境条件下，能分化形成各种靶组织细胞【3-5】。
此外，NSC 还可用作为是细胞移植治疗的有效载体，被广泛用于神经疾病细胞或载体治疗。
根据目前的研究结果，其主要作用包括下列三方面：①NSC分化成宿主细胞来替代丢失细胞的作用；②分泌多种细胞因子发挥生物学功能；③桥接作用【6-8】。
基于NSC的上述特性，从而奠定了NSC在细胞替代治疗中有广泛应用前景，而如何获取NSC则是科学研究和临床实践中首先面临的关键问题。
本实验拟建立绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）转基因小鼠NSCs原代和传代培养技术，为后面的实验提供方法支持。
二实验所需仪器、试剂及其配制（一）实验仪器光学显微镜（Olympus,Japan）倒置荧光显微镜（LEICA DMIRB）冰冻切片机（Leica CM1900，Germany）光明DZKW型电热恒温水浴锅（北京市光明医疗仪器厂）XK96-A快速混匀器（姜堰市新康医疗器械有限公司）HT-200 电子天平（成都普瑞逊电子有限公司川制）FA1004型精密电子天平(上海良平仪器仪表有限公司)MP 8001单臂脑立体定位仪(深圳市瑞沃德科技有限公司)10μl微量进样器（Pressure-Lok，PRECISION SAMPLINGCORP，BATON ROUGE，LOUISIANA，Made in USA）0.5ml、1ml Eppendorff管（Ependorff）手术器械：眼科剪、解剖剪、显微剪、显微有齿镊及无齿镊、蚊式钳、刀柄刀片等。
（二）试剂1. DMEM/F12，Hank's液（Hyclone），N2（Gibico），bFGF（Invitrogen）。
人胚脑组织干细胞的分离、培养与鉴定神经干细胞（neural stem cells, NSCs）是一种具有自我更新及广泛分化潜能的细胞，它处于分化的非终末状态，可通过对称或不对称分裂出新的干细胞或分化潜能逐渐变小的子细胞，终于产生中枢神经系统的三种主要细胞，即神经元细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞。
采纳无血清培养和单细胞克隆法可从人胚脑皮层中分别得到具有自我更新和多分化潜能的神经干细胞，并采纳免疫荧光染色对其举行鉴定。
【材料】 1．组织来源胚龄10周自然流产的人胚胎。
2．培养用试剂（1）无钙镁PBS (CMF-PBS )。
(2）消化液：0.25%和0.02% EDTA混合消化液。
3．培养基配方和制备（1)人胚脑组织干细胞培养液：DMEM/F12 (1：1)无血清培养基，含有2% B27,20ng/ml表皮细胞生长因子（epidermalgrowth factor, EGF) ,20ng/ml bFGF。
(2）人胚脑组织干细胞诱导培养液：添加20％的DMEM/Fl2 (1：1)。
4．试验器材眼科直剪、眼科直镊、眼科弯镊、玻璃平皿、200目尼龙滤网、50ml和15ml离心管、手术刀片。
【办法】 1．取材无菌条件下分别出胚胎大脑皮质组织，剥除脑膜及表面血管，在PBS液中漂洗3次。
在含有DMEM/F12的培养液中，用眼科剪将其充分剪碎。
2．消化用0.25%和0.02% EDTA混合消化液消化细胞团5分钟，吸管将细胞团打散，加入含10% FBS的培养液终止反应。
3．分别细胞将细胞悬液移入离心管中，1000r/min离心5分钟，弃上清液。
用巴斯德吸管反复吹打组织碎块至彻低散开，离心洗涤后吹打制成细胞悬液，经100目不锈钢滤网过滤，制成单细胞悬液。
4．接种与培养细胞计数，将细胞以2x106/ml密度接种至培养板上。
置37℃,5% C02饱和湿度的孵箱中培养。
直至NSCs增殖形成神经球后再换液。
首次传代后每3天半量换液。
神经干细胞的鉴定
咱们先得知道神经干细胞长啥样呀。
它就像个神秘的小不点，隐藏在我们的神经系统里。
你想啊，要在那么复杂的神经系统里把它找出来，就像在大海里捞针一样。
不过呢，科学家们可有办法啦。
有一种鉴定方法是看它的形态。
神经干细胞呀，长得有点像那种圆圆的小豆子，但是又有点不规则，就好像是小朋友捏出来的不太规则的泥球。
它的大小也很特别，不大不小，刚刚好就在那个范围里，就像为了让我们能找到它而特意设计的大小似的。
还有就是看它的功能啦。
神经干细胞就像是一个小小的魔法工厂。
它能分化呢，就像孙悟空的七十二变一样。
可以变成各种各样的神经细胞，像神经元啦，神经胶质细胞之类的。
这可不得了，就好比一颗种子能长出各种各样的花朵一样神奇。
从它的表面标志物来看，这就像是它的身份证一样。
每个神经干细胞都有自己独特的表面标志物。
这就方便我们把它从一堆细胞里挑出来啦。
就像在一群小动物里，根据它们独特的花纹或者颜色就能认出谁是谁一样。
再说说它的增殖能力吧。
神经干细胞增殖起来可积极了，就像勤劳的小蜜蜂一样。
它不断地分裂，产生更多的自己，这样才能保证我们的神经系统有足够的细胞可以用呀。
虽然神经干细胞的鉴定听起来很复杂，但科学家们怀着对未知的好奇和探索的热情，一点点揭开它神秘的面纱。
每一次新的发现都像是打开了一扇通往新世界的小窗户，让我们能更好地了解自己身体里这个奇妙的小世界。
这就是神经干细胞鉴定的那些事儿啦，是不是很有意思呢？。
．1神经干细胞的原代培养
1)在无菌工作台上取24小时新生SD大鼠4只，乙醚气体麻醉后(也
可无需麻醉)，用酒精消毒皮肤。
2)无菌工作台中，用带有无菌手套的左手拿握住消毒后的新生大鼠，
充分暴露头部，右手使用已灭菌后的眼科剪打开新生大鼠脑部，按无菌操
作规则断头取脑，PBS漂洗3次后，用D．Hanks液漂洗1次，在解剖显
微镜下切取前脑侧脑室周围脑组织(含海马)，仔细剔除脑膜和血管等结缔
组织后，放入D．Hanks液中冲洗。
．3)在无菌工作台上，用眼科剪将脑组织剪碎至大约0．5mm2的小块，
用吸管反复轻柔吹打成细胞悬液。
收集细胞悬液后先后在100目和200
目铜网上过滤，从而获得单细胞悬液。
4)细胞计数：用O．4％台盼蓝与细胞悬液按比例均匀混合，血球计数
板在显微镜下计数台盼蓝呈阴性的活细胞，小细胞团按单个细胞计数。
5)细胞计数后，放入50ml一次性培养瓶中培养(4～5)x105个活离的细胞(已经凋亡或者其它细胞)无需胰蛋白酶消化液消化剥离，培养期间密切观察细胞生长情况。
(无血清条件培养液有能刺激NSC分裂增殖的细胞因子，所以只有NSC能存活)
．2神经干细胞的传代
大鼠脑NSC在培养2．-一3d成云雾状，不规则的球形细胞团，4---，6d
后成为悬浮生长的神经球。
将悬浮细胞液吸出，采用1000r／min离心
5min，弃上清，加入无血清条件培养基，仍用细口径直吸管吹打为单细胞
悬液，将细胞重悬，调整细胞浓度为(4～5)×105／ml，依照原条件继续培养。
同时取出部分细胞用于NSC的鉴定。
Nestin免疫组化检测步骤：
1)将分离出的部分NSC浓悬液，1000 r／min离心5 min，弃上清；
2)加入2ml配制好的4％多聚甲醛，室温固定15---，20分钟；
3)PBS浸洗3min 2次，去上清；
4)Triton液破膜10 min；
5)PBS浸洗3min洗3次，离心去上清，用残留的一滴PBS重悬细
胞，将细胞滴在涂有O．1％多聚赖氨酸处理过载玻片上。
自然干燥，让细
胞贴在载玻片上；
6)3％I-1202浸润细胞10 min灭活内源性过氧化物酶；
7)滴入正常5％胎牛血清室温封闭20min。
甩去多余液体，不洗；
8)滴加1：300稀释后的兔抗鼠单克隆nestin抗体4。
C过夜。
PBS
洗2 min 3次；
9)将抗体轻轻甩去，用PBS缓冲液加满洗涤3次，每次5min；
10)滴加第二抗体，37℃孵育40min后轻轻甩去二抗后用PBS洗涤3
次，每次5min；
11)滴加DAB显色剂后镜下控制显色1 5min，用清水终止显色；
研究论文
12)滴加苏木素复染2min后用自来水终止DAB显色，用O．5％盐酸
酒精分化5s后立刻用自来水轻柔冲洗至玻片变蓝。
13、)分别在80％、90％、无水乙醇染色缸中各蘸一下，滴加少量二甲。
