超氧阴离子清除实验

超氧阴离子清除能力邻苯三酚法1 超氧阴离子的来源超氧阴离子(O2•-)是一种高活性自由基，是氧气分子失去一个电子后产生的。

在生物体内，超氧阴离子通常由线粒体电子传递链产生，同时也可以由细胞质中的NADPH氧化酶生成。

2 超氧阴离子的损害超氧阴离子是一种极其活泼的氧化剂，可以与细胞内的脂质、蛋白质和核酸等大分子发生氧化反应，并引起细胞的损害。

长期以来，科学家们一直在研究如何有效地清除超氧阴离子，以保护细胞免受其损害。

3 邻苯三酚法的原理邻苯三酚法是一种用于清除超氧阴离子的方法，该方法利用邻苯三酚的还原能力，将超氧阴离子还原成氧气分子，以达到清除超氧阴离子的目的。

邻苯三酚法的原理如下：① 邻苯三酚在氧气存在下被氧化成半醌，1C6H5-1C(OH)2-2C6H4 +O2 →C6H5-1C(O)2-2C6H4+H2O2② 半醌进一步被氧化成互相联结的二聚体，1C6H5-1C(O)2-2C6H4+C6H5-1C(O)2-2C6H4→(C6H5-1C(O)2-2C6H4)22③ 该反应同时产生超氧阴离子，1O2 +e-→O2•-2导致增加超氧阴离子的浓度。

④ 当邻苯三酚浓度超过一定程度时，它具有还原能力，可以将超氧阴离子还原为氧气分子，1O2•- + 2C6H5-1C(O)2-2C6H4→2C6H5-1C(OH)2-2C6H4 +O24 邻苯三酚法的应用邻苯三酚法已被广泛用于生物学、医学和环境科学等领域。

在生物学中，这种方法被用于研究超氧阴离子在细胞中的作用。

在医学中，邻苯三酚法被应用于治疗一些慢性气道疾病，如支气管哮喘。

在环境科学中，邻苯三酚法也被用于去除环境中的有害物质，如重金属离子。

5 邻苯三酚法的不足虽然邻苯三酚法是一种有效清除超氧阴离子的方法，但它也存在一些不足之处。

一方面，邻苯三酚的使用受到其毒性和生物可降解性的限制；另一方面，邻苯三酚的还原能力相对较弱，反应速度较慢，因此需要较长时间来消除超氧阴离子。

·O2ˉ自由基清除实验(1) 实验原理黄嘌呤氧化酶黄嘌呤＋H2O+O2尿酸＋H2O2+·O2¯即黄嘌呤氧化酶在有氧条件下催化黄嘌呤转化为尿酸，同时产生超氧阴离子自由基(·O2¯)。

·O2¯与NBT结合后呈蓝色，样品清除能力越大，与NBT结合的·O2¯越少，溶液的颜色越浅。

(2)试剂Xanthine(黄嘌呤): (C5H4N4O2 ), MW=152.1, 6.084mg/100mL(0.4mmol/l)实际配制：1.216mg/10mL，与NBT等体积混合使用Xanthine oxidase(黄嘌呤氧化酶)贮液: 1 unit/mL , (溶解酶的溶液要高压灭菌！防止蛋白酶对酶的降解！)0.05 unit/mL，每次取200uL稀释到4mL(PBS溶解)NBT: (Nitro blue tetrazolium chloride氯化硝基四氮唑蓝), MW=817.65,黄色19.6236mg/100mL(0.24mmol/l)实际配制3.925mg/10mL，与Xanthine等体积混合使用PBS(0.01mol/L,pH=8.0): NaCl 8g, KCl 0.2g, Na2HPO4(无水) 1.44g, KH2PO4 0.24g,800mL水，用NaOH(1M)调pH到8.0，定容到1000mL。

实际配制500mL。

高压灭菌，室温保存。

PBS(0.01mol/L,pH=7.4): 配制同上Ascorbic acid: MW=176.12 母液为1mg/mL 先两倍逐级稀释5个浓度实际配制见记录本！HCl(1M): MW=36.5 310ul/10ml.(36% HCl密度1.18g/ml)实际配制：800uL浓盐酸+9mL水，于塑料管中4℃保存。

NaOH(1M): MW=40 0.4g/10mL, 存于冰箱(3) 测定方法超氧阴离子自由基清除能力的测定参照Bae等人的方法略加改进。

清除超氧阴离子自由基
取0.05mol/L Tris-HCl 缓冲液（PH8.2）5ml ，置于25℃水浴中预热20min ，分别加入4ml 不同浓度的提取液，25℃水浴中预热20min ，再加入3mmol/L25℃水浴中预热20min 的邻苯三酚溶液1ml ，混匀后于25℃水浴中准确反应5min ，加入10mol/LHCl 1ml 终止反应，于320nm 处测定吸光度，空白对照组以相同体积的蒸馏水代替样品。

每个试样作三个平行样，取其平均值。

实验结果以清除率E 表示： E=空白
样品空白A A A -×100% A 样品用相同样品浓度的空白调零，消除样品颜色的影响。

注：A 空白是不加样液测一值（A 0），A 样品空白(A x0)是只加样液，其他用水代替。

2.5.2.3清除羟自由基
于试管中分别加入不同浓度的提取液2ml ，9mmol/L 水杨酸-乙醇2ml ，9mmol/L FeSO 4 2ml ，最后加入2ml 8.8mmol/L H 2O 2 启动反应，37℃反应15min ，以蒸馏水为空白对照，在510nm 下测量各待测液的吸光度。

考虑到本身的吸光值，以9mmol/L 水杨酸-乙醇2ml ，9mmol/L FeSO 4 2ml ，蒸馏水2ml ，不同浓度的样品溶液2ml 为提取液的本底吸收。

清除率的计算公式为：
·OH 清除率=0
)0x x (0A A A A --×100% 式中：A0为空白对照液的吸光度，Ax 为加入样品液后的吸光度，Ax0为提取液本底的吸光度。

第1页，共2页超氧阴离子清除能力检测试剂盒说明书可见分光光度法注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

货号:BC1410规格:50T/48S 产品内容:提取液：液体50mL×1瓶，4℃保存。

试剂一：液体2mL×1瓶，4℃避光保存。

试剂二：粉剂×1瓶，4℃避光保存。

临用前加8mL蒸馏水充分溶解。

试剂三：液体10mL×1瓶，4℃保存。

试剂四：液体10mL×1瓶，4℃避光保存。

试剂五：液体10mL×1瓶，4℃避光保存。

产品说明:超氧阴离子自由基作为生物体代谢过程中产生的一种自由基，可攻击生物大分子，如脂质、蛋白质、核酸和聚不饱和脂肪酸等，使其交链或者断裂，引起细胞结构和功能的破坏，与机体衰老和病变有很密切的关系，清除超氧阴离子自由基的研究已经得到了广泛的关注。

AP-TEMED系统产生超氧阴离子，与盐酸羟胺反应生成NO 2－，NO 2－与对氨基苯磺酸和α－萘胺的作用生成红色的偶氮化合物，在530nm处有特征吸收峰，样品对超氧阴离子的清除能力与530nm的吸光值呈负相关。

自备实验用品及仪器:天平、研钵、低温离心机、可见分光光度计/酶标仪、1ml玻璃比色皿、恒温水浴锅。

操作步骤:一、样品处理1.组织：按照质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g，加入1mL提取液）加入提取液，冰浴匀浆后于4℃，10000g离心10min，取上清置于冰上待测。

2.细胞：按照细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后4℃，10000g离心10min，取上清置于冰上待测。

3.培养液或其它液体：直接检测。

4.粉剂药物可配制成相同浓度，比如1mg/mL。

二、测定操作空白管对照管测定管试剂一（μL）404040试剂二（μL）160160H2O（μL）260100充分混匀，25℃反应1min样品（μL）100试剂三（μL）200200200充分混匀，37℃反应30min试剂四（μL）200200200试剂五（μL）200200200充分混匀，37℃显色20min，于1ml玻璃比色皿，以空白管调零，在530nm处测定对照管和测定管的吸光值，分别记为A对照管和A测定管。

一．实验原理：该方法利用NADH-PMS-NBT为超氧阴离子(O2·-)生成系统，超氧阴离子清除剂能减少NBT 的蓝色。

通过检测560nm处吸光值可判断体系中还原物质的还原能力。

二．实验仪器：分光光度计三．实验试剂：一：液体40mL×1瓶；二：液体1mL一瓶；三：粉剂一支；四：粉剂一支；五：1mg/mL芦丁标准品，1mL四．溶液配制：一工作液：用时加双蒸水360mL，也就是10倍稀释，得到400mL试剂一工作液；二工作液：用赠送的棕色瓶配制。

试剂二工作液由试剂二加上100mL试剂一工作液配得，现配现用，注意避光；三工作液：试剂三工作液由试剂三溶解于100mL试剂一工作液配得，现配现用；四工作液：粉剂一支。

用50mL双蒸水溶解，摇匀后，取10mL，加入90mL试剂一，配成试剂四工作液，现配现用，用赠送的棕色瓶盛装。

注意避光，配好的试剂请于2小时内用完。

五工作液：阳性对照，按需配制，-20℃保存。

五．实验步骤：充分混匀，室温避光静置5min使之充分反应。

560nm处，1cm光径比色杯，采用分光光度计测定吸光值。

六．清除能力计算：超氧阴离子自由基清除（%）=[空白孔吸光值-（测定孔吸光值-对照孔吸光值）]/空白孔吸光值*100注： 1 如未做对照孔，可以将其视作为0；2 阳性对照求值时将其视作测定孔进行计算即可。

七．注意事项：1. 如样品中色素物质不是分析对象，建议先通过SEP C18柱进行脱色处理，处理后样品可不做对照孔；2. 如不确定样品的超氧阴离子自由基清除能力，可先做不同浓度的稀释液进行摸索，并选择适宜浓度进行测定，高浓度下，浓度与清除率间并不线性相关。

3. 试剂三建议全程冰上操作。

试剂四切记避光保存，特别是配制后，且应尽快用完。

建议在做好一切其它准备工作后再配制试剂四应用液。

试剂四正常颜色为黄色，强光照射下，5-10分钟内会变为绿色，随后变为蓝色，变色后试剂不可再用！4. 试剂二、三应用液和样品混匀后再加入试剂四，次序颠倒会导致不显色。

改进的连苯三酚法：一种适用于所有抗氧化剂超氧自由基（•O2-）清除试验（适用于SOD）【名词辨析】•O2-：该微粒既含有一个成单的电子，所以，可以属于自由基，又带一个单位负电荷，也属于阴离子。

所以，可以称为“超氧自由基”、“过氧自由基”、“过氧阴离子自由基”、“过氧阴离子”、“超氧阴离子自由基”、“超氧阴离子”。

SOD：过氧化物歧化酶，使过氧自由基发生岐化反应，而清除之。

连苯三酚：有些文献也称为“邻苯三酚”。

但邻苯三酚是不准确的名称。

因为分子含有三个取代基，应当称为“连”。

【操作示意图】操作示意图[1]操作示意图的说明：最初的连苯三酚（1,2,3-三羟基苯）法是专门为超氧化物歧化酶开发的，现在广泛用于测量其他抗氧化剂的超氧化物清除。

然而，强烈的pH影响被忽略了。

在本研究中，首次系统地研究了影响因素，大量实验证明pH值至关重要。

由于主要抗氧化剂含有羧酸、酯或内酯基团，pH 8.2应改为生理pH 7.4。

改进的程序如下。

将连苯三酚溶液（在1 M HCl中）与pH 7.4的Tris-HCl溶液充分混合；在37°C下每隔30秒测量一次A325nm值，持续5分钟。

由于ΔA325nm，控制值反映基质•O2-的初始浓度−, 应妥善控制，以保证方法的准确性。

改进的连苯三酚法是一种可靠且廉价的超氧自由基清除试验，适用于所有类型的抗氧化剂。

用石英比色皿，不能用玻璃比色皿，因为玻璃比色皿在325nm处有吸收。

【详细介绍】[1]有几种方法可以测定食品的超氧阴离子交换活性，包括细胞色素还原、硝基四氮唑蓝（NBT）、电子自旋共振（ESR）、化学发光、荧光和高效液相色谱。

所有这些方法都需要特殊且昂贵的仪器或生物试剂。

连苯三酚（1,2,3-三羟基苯）自氧化法相对便宜。

它最初由Marklund 专门为超氧化物歧化酶（SOD）而设计，而不是为其他抗氧化剂而设计。

近几十年来，由于其方便性，它还被用于测定其他抗氧化剂，如多酚、酚酸、单宁、黄酮、花青素、蒽醌、多糖，甚至各种营养添加剂和提取物。

附录抗衰老实验实验一：对超氧阴离子清除作用的测定（邻苯三酚自氧化法）一实验原理：超氧阴离子自由基产生体系模型:邻苯三酚在弱碱性(Tris-HCl缓冲液，pH8.2)溶液中自身氧化分解产生超氧阴离子的反应为：在一定条件下，随着反应的进行，生成的超氧阴离子在体系中会不断积累，导致反应液的吸光度(299nm波长)在反应开始后5min之内随时间变化而线性增大。

因此在该时间内，于299nm处测定含被测物反应液的吸光度随时间的变化率, 并与空白液比较便可得出被测物抑制超氧阴离子积累的作用能力。

抑制率可根据下式计算：式中F O和F X分别表示空白液和被测液的吸光度随时间的变化率二实验仪器和试剂：1 主要仪器：紫外可见分光光度计，恒温水浴锅，10mL试管,分析天平。

2 主要试剂：待测液，弱碱性(Tris-HCl)缓冲液，邻苯三酚溶液，HCL溶液。

三试剂配制：1、Tris碱溶液：6.05g定容于500mL水中，形成0.1mol/L的Tris碱溶液。

2、0.1mol/L HCL溶液：1.0mL浓盐酸（36%，11.6mol/L）加入91.4mL水中。

3、Tris-HCL缓冲液（0.05mlo/L,pH8.2）：50mL的0.1mol/L的Tris碱溶液与22.9mL的0.1mol/L HCL溶液混合，定容至100mL。

4、25mmol/L 邻苯三酚溶液（焦性没食子酸）：将0.0315g邻苯三酚定容于10mL水中。

现配现用，4h内有效。

四实验方法：1、取0.05mol/L pH8.2的Tris-HCl缓冲液4.5ml于试管中，置于25℃水浴中预热20min；2、分别加入1ml不同浓度的试样和0.4mL,25mmol/L的邻苯三酚溶液（2.5 mmol/L邻苯三酚(由10 mmol/L HCl配制)0.4 ml），混匀后于25℃水浴中反应5min；3、加入8mol/L 盐酸1.0ml终止反应，以Tris-HCl缓冲液作参比，空白组以0.1 ml蒸馏水代替样品试液，在299nm处测定吸光度，计算清除率。