超氧阴离子清除能力检测试剂盒说明书 可见分光光度法

超氧自由基（·O2-）的清除能力测定法（连苯三酚自氧化法）（适用于：SOD及各种抗氧化剂）操作图解具体方法1 溶液配制1.1 Tris溶液（0.1mol/L）：1.21 gTris（三羟甲基氨基甲烷，M.W. 121.1）+100 mL蒸馏水。

1.2 HCl溶液（0.1mol/L）：取0.1 mL浓盐酸，加蒸馏水稀释到6 mL。

1.3 Tris-HCl缓冲液（0.05mol/L，pH7.4，含1mmol/L Na2EDTA）40 mL0.1 mol/L Tris溶液+ x mL0.1 mol/L HCl溶液+15.2 mg Na2EDTA，混合，稀释到80 mL。

用pH计测量，pH应为7.4。

用棕色瓶保存在冰箱内(最多保存三天) 。

（以上为一个样品的用量）用前稍热至室温，再测pH值，符合要求即可。

1.4 60 mmol/L连苯三酚溶液（溶于1 mmol/L盐酸中）取0.1mol/L HCl溶液（见1.2项）20μL，用蒸馏水稀释到2 mL，得1 mmol/L盐酸溶液（用pH计测量，pH＝2.5-3.0）。

再往里加连苯三酚14.6 mg (M。

W.126.1 )，即得。

（当天有效,以上为1个样品的用量）。

2 测试液2.1连苯三酚溶液：取2950μL Tris-HCl缓冲液加入到石英比色皿中，再加约50μL连苯三酚溶液，迅速混合(颠覆式)，开始计时,每隔30秒读数一次A值（325nm），至300秒（5min）时为止。

（空白参比：Tris-HCl 缓冲液）ΔA＝A325nm,300s - A325nm,30s。

由于ΔA值反映了生成·O2的初始浓度，所以，对于同一批实验而言，此时的ΔA值必须相等。

此时的ΔA为ΔA0。

3.2 样品溶液：取xμL样品溶液加入到大石英比色皿中，再加（2950-x）μL Tris-HCl缓冲液，再加50μL 连苯三酚溶液，迅速混合(颠覆式)，开始计时,每隔30秒读数一次（A值，325nm），至300秒时为止。

·O2ˉ自由基清除实验(1) 实验原理黄嘌呤氧化酶黄嘌呤＋H2O+O2尿酸＋H2O2+·O2¯即黄嘌呤氧化酶在有氧条件下催化黄嘌呤转化为尿酸，同时产生超氧阴离子自由基(·O2¯)。

·O2¯与NBT结合后呈蓝色，样品清除能力越大，与NBT结合的·O2¯越少，溶液的颜色越浅。

(2)试剂Xanthine(黄嘌呤): (C5H4N4O2 ), MW=152.1, 6.084mg/100mL(0.4mmol/l)实际配制：1.216mg/10mL，与NBT等体积混合使用Xanthine oxidase(黄嘌呤氧化酶)贮液: 1 unit/mL , (溶解酶的溶液要高压灭菌！防止蛋白酶对酶的降解！)0.05 unit/mL，每次取200uL稀释到4mL(PBS溶解)NBT: (Nitro blue tetrazolium chloride氯化硝基四氮唑蓝), MW=817.65,黄色19.6236mg/100mL(0.24mmol/l)实际配制3.925mg/10mL，与Xanthine等体积混合使用PBS(0.01mol/L,pH=8.0): NaCl 8g, KCl 0.2g, Na2HPO4(无水) 1.44g, KH2PO4 0.24g,800mL水，用NaOH(1M)调pH到8.0，定容到1000mL。

实际配制500mL。

高压灭菌，室温保存。

PBS(0.01mol/L,pH=7.4): 配制同上Ascorbic acid: MW=176.12 母液为1mg/mL 先两倍逐级稀释5个浓度实际配制见记录本！HCl(1M): MW=36.5 310ul/10ml.(36% HCl密度1.18g/ml)实际配制：800uL浓盐酸+9mL水，于塑料管中4℃保存。

NaOH(1M): MW=40 0.4g/10mL, 存于冰箱(3) 测定方法超氧阴离子自由基清除能力的测定参照Bae等人的方法略加改进。

超氧阴离子自由基检测试剂盒(磺胺比色法)简介：超氧阴离子自由基作为生物体代谢过程中产生的一种自由基，可攻击生物大分子，如脂质、蛋白质、核酸和聚不饱和脂肪酸等，使其交链或者断裂，引起细胞结构和功能的破坏，与机体衰老和病变有很密切的关系，清除超氧阴离子自由基的研究已经得到了广泛的关注。

Leagene 超氧阴离子自由基检测试剂盒(磺胺比色法)又称超氧阴离子清除能力检测试剂盒，其检测原理是利用羟胺氧化的方法可以检测生物体系中超氧阴离子自由基(O 2-)，即超氧阴离子自由基(O 2-)与羟胺反应生成NO 2-，在一定范围内颜色深浅与超氧阴离子自由基(O 2-)成正比，根据NO 2-反应的标准曲线将A 530换算成NO 2-浓度，再依据上述关系式即可计算出O 2-浓度。

该试剂盒主要用于测定植物组织中的超氧阴离子自由基含量或超氧阴离子清除能力。

该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。

组成：自备材料：1、 蒸馏水2、 实验材料：植物组织(大豆、绿豆、玉米等叶片)、血液、组织样本等3、 研钵或匀浆器4、 离心管或试管5、 低温离心机6、 恒温箱或水浴锅7、 比色杯8、 分光光度计操作步骤(仅供参考)：编号 名称TO1123 50T Storage试剂(A): NO 2-标准(1mM) 1ml RT 试剂(B): O 2- Lysis buffer 125ml RT 试剂(C): 羟胺溶液30ml RT 试剂(D): 氨基苯磺酸显色液 30ml 4℃ 避光 试剂(E): 萘胺显色液 30ml4℃ 避光 使用说明书1份1、准备样品：①植物样品：取正常或逆境下的新鲜植物组织，清洗干净，擦干，切碎，迅速称取预冷的O2-Lysis buffer后冰浴条件下匀浆或研磨，4℃离心，上清液即为超氧阴离子自由基提取液，4℃保存备用。

②血浆、血清和尿液样品：血浆、血清按照常规方法制备后可以直接用于本试剂盒的测定，4℃保存，用于超氧阴离子自由基的检测。

2超氧阴离子清除能力检测试剂盒说明书货号：UPLC-MS-5053规格：50T/48S可见分光光度法产品内容：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系工作人员。

试剂名称规格保存条件提取液液体60mL×1瓶2-8℃保存试剂一液体3mL×1瓶2-8℃保存试剂二粉剂×2瓶2-8℃保存试剂三液体15mL×1瓶2-8℃保存试剂四液体15mL×1瓶2-8℃保存试剂五液体15mL×1瓶2-8℃保存溶液的配制：1、试剂二：临用前每瓶加6mL 蒸馏水充分溶解。

2-8℃保存4周。

产品说明：生物体内超氧阴离子等活性氧具有免疫和信号传导的作用，但积累过多时会对细胞膜及生物大分子产生破坏作用，导致机体细胞和组织代谢异常，从而引起多种疾病。

AP-TEMED 系统产生超氧阴离子，与盐酸羟胺反应生成NO2－，NO －与对氨基苯磺酰胺和α-萘胺的作用生成红色的偶氮化合物，在530nm 处有特征吸收峰，样品对超氧阴离子的清除能力与530nm 的吸光值呈负相关。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。

如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：可见分光光度计、低温离心机、恒温培养箱/水浴锅、可调式移液器、1mL 玻璃比色皿、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤：一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）1、组织：按照组织质量（g ）︰提取液体积(mL)为1︰5~10的比例（建议称取约0.1g 组织，加入1mL 提取液）进行冰浴匀浆，然后10000g ，4℃，离心10min ，取上清，置于冰上待测。

2、液体：直接检测。

若有浑浊则离心后取上清待测。

3、细胞样本：收集细胞到离心管内，弃上清，按照每500万细胞加入1mL 提取液，超声波破碎细胞（功率200w ，超声3s ，间隔10s ，重复30次），然后10000g ，4℃，离心10min ，取上清，置冰上待测。

抗超氧阴离子自由基及生产超氧阴离子自由基测试盒说明书修订日期：2015.07.13 Cat number：KGT012Store at4℃for6monthsFor Research Use Only（科研专用）一、测定原理模拟机体中黄嘌呤与黄嘌呤氧化酶反应系统，产生超氧阴离子自由基O2—，加入电子传递物质及gress 氏显色剂，使反应体系呈现紫红色，可用分光光度计测其吸光度，当被测样本中含有O2。

抑制剂时，则比色时测定管的吸光度低于对照管的吸光度，而如果被测样本中含有产生O2。

物质时，则比色时测定管的吸光度高于对照管的吸光度，通过以维生素C做标准，可计算出被检物品对O2。

的影响能力。

二、试剂盒组份组份KGT01250assaysBuffer A 5.0mLBuffer B 5.0mLBuffer C 5.0mLBuffer D350μLBuffer D稀释液 5.0mL试剂E1支试剂F1支Vc标准品4支注意事项1．Buffer A室温较低时会有部分结晶析出，溶解后加蒸馏水稀释10倍至1×Buffer A50ml。

2．Buffer D用前用Buffer D稀释液按1︰14稀释至1×Buffer D（不可冷冻，4℃可保存2个月）。

3．试剂E配制：将试剂加入蒸馏水37.5mL中溶解后备用，4℃避光保存。

4．试剂F配制：将试剂加入蒸馏水37.5mL中溶解后备用，4℃避光保存。

5．显色剂配制：试剂E︰试剂F︰冰乙酸＝3︰3︰2的体积比配制，4℃避光保存（冰乙酸自备）。

6．Vc标准贮备液配制：将一支Vc标准品加蒸馏水定容至5ml（Vc标准配制后当天内使用）Vc标准品工作液（0.15mg/ml）配制：取1ml贮备液加4ml蒸馏水，5倍稀释现配现用。

Vc标准品配制后见光极易分解，配制的0.15mg/ml Vc标准品工作液需30分钟内检测。

三、操作步骤试剂测定管对照管标准管1×Buffer A （mL ） 1.01.0 1.0蒸馏水（mL ）0.050.15mg/ml Vc 标准品（mL ）0.05样品（ml ）0.05Buffer B （mL ）0.10.10.1Buffer C （mL ）0.10.10.11×Buffer D （mL ）0.10.10.1用涡旋混匀器充分混匀，置37水浴40分钟显色剂（ml ）2.02.02.010min 后倒入1cm 光径比色杯中，蒸馏水调零，波长550nm 处比色。

·O2ˉ自由基清除实验(1) 实验原理黄嘌呤氧化酶黄嘌呤＋H2O+O2尿酸＋H2O2+·O2¯即黄嘌呤氧化酶在有氧条件下催化黄嘌呤转化为尿酸，同时产生超氧阴离子自由基(·O2¯)。

·O2¯与NBT结合后呈蓝色，样品清除能力越大，与NBT结合的·O2¯越少，溶液的颜色越浅。

(2)试剂Xanthine(黄嘌呤): (C5H4N4O2 ), MW=152.1, 6.084mg/100mL(0.4mmol/l)实际配制：1.216mg/10mL，与NBT等体积混合使用Xanthine oxidase(黄嘌呤氧化酶)贮液: 1 unit/mL , (溶解酶的溶液要高压灭菌！防止蛋白酶对酶的降解！)0.05 unit/mL，每次取200uL稀释到4mL(PBS溶解)NBT: (Nitro blue tetrazolium chloride氯化硝基四氮唑蓝), MW=817.65,黄色19.6236mg/100mL(0.24mmol/l)实际配制3.925mg/10mL，与Xanthine等体积混合使用PBS(0.01mol/L,pH=8.0): NaCl 8g, KCl 0.2g, Na2HPO4(无水) 1.44g, KH2PO4 0.24g,800mL水，用NaOH(1M)调pH到8.0，定容到1000mL。

实际配制500mL。

高压灭菌，室温保存。

PBS(0.01mol/L,pH=7.4): 配制同上Ascorbic acid: MW=176.12 母液为1mg/mL 先两倍逐级稀释5个浓度实际配制见记录本！HCl(1M): MW=36.5 310ul/10ml.(36% HCl密度1.18g/ml)实际配制：800uL浓盐酸+9mL水，于塑料管中4℃保存。

NaOH(1M): MW=40 0.4g/10mL, 存于冰箱(3) 测定方法超氧阴离子自由基清除能力的测定参照Bae等人的方法略加改进。

DPPH自由基清除能力试剂盒说明书（货号：G0128F分光法48样）一、产品简介：DPPH（1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical）即1,1-二苯基-2-苦基肼基自由基。

广泛用于定量测定生物试样和食品的抗氧化能力。

此法是根据DPPH自由基有单电子，在517nm处有一强吸收，其醇溶液呈紫色的特性。

当有自由基清除剂存在时，由于与其单电子配对而使其吸收逐渐消失，呈现的颜色越浅，即A值越低，进而对样本中DPPH清除能力进行定量分析。

二、试剂盒的组成和配制：试剂名称规格保存要求备注工作液粉剂×1瓶4℃保存临用前甩几下使试剂落入底部，再加入38mL无水乙醇充分溶解备用；用不完的试剂4℃避光保存;标准品粉剂×1支4℃保存若重新做标曲，则用到该试剂三、所需的仪器和用品：可见分光光度计、1mL玻璃比色皿（光径1cm）、离心机、可调式移液器、研钵、冰、甲醇、无水乙醇和蒸馏水。

四、DPPH自由基清除能力测定：建议正式实验前选取2个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费！1、样本制备：①组织样本：称取约0.1g新鲜组织或者称取约0.05g烘干样本（将样本在105℃下杀青3min，然后60℃烘干至恒重，粉碎，过40目筛，得到烘干样本），加入1mL的80%甲醇提取液（若鲜样需研磨均质），于60℃，200-300W条件下超声提取30min（间隔5min振荡混匀一次），若有损失需用80%甲醇定容至1mL。

12000rpm室温离心10min，取上清测定。

【注】：若增加样本量，可按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例进行提取②细菌/细胞样本：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取约500万细菌或细胞加入1mL 80%甲醇提取液，超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；12000rpm室温离心10min，取上清测定。

抗氧化活性研究方法引言：氧化反应是指分子或原子失去电子，而还原反应是指分子或原子获得电子。

由于氧化反应产生的自由基具有高度活性，能够对细胞结构和功能造成损害，导致多种疾病的发生。

因此，研究抗氧化活性及其机制对于预防和治疗这些疾病具有重要意义。

本文将介绍几种常用的抗氧化活性研究方法。

一、DPPH自由基清除能力测定法DPPH自由基清除能力测定法是一种常用的抗氧化活性测定方法。

DPPH（2,2-二苯基-1-苦味肼）是一种紫色自由基，其颜色随着氧化程度的增加而减弱。

在该方法中，将待测样品与DPPH溶液混合，通过测定混合液的吸光度变化来评估样品的抗氧化活性。

抗氧化活性强的样品能够清除DPPH自由基，使其浓度降低，从而导致吸光度的下降。

二、还原能力测定法还原能力测定法是通过测定待测样品对还原剂的还原能力来评估其抗氧化活性。

常用的还原剂包括铁离子、铜离子等。

在该方法中，将待测样品与还原剂混合，通过测定混合液的吸光度变化或还原剂浓度的变化来评估样品的抗氧化活性。

抗氧化活性强的样品能够还原还原剂，使其浓度降低，从而导致吸光度的下降或还原剂浓度的降低。

三、氧化脂质抑制能力测定法氧化脂质抑制能力测定法是通过测定待测样品对氧化脂质的抑制能力来评估其抗氧化活性。

常用的氧化脂质包括脂肪酸、脂肪油等。

在该方法中，将待测样品与氧化脂质混合，通过测定混合液中脂质的氧化程度来评估样品的抗氧化活性。

抗氧化活性强的样品能够有效抑制氧化脂质的形成。

四、超氧阴离子清除能力测定法超氧阴离子是一种常见的自由基，具有较高的活性。

超氧阴离子清除能力测定法是通过测定待测样品对超氧阴离子的清除能力来评估其抗氧化活性。

常用的超氧阴离子产生体系包括NBT（硝基蓝盐）-NADH（尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸）体系、XTT（二苯基四唑盐）体系等。

在该方法中，将待测样品与超氧阴离子产生体系混合，通过测定混合液的吸光度变化来评估样品的抗氧化活性。

抗氧化活性强的样品能够有效清除超氧阴离子，使其浓度降低，从而导致吸光度的下降。

改进的连苯三酚法：一种适用于所有抗氧化剂超氧自由基（•O2-）清除试验（适用于SOD）【名词辨析】•O2-：该微粒既含有一个成单的电子，所以，可以属于自由基，又带一个单位负电荷，也属于阴离子。

所以，可以称为“超氧自由基”、“过氧自由基”、“过氧阴离子自由基”、“过氧阴离子”、“超氧阴离子自由基”、“超氧阴离子”。

SOD：过氧化物歧化酶，使过氧自由基发生岐化反应，而清除之。

连苯三酚：有些文献也称为“邻苯三酚”。

但邻苯三酚是不准确的名称。

因为分子含有三个取代基，应当称为“连”。

【操作示意图】操作示意图[1]操作示意图的说明：最初的连苯三酚（1,2,3-三羟基苯）法是专门为超氧化物歧化酶开发的，现在广泛用于测量其他抗氧化剂的超氧化物清除。

然而，强烈的pH影响被忽略了。

在本研究中，首次系统地研究了影响因素，大量实验证明pH值至关重要。

由于主要抗氧化剂含有羧酸、酯或内酯基团，pH 8.2应改为生理pH 7.4。

改进的程序如下。

将连苯三酚溶液（在1 M HCl中）与pH 7.4的Tris-HCl溶液充分混合；在37°C下每隔30秒测量一次A325nm值，持续5分钟。

由于ΔA325nm，控制值反映基质•O2-的初始浓度−, 应妥善控制，以保证方法的准确性。

改进的连苯三酚法是一种可靠且廉价的超氧自由基清除试验，适用于所有类型的抗氧化剂。

用石英比色皿，不能用玻璃比色皿，因为玻璃比色皿在325nm处有吸收。

【详细介绍】[1]有几种方法可以测定食品的超氧阴离子交换活性，包括细胞色素还原、硝基四氮唑蓝（NBT）、电子自旋共振（ESR）、化学发光、荧光和高效液相色谱。

所有这些方法都需要特殊且昂贵的仪器或生物试剂。

连苯三酚（1,2,3-三羟基苯）自氧化法相对便宜。

它最初由Marklund 专门为超氧化物歧化酶（SOD）而设计，而不是为其他抗氧化剂而设计。

近几十年来，由于其方便性，它还被用于测定其他抗氧化剂，如多酚、酚酸、单宁、黄酮、花青素、蒽醌、多糖，甚至各种营养添加剂和提取物。

超氧阴离子自由基清除能力测试试剂盒（A002-96T分光光度计法）一、测定原理该方法利用NADH-PMS-NBT为超氧阴离子(O2·-)生成系统，超氧阴离子清除剂能减少NBT的蓝色。

通过检测560nm处吸光值可判断体系中还原物质的还原能力。

二、试剂组成试剂一：液体40mL×1瓶；试剂二：液体1mL一瓶；试剂三：液体1mL一瓶；试剂四：粉剂一支；试剂五：1mg/mL没食子酸标准品，1mL。

三、储存条件及有效期试剂盒-20℃可保存6个月。

四、试剂的配制试剂一工作液：用时加双蒸水360mL，也就是10倍稀释，得到400mL试剂一工作液；试剂二工作液：用赠送的棕色瓶配制。

试剂二工作液由试剂二加上100mL试剂一工作液配得，现配现用，注意避光；试剂三工作液：试剂三工作液由试剂三加上100mL试剂一工作液配得，现配现用；试剂四工作液：粉剂一支。

用50mL双蒸水溶解，摇匀后，取10mL，加入90mL试剂一，配成试剂四工作液，现配现用，用赠送的棕色瓶盛装。

注意避光，配好的试剂请于2小时内用完。

试剂五：1mg/mL没食子酸标准品，100μL，-20℃保存。

五、操作步骤测定吸光值。

1空白管很重要，建议做3个以上平行；2如样品颜色较浅可不做对照管六、计算公式注： 1 如未做对照孔，可以将其视作为0；2 阳性对照求值时将其视作测定孔进行计算即可。

七、注意事项1. 如样品中色素物质不是分析对象，建议先通过SEP C18柱进行脱色处理，处理后样品可不做对照孔；2. 如不确定样品的超氧阴离子自由基清除能力，可先做不同浓度的稀释液进行摸索，并选择适宜浓度进行测定，高浓度下，浓度与清除率间并不线性相关。

3. 试剂四切记避光保存，特别是配制后，且应尽快用完。

建议在做好一切其它准备工作后再配制试剂四应用液。

试剂四正常颜色为黄色，强光照射下，5-10分钟内会变为绿色，随后变为蓝色，变色后试剂不可再用！4. 试剂二、三应用液和样品混匀后再加入试剂四，次序颠倒会导致不显色。

DPPH 自由基清除能力检测试剂盒说明书可见分光光度法货号：BC4750 规格：50T/24S产品内容：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

试剂名称 规格 保存条件 提取液 液体50 mL×1瓶 2-8℃保存 试剂一 液体60 mL×1瓶（自备）常温保存 试剂二 粉剂×1瓶 2-8℃保存 试剂三粉剂×1支2-8℃保存溶液的配制：1、 试剂一：无水乙醇自备；2、 试剂二：粉剂置于瓶内EP 管中。

临用前加入6.08 mL 试剂一振荡溶解，用不完的试剂可于-20℃保存1个月，建议分装保存，避免反复冻融；临用前根据试验所需量按照试剂二：试剂一（V:V ）= 4：21的比例配制成工作液，现配现用，用不完的工作液可于2-8℃保存一周；3、 试剂三：10 mg 维生素C 。

临用前加入1 mL 提取液，充分振荡溶解，配成10 mg/mL 维生素C 溶液，2-8℃保存两周；用于阳性对照。

产品说明：DPPH 自由基一种很稳定的氮中心的自由基，是样本抗氧化能力的重要指标之一，广泛应用于抗氧化类食品、保健品及药品的研究中。

DPPH 自由基有单电子，其醇溶液呈紫色，在515 nm 处有强吸收。

当有抗氧化剂存在时，DPPH 自由基被清除，其溶液颜色变浅，515 nm 的吸光度下降，在一定范围内其吸光度的变化与自由基被清除的程度成正比。

本试剂盒中，通过吸光度下降的程度来反映样本清除DPPH 自由基的能力。

DPPH · DPPH ·H注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。

如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：可见分光光度计、1 mL 玻璃比色皿、恒温水浴锅、台式离心机、无水乙醇、研钵/粉碎机、烘干箱、30~50目筛和蒸馏水。

操作步骤：一、样本的制备（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）（1）植物样本的制备：将新鲜样本置于60℃烘箱烘干至恒重，研钵研碎（或粉碎机粉碎），过30~50目筛。

食物总抗氧化能力(TAC)比色法（DPPH）定量检测试剂盒产品说明书（中文版）主要用途食物总抗氧化能力（TAC）比色法(DPPH)定量检测试剂是一种旨在通过有机氮自由基染料DPPH的参与，在抗氧化剂的存在下，通过分光光度仪，观察其峰值下降的变化，来定量检测对应于标准水溶性生育酚Trolox的总抗氧化能力，即消除自由基等值浓度的权威而经典的技术方法。

该技术经过精心研制、成功实验证明的。

适用于各种新鲜组织（动物、人体、昆虫等）的总抗氧化能力检测。

产品严格无菌，即到即用，操作简易，性能稳定。

技术背景超氧自由基阴离子（superoxide radical；O2-）、过氧化氢（hydrogen peroxide；H2O2）、羟自由基或氢氧基（hydroxyl radical；OH-）、过氧化基（peroxyl radical；ROO-）、氢过氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷氧自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric Oxide；NO-）、过氧亚硝基阴离子（peroxynitrite anion；ONOO-）次氯酸（hypochlorous acid；HOCl）、半醌自由基（semiquinone radical）、单线态氧气（singlet oxygen）等细胞内活性氧族（Reactive Oxygen Species；ROS）的产生和增多，将导致细胞衰老或凋亡，甚而导致诸如冠心病、风湿性关节炎、肿瘤、退行性病变等各种病理状况。

在生物系统内，通过抗氧化酶例如超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶等，大分子，例如白蛋白、铜蓝蛋白（ceruloplasmin；CER）、铁蛋白（ferritin）和抗氧化因子，例如生育醇、类胡萝卜素、抗坏血酸、还原性谷胱甘肽和尿酸胆红素（bilirubin）等，产生抗氧化能力，即捕获自由基的能力，达到消除或降低ROS的损害。

通过稳定的有机氮自由基染料1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-Dipheny1-2-picrylhydrazylradical；DPPH），受到抗氧化剂的去自由基作用，呈现深紫色转化为黄色的变化，衡量体系中抗氧化剂捕获自由基、消耗抗氧化剂的能力，在分光光度仪(515nm波长）的帮助下，观察其峰值下降的变化，并与标准化抗氧化剂水溶性生育酚Trolox 对照。

Beijing Solarbio Science & Technology Co., LtdTel: 400-968-6088超氧化物歧化酶（SOD）活性检测试剂盒说明书可见分光光度法注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。

货号：BC0170规格：50T/24S产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

试剂名称规格保存条件提取液液体60 mL×1瓶2-8℃保存试剂一液体15 mL×1瓶2-8℃保存试剂二液体160 μL×1支2-8℃保存试剂三液体11 mL×1瓶2-8℃保存试剂四液体0.5mL×1支2-8℃保存溶液的配制：1、试剂二：使用前先离心再吹打混匀。

根据样本量将试剂二用蒸馏水稀释10倍后使用，当天用完。

2、试剂四：根据样本量将试剂四用蒸馏水稀释5倍后使用，当天用完。

产品说明：SOD（EC 1.15.1.1）是一种广泛存在于生物体内的金属酶，是重要的氧自由基清除剂，能催化超氧化物阴离子发生歧化作用，生成H2O2和O2。

SOD不仅是超氧化物阴离子清除酶，也是H2O2主要生成酶，在生物抗氧化系统中具有重要作用。

通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子(O2-)，O2-可还原氮蓝四唑生成蓝色甲臜，后者在560nm 处有吸收；SOD可清除O2-，从而抑制了甲臜的形成；反应液蓝色越深，说明SOD活性愈低，反之活性越高。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。

如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：可见分光光度计、台式离心机、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵/匀浆器、细胞超声破碎仪、冰和蒸馏水。

操作步骤：一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）1.细菌或细胞样本：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清，按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500-1000:1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率200W，超声3s，间隔10s，重复30次），8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

超氧化物歧化酶（SOD）检测试剂盒—WST说明书修订日期：2019.07.23Cat number：KGT00150-2/KGT001100-2Store at 2-8℃ for 12 months，避光For Research Use Only本试剂盒只能用于检测SOD的活性，不能用于检测超氧阴离子（O2-）。

一.检测机理超氧化物歧化酶（SOD）是一种重要的抗氧化酶，它可以催化超氧阴离子（O2-）的歧化反应，生成过氧化氢和单质氧。

目前有很多直接或间接地测量 SOD 活性的方法，在这些方法中，使用硝基蓝四唑（氮蓝四唑 nitroblue tetrazolium，简称 NBT）的一种间接测量方法因其便捷、简单的使用方法而被广泛应用。

但是 NBT 法存在一些缺点，例如生成的染料（Formanzan dye）的水溶性较低，会和黄嘌呤氧化酶的还原型发生反应等问题。

SOD 检测试剂盒—WST 提供了更为简便的检测 SOD 的方法，它是利用高度水溶性四唑盐WST-1(2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯基)-2 氢-四唑盐，二钠盐)，能与超氧阴离子（O2-）反应生成一种水溶性染料。

WST-1 被超氧阴离子还原的比率与黄嘌呤氧化酶的活性线性相关，并且会被 SOD所抑制（见下图，即红字区域 SOD 反应优先发生，SOD 反应完后蓝色区域 WST-1 反应才能发生）。

因此 SOD或者 SOD 类似物 IC50（50%的抑制浓度）就能用比色法来测定。

二．试剂盒内容方法1（检测SOD抑制率法）：50孔可以检测9-15个样品；100孔可以检测18-29个样品。

方法2（检测SOD活性法）：50孔可以检测2-7个样品；100孔可以检测4-13个样品。

两种方法的操作和实验结果准确度都有区别，请根据您的具体情况和实验准确度要求选择。

三．贮藏条件请在 0-5℃下保存，试剂盒在 0-5℃下可保存一年。

在4℃下，WST工作液可保存 2 个月，Enzyme 工作液可保存 3 周。

植物超氧阴离子自由基含量的测定一、实验目的了解实验原理，掌握实验技术二、实验原理超氧阴离子（。

二）能与羟胺反应生成N03-，反应式为：0毘+NH2OH+2 +H = NO2+H2O2+H2O其中NO2进一步反应生成对氨基磺酸、反应后再生成a苯胺，最后生成红色的偶氮化合物。

其中，偶氮化合物在520nm到560nm下有吸收峰，本次实验在530nm下进行比色。

三、实验材料与仪器植物材料小麦叶片，荠菜叶片试剂NaNO2-AR 100卩；蒸馏水；对氨基酸苯磺酸；a苯酸；PBS;盐酸羟胺；对氨基苯磺酸；a苯胺。

仪器可见光分光光度计，型号V-1100D四、实验方法1. 标准曲线1234567 NO2-标准液（50卩g/m）00.20.40.8 1.2 1.6 2.0蒸馏水 2.0 1.8 1.6 1.20.80.40对氨基酸苯磺酸 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0a苯酸 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0然后置于30°C培养箱中保温30min显色反应测定A530,以NO?-为横坐标，A530值为纵坐标，绘制标准曲线。

2. °二的提取小麦叶片称取1.0g。

加入少量PH7.8的PBS研磨。

之后定容到5ml。

10000rpm 45°C离心10min。

之后取上清液备用。

注：空白对照直接用上清液显色测本底值NO?含量。

*3•组织中°二测定-o（2）NO2-显色，调标准线上述反应液对氨基苯磺酸a 苯胺标样 2.0 2.0 2.0 调零2.02.02.030°C 恒温箱中保温 30min 4.°f 含量计算从标准曲线中计算出测定液相对应的 N°2浓度，并换算成超氧阴离子的浓度 （X ）,再算出超氧 阴离子的含量。

匚含量（ug g -1FW ） =2X ・Vt n/gFWVs注：Vt 为样品提取液总体积；n 为稀释倍数；Vs 为显色时提取液体积； X 为从标准曲线上计算出的N°2的浓度。

超氧自由基（·O2-）的清除能力测定法（连苯三酚自氧化法）（适用于：SOD及各种抗氧化剂）操作图解具体方法1 溶液配制1.1 Tris溶液（0.1mol/L）：1.21 gTris（三羟甲基氨基甲烷，M.W. 121.1）+100 mL蒸馏水。

1.2 HCl溶液（0.1mol/L）：取0.1 mL浓盐酸，加蒸馏水稀释到6 mL。

1.3 Tris-HCl缓冲液（0.05mol/L，pH7.4，含1mmol/L Na2EDTA）40 mL0.1 mol/L Tris溶液+ x mL0.1 mol/L HCl溶液+15.2 mg Na2EDTA，混合，稀释到80 mL。

用pH计测量，pH应为7.4。

用棕色瓶保存在冰箱内(最多保存三天) 。

（以上为一个样品的用量）用前稍热至室温，再测pH值，符合要求即可。

1.4 60 mmol/L连苯三酚溶液（溶于1 mmol/L盐酸中）取0.1mol/L HCl溶液（见1.2项）20μL，用蒸馏水稀释到2 mL，得1 mmol/L盐酸溶液（用pH计测量，pH＝2.5-3.0）。

再往里加连苯三酚14.6 mg (M。

W.126.1 )，即得。

（当天有效,以上为1个样品的用量）。

2 测试液2.1连苯三酚溶液：取2950μL Tris-HCl缓冲液加入到石英比色皿中，再加约50μL连苯三酚溶液，迅速混合(颠覆式)，开始计时,每隔30秒读数一次A值（325nm），至300秒（5min）时为止。

（空白参比：Tris-HCl 缓冲液）ΔA＝A325nm,300s- A325nm,30s。

由于ΔA值反映了生成·O2的初始浓度，所以，对于同一批实验而言，此时的ΔA值必须相等。

此时的ΔA为ΔA0。

3.2 样品溶液：取xμL样品溶液加入到大石英比色皿中，再加（2950-x）μL Tris-HCl缓冲液，再加50μL 连苯三酚溶液，迅速混合(颠覆式)，开始计时,每隔30秒读数一次（A值，325nm），至300秒时为止。