超氧阴离子清除能力试剂盒说明书

·O2ˉ自由基清除实验(1) 实验原理黄嘌呤氧化酶黄嘌呤＋H2O+O2尿酸＋H2O2+·O2¯即黄嘌呤氧化酶在有氧条件下催化黄嘌呤转化为尿酸，同时产生超氧阴离子自由基(·O2¯)。

·O2¯与NBT结合后呈蓝色，样品清除能力越大，与NBT结合的·O2¯越少，溶液的颜色越浅。

(2)试剂Xanthine(黄嘌呤): (C5H4N4O2 ), MW=152.1, 6.084mg/100mL(0.4mmol/l)实际配制：1.216mg/10mL，与NBT等体积混合使用Xanthine oxidase(黄嘌呤氧化酶)贮液: 1 unit/mL , (溶解酶的溶液要高压灭菌！防止蛋白酶对酶的降解！)0.05 unit/mL，每次取200uL稀释到4mL(PBS溶解)NBT: (Nitro blue tetrazolium chloride氯化硝基四氮唑蓝), MW=817.65,黄色19.6236mg/100mL(0.24mmol/l)实际配制3.925mg/10mL，与Xanthine等体积混合使用PBS(0.01mol/L,pH=8.0): NaCl 8g, KCl 0.2g, Na2HPO4(无水) 1.44g, KH2PO4 0.24g,800mL水，用NaOH(1M)调pH到8.0，定容到1000mL。

实际配制500mL。

高压灭菌，室温保存。

PBS(0.01mol/L,pH=7.4): 配制同上Ascorbic acid: MW=176.12 母液为1mg/mL 先两倍逐级稀释5个浓度实际配制见记录本！HCl(1M): MW=36.5 310ul/10ml.(36% HCl密度1.18g/ml)实际配制：800uL浓盐酸+9mL水，于塑料管中4℃保存。

NaOH(1M): MW=40 0.4g/10mL, 存于冰箱(3) 测定方法超氧阴离子自由基清除能力的测定参照Bae等人的方法略加改进。

清除超氧阴离子自由基
取0.05mol/L Tris-HCl 缓冲液（PH8.2）5ml ，置于25℃水浴中预热20min ，分别加入4ml 不同浓度的提取液，25℃水浴中预热20min ，再加入3mmol/L25℃水浴中预热20min 的邻苯三酚溶液1ml ，混匀后于25℃水浴中准确反应5min ，加入10mol/LHCl 1ml 终止反应，于320nm 处测定吸光度，空白对照组以相同体积的蒸馏水代替样品。

每个试样作三个平行样，取其平均值。

实验结果以清除率E 表示： E=空白
样品空白A A A -×100% A 样品用相同样品浓度的空白调零，消除样品颜色的影响。

注：A 空白是不加样液测一值（A 0），A 样品空白(A x0)是只加样液，其他用水代替。

2.5.2.3清除羟自由基
于试管中分别加入不同浓度的提取液2ml ，9mmol/L 水杨酸-乙醇2ml ，9mmol/L FeSO 4 2ml ，最后加入2ml 8.8mmol/L H 2O 2 启动反应，37℃反应15min ，以蒸馏水为空白对照，在510nm 下测量各待测液的吸光度。

考虑到本身的吸光值，以9mmol/L 水杨酸-乙醇2ml ，9mmol/L FeSO 4 2ml ，蒸馏水2ml ，不同浓度的样品溶液2ml 为提取液的本底吸收。

清除率的计算公式为：
·OH 清除率=0
)0x x (0A A A A --×100% 式中：A0为空白对照液的吸光度，Ax 为加入样品液后的吸光度，Ax0为提取液本底的吸光度。

超氧阴离子自由基检测试剂盒(磺胺比色法)简介：超氧阴离子自由基作为生物体代谢过程中产生的一种自由基，可攻击生物大分子，如脂质、蛋白质、核酸和聚不饱和脂肪酸等，使其交链或者断裂，引起细胞结构和功能的破坏，与机体衰老和病变有很密切的关系，清除超氧阴离子自由基的研究已经得到了广泛的关注。

Leagene 超氧阴离子自由基检测试剂盒(磺胺比色法)又称超氧阴离子清除能力检测试剂盒，其检测原理是利用羟胺氧化的方法可以检测生物体系中超氧阴离子自由基(O 2-)，即超氧阴离子自由基(O 2-)与羟胺反应生成NO 2-，在一定范围内颜色深浅与超氧阴离子自由基(O 2-)成正比，根据NO 2-反应的标准曲线将A 530换算成NO 2-浓度，再依据上述关系式即可计算出O 2-浓度。

该试剂盒主要用于测定植物组织中的超氧阴离子自由基含量或超氧阴离子清除能力。

该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。

组成：自备材料：1、 蒸馏水2、 实验材料：植物组织(大豆、绿豆、玉米等叶片)、血液、组织样本等3、 研钵或匀浆器4、 离心管或试管5、 低温离心机6、 恒温箱或水浴锅7、 比色杯8、 分光光度计操作步骤(仅供参考)：编号 名称TO1123 50T Storage试剂(A): NO 2-标准(1mM) 1ml RT 试剂(B): O 2- Lysis buffer 125ml RT 试剂(C): 羟胺溶液30ml RT 试剂(D): 氨基苯磺酸显色液 30ml 4℃ 避光 试剂(E): 萘胺显色液 30ml4℃ 避光 使用说明书1份1、准备样品：①植物样品：取正常或逆境下的新鲜植物组织，清洗干净，擦干，切碎，迅速称取预冷的O2-Lysis buffer后冰浴条件下匀浆或研磨，4℃离心，上清液即为超氧阴离子自由基提取液，4℃保存备用。

②血浆、血清和尿液样品：血浆、血清按照常规方法制备后可以直接用于本试剂盒的测定，4℃保存，用于超氧阴离子自由基的检测。

·O2ˉ自由基清除实验(1) 实验原理黄嘌呤氧化酶黄嘌呤＋H2O+O2尿酸＋H2O2+·O2¯即黄嘌呤氧化酶在有氧条件下催化黄嘌呤转化为尿酸，同时产生超氧阴离子自由基(·O2¯)。

·O2¯与NBT结合后呈蓝色，样品清除能力越大，与NBT结合的·O2¯越少，溶液的颜色越浅。

(2)试剂Xanthine(黄嘌呤): (C5H4N4O2 ), MW=152.1, 6.084mg/100mL(0.4mmol/l)实际配制：1.216mg/10mL，与NBT等体积混合使用Xanthine oxidase(黄嘌呤氧化酶)贮液: 1 unit/mL , (溶解酶的溶液要高压灭菌！防止蛋白酶对酶的降解！)0.05 unit/mL，每次取200uL稀释到4mL(PBS溶解)NBT: (Nitro blue tetrazolium chloride氯化硝基四氮唑蓝), MW=817.65,黄色19.6236mg/100mL(0.24mmol/l)实际配制3.925mg/10mL，与Xanthine等体积混合使用PBS(0.01mol/L,pH=8.0): NaCl 8g, KCl 0.2g, Na2HPO4(无水) 1.44g, KH2PO4 0.24g,800mL水，用NaOH(1M)调pH到8.0，定容到1000mL。

实际配制500mL。

高压灭菌，室温保存。

PBS(0.01mol/L,pH=7.4): 配制同上Ascorbic acid: MW=176.12 母液为1mg/mL 先两倍逐级稀释5个浓度实际配制见记录本！HCl(1M): MW=36.5 310ul/10ml.(36% HCl密度1.18g/ml)实际配制：800uL浓盐酸+9mL水，于塑料管中4℃保存。

NaOH(1M): MW=40 0.4g/10mL, 存于冰箱(3) 测定方法超氧阴离子自由基清除能力的测定参照Bae等人的方法略加改进。

2超氧阴离子清除能力检测试剂盒说明书货号：UPLC-MS-5053规格：50T/48S可见分光光度法产品内容：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系工作人员。

试剂名称规格保存条件提取液液体60mL×1瓶2-8℃保存试剂一液体3mL×1瓶2-8℃保存试剂二粉剂×2瓶2-8℃保存试剂三液体15mL×1瓶2-8℃保存试剂四液体15mL×1瓶2-8℃保存试剂五液体15mL×1瓶2-8℃保存溶液的配制：1、试剂二：临用前每瓶加6mL 蒸馏水充分溶解。

2-8℃保存4周。

产品说明：生物体内超氧阴离子等活性氧具有免疫和信号传导的作用，但积累过多时会对细胞膜及生物大分子产生破坏作用，导致机体细胞和组织代谢异常，从而引起多种疾病。

AP-TEMED 系统产生超氧阴离子，与盐酸羟胺反应生成NO2－，NO －与对氨基苯磺酰胺和α-萘胺的作用生成红色的偶氮化合物，在530nm 处有特征吸收峰，样品对超氧阴离子的清除能力与530nm 的吸光值呈负相关。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。

如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：可见分光光度计、低温离心机、恒温培养箱/水浴锅、可调式移液器、1mL 玻璃比色皿、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤：一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）1、组织：按照组织质量（g ）︰提取液体积(mL)为1︰5~10的比例（建议称取约0.1g 组织，加入1mL 提取液）进行冰浴匀浆，然后10000g ，4℃，离心10min ，取上清，置于冰上待测。

2、液体：直接检测。

若有浑浊则离心后取上清待测。

3、细胞样本：收集细胞到离心管内，弃上清，按照每500万细胞加入1mL 提取液，超声波破碎细胞（功率200w ，超声3s ，间隔10s ，重复30次），然后10000g ，4℃，离心10min ，取上清，置冰上待测。

植物细胞内氧化应激活性氧超氧阴离子红色荧光测定试剂盒产品说明书（中文版）主要用途植物细胞内氧化应激活性氧超氧阴离子红色荧光测定试剂是一种旨在通过透膜荧光染色剂二氢溴化乙啶，在细胞氧化条件下，产生红色荧光，来检测细胞内超氧阴离子活性氧族的权威而经典的技术方法。

该技术经过精心研制、成功实验证明的。

其适用于各种其适用于新鲜植物组织（例如根尖、叶片等）和培养细胞等细胞内氧化应激活性氧的分析。

可以被用于细胞凋亡、信号传递、衰老和代谢等的研究。

产品严格无菌，即到即用，操作简易，活体检测，性能稳定，滞留持久，荧光清晰。

技术背景超氧自由基阴离子（superoxide radical；O2-）、过氧化氢（hydrogen peroxide；H2O2）、羟自由基或氢氧基（hydroxyl radical；OH-）、过氧化基（peroxyl radical；ROO-）、氢过氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷氧自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric Oxide；NO-）、过氧亚硝基阴离子（peroxynitrite anion；ONOO-）次氯酸（hypochlorous acid；HOCl）、半醌自由基（semiquinone radical）、单线态氧气（singlet oxygen）等细胞内活性氧族（Reactive Oxygen Species；ROS）的产生和增多，将导致细胞衰老或凋亡。

二氢溴化乙啶（Dihydroethidium bromide；Hydroethidine；DHE）是一种完全自由通过细胞膜，并在细胞内长期滞留而不外漏的染色剂。

一旦被超氧自由基阴离子氧化，二氢溴化乙啶转化为溴化乙啶，进入细胞核，与DNA紧密结合，便产生荧光。

据此证明细胞内超氧阴离子活性氧族的存在。

产品内容清理液（Reagent A）毫升固着液（Reagent B）毫升离析液（Reagent C）毫升染色液（Reagent D）微升产品说明书1份保存方式保存染色液（Reagent D）在－20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里；固着液（Reagent B）和离析液（Reagent C）具有腐蚀性，注意操作安全；有效保证6月用户自备胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（GMS12024）：用于细胞脱离完全细胞培养液（GMS12052）：用于细胞操作所需的培养基15毫升锥形离心管：用于细胞操作的容器1.5毫升离心管：用于染色液配制的容器载玻片：用于组织染色操作解剖针：用于植物组织解剖血细胞计数仪：用于细胞计数（微型）台式离心机：用于样品处理培养箱：用于染色孵育比色皿或酶标板：用于荧光定量分析的容器（共聚焦）荧光显微镜：用于荧光分析细胞流式仪：用于用于细胞染色分析荧光分光光度仪或荧光酶标仪：用于荧光定量分析实验步骤方法一：活体组织染色1．加上xx微升清理液（Reagent A）在载玻片上2．切取新鲜植物根尖，放进载玻片上的清理液（Reagent A）中3．用解剖针小心压碎根尖4．小心移去清理液（Reagent A）5．小心加上xx毫升清理液（Reagent A）在根尖上6．再加上xx微升染色液（Reagent D）7．放进37℃培养箱里孵育20分钟8．取出载玻片，移去染色液9．小心加上xx毫升清理液（Reagent A）10．小心移去清理液（Reagent A）11．盖上盖玻片，用拇指小心且垂直加压12．即刻在（共聚焦）荧光显微镜下进行观察：激发波长540nm，散发波长590nm――红色荧光增强，表明超氧阴离子含量高方法二：组织固定染色1．加上xx微升清理液（Reagent A）在载玻片上2．切取新鲜植物根尖，放进载玻片上的清理液（Reagent A）中3．用解剖针小心压碎根尖4．小心移去清理液（Reagent A）5．小心加上xx毫升固着液（Reagent B）6．室温下，孵育3小时，避免干化7．小心移去固着液（Reagent B）8．小心加上xx毫升清理液（Reagent A）9．小心移去清理液（Reagent A）10．小心加上xx毫升离析液（Reagent C）11．室温下孵育5分钟12．小心移去离析液（Reagent C）13．小心加上xx毫升清理液（Reagent A）14．小心移去清理液（Reagent A）13．小心加上xx毫升清理液（Reagent A）在根尖上14．再加上xx微升染色液（Reagent D）15．放进37℃培养箱里孵育20分钟16．取出载玻片，移去染色液17．小心加上xx毫升清理液（Reagent A）18．小心移去清理液（Reagent A）19．盖上盖玻片，用拇指小心且垂直加压20．即刻在（共聚焦）荧光显微镜下进行观察：激发波长540nm，散发波长590nm――红色荧光增强，表明超氧阴离子含量高方法三、培养植物细胞脱离染色1．准备1瓶25cm2细胞培养瓶的待测细胞2．小心抽去细胞培养液3．加入xx毫升清理液（Reagent A）到细胞培养瓶，覆盖培养瓶表面4．小心抽去清理液（Reagent A）5．加入1毫升用户自备的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，铺满整个培养平面6．置入37℃培养箱1分种7．振动培养瓶，使细胞脱落8．加入4毫升用户自备的完全细胞培养液9．移入15毫升锥形离心管，充分混匀（注意：悬浮细胞直接从这一步骤开始）10．移取10微升在血细胞计数仪上进行细胞计数11．移出1 X 106细胞到新的15毫升锥形离心管12．放进台式离心机离心5分钟，速度为300g13．小心抽去上清液14．加入xx毫升清理液（Reagent A）15．再加入xx微升染色液（Reagent D），混匀16．放进37℃恒温水槽孵育20分钟，避免光照17．放进台式离心机离心5分钟，速度为300g18．小心抽去上清液19．加入预冷的xx微升清理液（Reagent A），轻柔混匀细胞颗粒群20．放进冰槽里21．选择下列方式之一进行操作：1)即刻进行细胞流式仪分析：藻红蛋白（phycoerythrin；PE）波段，观察50000个细胞以上――波峰右移，表明超氧阴离子含量高2)或使用（共聚焦）荧光显微镜观察（定性检测）：1）移取10微升上述细胞悬液到载波片上，盖上盖玻片2）激发波长540nm，散发波长590nm――红色荧光增强，表明超氧阴离子含量高3)或使用荧光分光光度仪或荧光酶标仪检测（定量检测）：1）移取400微升上述细胞悬液到1毫升比色皿2）加入xx微升清理液（Reagent A）3）上下倾倒混匀数次4）放进荧光分光光度仪：激发波长540nm，散发波长590nm――RFU增高，表明超氧阴离子含量高方法四、贴壁培养细胞染色1．准备1个细胞培养24孔板的待测细胞，细胞铺满率达70％（注意：可以使用载玻片，载玻片培养皿，35mm培养皿，和其它培养孔板，见注意事项4）2．小心抽去细胞培养液3．小心沿着孔壁加入xx微升清理液（Reagent A）到1个细胞培养孔，覆盖培养孔表面4．再加入xx微升染色液（Reagent D）5．放进37℃细胞培养箱里孵育20分钟6．小心抽去染色液7．小心沿着孔壁加入xx微升37℃预热的清理液（Reagent A）到细胞培养孔8．选择下列方式之一进行操作：（A）使用倒置荧光显微镜观察（定性检测）：激发波长540nm，散发波长590nm――红色荧光增强，表明超氧阴离子含量高（B）使用荧光分光光度仪或荧光酶标仪检测（定量检测）：放进荧光分光光度仪或荧光酶标仪：激发波长540nm，散发波长590nm――RFU增高，表明超氧阴离子含量高注意事项1．本产品为20次操作2．操作时，须戴手套3．固着液（Reagent B）和离析液（Reagent C）具有腐蚀性，注意操作安全4．孵育时，必须避免光照5．建议染色完成后，即刻进行荧光检测分析6．本产品适合各种规格的培养细胞：载玻片，载玻片培养皿，35mm培养皿，和各种培养孔板，须相应调整操作用量：7．本产品适合活体染色和固定染色，染色剂不易洗掉，染色持久8．根据不同组织类型，调整染色液（Reagent D）的使用剂量（1：100至1：1000容量比），避免过度染色9．本公司提供系列活性氧分析试剂产品质量标准1．本产品经鉴定性能稳定2．本产品经鉴定荧光清晰。

Beijing Solarbio Science & Technology Co., LtdTel: 400-968-6088超氧化物歧化酶（SOD）活性检测试剂盒说明书微量法注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。

货号：BC0175规格：100T/48S产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

试剂名称规格保存条件提取液液体110 mL×1瓶2-8℃保存试剂一液体5 mL×1瓶2-8℃保存试剂二液体100 μL×1支2-8℃保存试剂三液体4 mL×1瓶2-8℃保存试剂四液体0.25mL×1支2-8℃保存溶液的配制：1、试剂二：使用前先离心再吹打混匀。

根据样本量将试剂二用蒸馏水稀释10倍后使用，当天用完。

2、试剂四：根据样本量将试剂四用蒸馏水稀释5倍后使用，当天用完。

产品说明：SOD（EC 1.15.1.1）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，催化超氧化物阴离子发生歧化作用，生成H2O2和O2。

SOD不仅是超氧化物阴离子清除酶，也是H2O2主要生成酶，在生物抗氧化系统中具有重要作用。

通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子(O2-)，O2-可还原氮蓝四唑生成蓝色甲臜，后者在560nm 处有吸收；SOD可清除O2-，从而抑制了甲臜的形成；反应液蓝色越深，说明SOD活性愈低，反之活性越高。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。

如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、细胞超声破碎仪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤：一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）1.细胞、细菌样本：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清，按照每500万细菌或细胞加入1mL提取液，超声波破碎（功率200w，超声3s，间隔10s，重复30次）。

抗超氧阴离子自由基及生产超氧阴离子自由基测试盒说明书修订日期：2015.07.13 Cat number：KGT012Store at4℃for6monthsFor Research Use Only（科研专用）一、测定原理模拟机体中黄嘌呤与黄嘌呤氧化酶反应系统，产生超氧阴离子自由基O2—，加入电子传递物质及gress 氏显色剂，使反应体系呈现紫红色，可用分光光度计测其吸光度，当被测样本中含有O2。

抑制剂时，则比色时测定管的吸光度低于对照管的吸光度，而如果被测样本中含有产生O2。

物质时，则比色时测定管的吸光度高于对照管的吸光度，通过以维生素C做标准，可计算出被检物品对O2。

的影响能力。

二、试剂盒组份组份KGT01250assaysBuffer A 5.0mLBuffer B 5.0mLBuffer C 5.0mLBuffer D350μLBuffer D稀释液 5.0mL试剂E1支试剂F1支Vc标准品4支注意事项1．Buffer A室温较低时会有部分结晶析出，溶解后加蒸馏水稀释10倍至1×Buffer A50ml。

2．Buffer D用前用Buffer D稀释液按1︰14稀释至1×Buffer D（不可冷冻，4℃可保存2个月）。

3．试剂E配制：将试剂加入蒸馏水37.5mL中溶解后备用，4℃避光保存。

4．试剂F配制：将试剂加入蒸馏水37.5mL中溶解后备用，4℃避光保存。

5．显色剂配制：试剂E︰试剂F︰冰乙酸＝3︰3︰2的体积比配制，4℃避光保存（冰乙酸自备）。

6．Vc标准贮备液配制：将一支Vc标准品加蒸馏水定容至5ml（Vc标准配制后当天内使用）Vc标准品工作液（0.15mg/ml）配制：取1ml贮备液加4ml蒸馏水，5倍稀释现配现用。

Vc标准品配制后见光极易分解，配制的0.15mg/ml Vc标准品工作液需30分钟内检测。

三、操作步骤试剂测定管对照管标准管1×Buffer A （mL ） 1.01.0 1.0蒸馏水（mL ）0.050.15mg/ml Vc 标准品（mL ）0.05样品（ml ）0.05Buffer B （mL ）0.10.10.1Buffer C （mL ）0.10.10.11×Buffer D （mL ）0.10.10.1用涡旋混匀器充分混匀，置37水浴40分钟显色剂（ml ）2.02.02.010min 后倒入1cm 光径比色杯中，蒸馏水调零，波长550nm 处比色。