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常用的蛋白质表达系统及其基本表达策略1. 介绍蛋白质表达系统是在生物技术领域中广泛应用的重要技术，它可以在大量生产目的蛋白质时提供帮助。
在选择蛋白质表达系统时，科研人员通常需要考虑表达效率、纯度、可溶性和最终产物活性等因素。
在本文中，我们将介绍一些常用的蛋白质表达系统，并阐述它们的基本表达策略。
2. 细菌表达系统细菌表达系统是最常用的蛋白质表达系统之一，其中大肠杆菌表达系统是应用最为广泛的。
基本表达策略包括将目的基因插入原核表达载体中，通过大肠杆菌的代谢系统表达目的蛋白质。
在表达前，需要考虑选择适当的启动子、选择合适的宿主菌株以及优化表达条件等因素。
3. 酵母表达系统酵母表达系统通常采用酿酒酵母或毕赤酵母。
基本表达策略包括将目的基因插入酵母表达载体中，通过酵母的翻译后修饰系统表达目的蛋白质。
在表达前，需要考虑选择合适的启动子、选择适当的宿主菌株以及与酵母细胞适应的表达条件等因素。
4. 昆虫细胞表达系统昆虫细胞表达系统常用于大规模生产蛋白质。
基本表达策略包括将目的基因插入昆虫表达载体中，通过昆虫细胞的翻译后修饰系统表达目的蛋白质。
在表达前，需要考虑选择合适的启动子、适当的宿主昆虫细胞系以及适合昆虫细胞生长的表达条件等因素。
5. 哺乳动物细胞表达系统哺乳动物细胞表达系统通常用于生产高度活性的蛋白质。
基本表达策略包括将目的基因插入哺乳动物表达载体中，通过哺乳动物细胞的翻译后修饰系统表达目的蛋白质。
在表达前，需要考虑选择适当的启动子、选择适合的宿主细胞系以及适合哺乳动物细胞生长的表达条件等因素。
6. 植物细胞表达系统植物细胞表达系统是一种新兴的蛋白质表达系统，常用于农业生物技术和药物开发领域。
基本表达策略包括将目的基因插入植物表达载体中，通过植物细胞的翻译后修饰系统表达目的蛋白质。
在表达前，需要考虑选择适当的启动子、适合的宿主植物组织以及适合植物细胞生长的表达条件等因素。
结论在选择蛋白质表达系统时，科研人员需要根据目的蛋白质的性质、表达需求以及实验条件等因素综合考虑，并选择最适合的表达系统和基本表达策略。
提高大肠杆菌高密度发酵可溶性表达量研究目的：提高外源蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达量。
方法：采用大肠杆菌K12菌株，含有表达某种抗体类蛋白的表达质粒，通过在发酵过程中加入甲硫氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的方式，检测不同发酵时间表达量变化情况，评估每种物质对于目的蛋白在大肠杆菌中可溶性表达的影响。
结果：同时加入甲硫氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的发酵批次可溶性蛋白表达量最高。
结论：说明在大肠杆菌高密度发酵过程中加入甲硫氨酸、亮氨酸和异亮氨酸有助于提高目的蛋白的可溶性表达。
标签：大肠杆菌；高密度发酵；甲硫氨酸；亮氨酸；异亮氨酸；可溶性表达大肠杆菌是目前常用的蛋白发酵菌体，采用高密度发酵技术（High cell density cultivation，HCDC）不仅可以减少培养体积、提高目的蛋白产量，还可以缩短生产周期，减少设备投资从而降低生产成本，能极大地提高在市场上的竞争力[1]。
但外源蛋白在获得高水平表达的同时，容易形成包涵体，包涵体中的多肽链折叠错误，没有活性，必须通过复杂的复性过程才能获得功能正常的蛋白，但成功率低[2]，特别是含二硫键较多的包涵体蛋白，在复性过程中容易发生二硫键的错配，从而使蛋白质失去生物学活性。
蛋白的可溶性表达则可避免变、复性过程，明显简化后续纯化工艺，保证功能蛋白的功能。
因此，探索外源蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达具有较高的学术价值和广泛的应用前景。
目前针对于高密度发酵过程中蛋白可溶性表达的研究主要停留在对大肠杆菌宿主细胞[3]、比生长速率、诱导时机[4]、诱导温度[5]、培养基成分[6]、碳源种类[7]、表达载体启动子[8]、融合标签[9]等。
关于发酵过程中补入氨基酸对可溶性蛋白表达的影响，国内目前的相关研究报道偏少。
国外研究表明，在大肠杆菌表达蛋白期间，正亮氨酸残基的引入会导致正常合成的蛋白结构或功能改变[10]，引起可溶性蛋白表达量的降低。
在发酵过程中，补入甲硫氨酸，可以确保细胞获得过量的甲硫氨酸，从而减少了甲硫氨酰tRNA不正确的加载正亮氨酸的概率。
蛋白融合表达全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：蛋白融合表达（Protein Fusion Expression）是生物技术领域中一种常用的蛋白表达技术，通过将不同蛋白基因序列进行融合，使其能够在目标宿主细胞中表达出含有多个功能区域的融合蛋白。
蛋白融合表达技术是从基因水平上控制蛋白质的结构和功能，为蛋白质的生物学功能研究、药物研发和生物制药等领域提供了有效的手段。
一、蛋白融合表达的原理蛋白融合表达技术是利用基因工程技术将两个或多个蛋白基因的编码序列连接在一起，形成一个新的融合蛋白基因，然后通过转染或转化等手段将其导入目标宿主细胞中，使其表达出融合蛋白。
蛋白融合表达的基本原理是将两个或多个不同功能的蛋白通过融合技术合并在一起，达到协同作用或增强某一功能的效果。
蛋白融合表达可通过多种途径实现，常见的方法包括直接连接两个蛋白的编码序列、利用核酶切割和PCR等技术进行DNA重组，以及通过载体和质粒等载体介导融合蛋白的表达。
不同的蛋白融合表达技术具有各自的特点和适用范围，选择合适的融合表达策略可提高蛋白表达效率和提取纯度。
1. 生物学功能研究：蛋白融合表达技术可用于研究蛋白质的结构和功能，通过融合不同功能区域的蛋白进行功能分析和蛋白相互作用研究，揭示蛋白质的生物学特性和作用机制。
2. 药物研发：蛋白融合表达技术在药物研发中具有广泛的应用，可用于合成重组蛋白、多肽和抗体等生物制剂，提高药物的活性和稳定性，开发新型药物和治疗方法。
3. 生物制药：蛋白融合表达技术是生物制药领域中最常用的生产方法之一，可用于大规模生产融合蛋白、重组蛋白和生物药物，提高生产效率和产品质量，满足临床需求。
4. 技术创新：蛋白融合表达技术在生物技术领域具有重要的技术意义，可以用于开发新型蛋白表达系统、优化蛋白表达和纯化工艺、改良蛋白结构和功能等方面，推动生物技术的发展和进步。
1. 提高蛋白表达效率：蛋白融合表达技术可以利用多个功能区域相互作用增强蛋白的稳定性和可溶性，提高蛋白的表达水平和纯度。
重组表达质粒的构建——原核表达载体选择质粒载体是重组蛋白表达的关键工具，其结构如下图。
重组蛋白表达，我们首先要将基因插入到表达载体上，插入的位置为多克隆位点。
质粒载体上有很多的功能元件，这些元件对于蛋白的表达都是至关重要的。
尽管我们经过系统的分析和预测，但是仍有很多蛋白不能顺利表达、表达量很低或者表达状态不好。
这个时候我们需要尝试构建不同的表达载体以期得到最好的效果，这些载体的主要区别是启动子和融合标签的差异。
蛋白表达优化主要工作也就是尝试构建不同融合表达标签，使用不同的宿主表达菌，测试不同的表达条件，筛选出最优表达体系。
常用的融合标签有GST、MBP、Trx、6His、SUMO等，这些标签主要功能是促表达、促可溶、信号标记或助纯化。
福因德生物可以提供以下系列载体以供科研表达研究。
1）促表达/促溶标签2）信标标签3）纯化标签我们选择表达载体的时候不但要考虑蛋白怎么表达成功，更要考虑蛋白怎么纯化出来，纯化的问题主要是考虑纯化标签和酶切位点的选择，下表我们列举了常见的纯化标签和酶切位点。
4）酶切位点以上为原核表达常用的标签和酶切位点,其性质也都作了简要的介绍，各专业网站或专业书籍已对此做详尽解释，科研工作者可根据具体实验设计方案，组合设计以上标签和酶切位点的使用。
特别值得注意的是，选用和设计蛋白酶切位点的时候首要考虑的是序列内部有没有蛋白酶位点，同时要考虑酶切的效率和蛋白酶试剂成本。
一般商业化载体，在标签蛋白与载体多克隆位点之间都设计有酶切位点。
标签可设计在N-端也可在C-端,设计在N-端的优势是,可通过标签高效翻译起始位点带动插入蛋白的表达,可溶性标签的高效表达更可促进蛋白的可溶性表达;同时,大部分的蛋白内切酶的切割位点在C-端,所以标签设计在N-端可将标签切割完全。
在设计标签序列与酶切位点的时候还要考虑N-端稳定性原则，也就是所谓宿主细胞的N-端规则（N-end rule）,这个要避免；同时，还应该检查是否引入了可与别的蛋白相互作用的序列或者蛋白酶切位点。
重组蛋白的概述1.概述分离纯化组成了基因工程的下游处理（downstream processing）阶段，这一过程又和上游过程紧密相联系，上游过程的诸方面影响到下游的分离纯化，所以在进行目标蛋白质表达纯化时要统一考虑和整体设计，并充分考虑上游因素对下游的影响，如是否带有亲和标签，是否进行分泌表达。
目前应用最广泛的表达系统有三大类，分别是大肠杆菌表达系统、酵母表达系统和CHO细胞表达系统，不同的表达系统和培养方法显著影响下游的处理过程，目标蛋白表达是否形成包涵体，目标蛋白表达的定位（胞内、细胞内膜、周质空间和胞外），蛋白表达的量都依赖于所选择的表达系统。
选择将所表达的蛋白分泌到细胞外或周质空间可以避免破碎细胞的步骤，并且由于蛋白质种类少，目标蛋白容易纯化；而在细胞质内表达蛋白，可能是可溶性表达，可能形成包涵体，可溶性的蛋白往往需要复杂的纯化步骤，而包涵体易于分离，纯度较高，但回收具有生物活性的蛋白却变的相当困难，需要对聚集的蛋白进行变复性，通常活性蛋白的得率比较低，表1列出了不同策略对表达、纯化的影响，对于其中的有些缺点可以通过一定的方法进行克服和避免，如利用DNA重组技术给外源蛋白加上一个亲和纯化的标签，有助于可溶性外源蛋白的选择性纯化，并能保护目标蛋白不被降解（96）。
表 1 重组蛋白不同表达策略的优点和缺点表达策略优点缺点分泌表达至细胞外增强正确二硫键的形成降低蛋白酶对表达蛋白的降解可获得确定的N末端显著减少杂蛋白水平，简化纯化不需要细胞破碎表达水平低多数蛋白不能进行分泌表达表达蛋白需要进行浓缩细胞周质空间表达增强正确二硫键的形成可获得确定的N末端显著减少杂蛋白水平，简化纯化好些蛋白不能分泌进入周质空间没有大规模选择性的释放周质空间蛋白的技术周质蛋白酶可引起重组蛋白酶解胞内包涵体表达包涵体易于分离保护蛋白质不被降解蛋白质不具有活性对宿主细胞生长没有大的影响，通常可获得高的表达水平需要体外的折叠和溶解，得率较低具有不确定N末端胞内可溶性蛋白表达不需要体外溶解和折叠一般具有正确的结构和功能高水平的表达常难以得到需要复杂的纯化可发生蛋白质的酶解具有不确定的N末端在细胞的提取物中，除了目标蛋白外，还含有其它各种性质的蛋白、核酸、多糖等。
蛋白质可溶性问题及其在表达系统中的解决策略蛋白质是细胞中最重要的生物大分子之一，它们在细胞内发挥着关键的生物学功能。
然而，许多表达系统经常遇到蛋白质可溶性问题，即蛋白质在表达过程中失去了其正常的可溶性结构。
这一问题严重影响了蛋白质功能的研究和应用。
本文将探讨蛋白质可溶性问题的原因以及解决策略。
一、蛋白质可溶性问题的原因1.1 蛋白质序列蛋白质序列在很大程度上决定了其可溶性。
一些蛋白质序列中含有高比例的疏水性氨基酸，这使得蛋白质容易聚集形成不可溶性沉淀。
此外，蛋白质序列中可能存在折叠障碍，导致蛋白质无法正确折叠形成可溶性结构。
1.2 表达条件表达温度、pH值等表达条件的选择也会影响蛋白质的可溶性。
不适当的表达条件可能导致蛋白质的不正常折叠、聚集或失去稳定性，进而降低其可溶性。
二、蛋白质可溶性问题的解决策略2.1 优化蛋白质序列通过对蛋白质序列进行合理的修改和调整，可以提高其可溶性。
一种常用的策略是引入疏水性氨基酸的替代，使蛋白质序列中的疏水性氨基酸比例降低，从而减少其聚集倾向。
此外，可以通过在蛋白质序列中插入构象稳定的序列或结构域，促进蛋白质的正确折叠和稳定。
2.2 调节表达条件合适的表达条件对于蛋白质的可溶性至关重要。
通过调节表达温度、pH值、培养基成分等参数，可以有效提高蛋白质的可溶性。
例如，降低表达温度有助于减缓蛋白质的聚集速度，同时增加蛋白质的折叠时间，有利于蛋白质正确折叠和可溶性的保持。
2.3 使用辅助蛋白质辅助蛋白质在表达系统中的应用可以通过促进蛋白质正确折叠和增强其可溶性来解决可溶性问题。
例如，分子伴侣蛋白可以与目标蛋白结合，提供适当的环境，促进其正常折叠和稳定。
此外，某些蛋白质互作可以通过与其他互补的亚单位结合来增加其可溶性。
2.4 优化翻译后修饰蛋白质的可溶性还受到其翻译后修饰的影响。
通过优化翻译后修饰酶的表达和调节，可以增强蛋白质的可溶性。
例如，合适的糖基化修饰可以提高蛋白质的稳定性和可溶性。
Vol.53,No.07. 2019DOI：10.3969/j.issn.2095-1205.2019.07.23提高大肠杆菌重组蛋白可溶性表达方法研究进展张真汪燕马振刚（重庆市动物生物学重点实验室，重庆市媒介昆虫重点实验室，重庆师范大学重庆401331）摘要大肠杆菌表达系统与其他外源表达系统相比具有重组蛋白产量高、易操作、生长速度快和成本低等特点。
通过大肠杆菌表达重组蛋白是一种既高效又经济的途径。
然而，外源蛋白在大肠杆菌中表达时往往处于还原性环境的胞质中，而在胞质中外源蛋白不易形成二硫键，出现外源蛋白无法正确折叠的现象，从而形成不可溶的包涵体。
文章在近年提高大肠杆菌重组蛋白可溶性表达研究的基础上，从选择适当的载体和宿主、外源蛋白与其他辅助蛋白共表达、降低蛋白合成速率、提高周质蛋白表达、融合标签表达、肽标签表达、替换蛋白质中的氨基酸、改变培养基的条件等方面进行了综述，为研究者根据外源蛋白自身特点，优化外源蛋白可溶性表达方法提供了参考。
关键词外源蛋白；可溶性表达；大肠杆菌；包涵体中图分类号:Q78文献标识码:A文章编号:2095-1205(2019)07-37-04 Advances in Improving the Soluble Expression of EscherichiaColi Recombinant ProteinZhang Zhen Wang Yan Ma Zhengang（Chongqing Key Laboratory of Animal Biology, Chongqing Key Laboratory of Vector Insects, Chongqing Normal University,Chongqing 401331）Abstract：Compared with other exogenous expression systems, escherichia coli expression system has the characteristics of high yield, easy operation, fast growth rate and low cost of recombinant protein. It is an efficient and economical way to express recombinant protein through escherichia coli. However, when expressed in escherichia coli, exogenous proteins tend to be in the cytoplasm of the reductive environment, whereas in cytoplasm, exogenous proteins are not easy to form disulfide bonds, and foreign proteins cannot fold properly, thus forming insoluble inclusion bodies. On the basis of improving the soluble expression of escherichia coli recombinant protein, the article summarized from selecting the appropriate carrier and the host, exogenous proteins are co-expressed with other helper proteins, reducing the rate of protein synthesis, improving the periplasmic protein expression, expression of fusion tag expression, peptide tag expression, replacing amino acids in a protein, changing the condition of culture medium and other aspects, providing a reference for researchers to optimize the soluble expression of exogenous proteins according to their own characteristics.Key words：exogenous proteins; soluble expression; escherichia coli; inclusion body目前大部分蛋白质功能研究需要的是可以大量纯化并且可溶的蛋白质，但不管是天然提取还是使用化学合成纯的蛋白质都是非常困难的[1]，而DNA重组技术提供了一种经济的外源蛋白获取方式。
原核蛋白可溶性表达策略及实验方案可溶性表达策略大肠杆菌根据表达部位的不同可将蛋白表达的形式分为3种：第1种为胞外分泌，即目的蛋白被分泌到培养基中。
这种方式表达的蛋白容易纯化，不易降解，但通常只有少量的蛋白质可以分泌到细胞外；第2种为周质空间表达，这种方式表达的蛋白存在于周质间隙中，外周质的氧化环境有利于蛋白质的正确折叠，在向外周质转移的过程中，信号肽在细胞内剪切，更有可能产生目的蛋白的天然N末端；第3种为胞内表达，这种表达易形成无活性的包涵体，需要经过繁琐的变性、复性过程才能得到有活性的蛋白。
因为多数蛋白不能够进行分泌表达，且表达量较少，所以分泌蛋白表达方法很少被使用；现阶段实验科研中常用的方法是融合型蛋白表达，包括蛋白上清表达和包涵体复性，以上俩种方法均可获得大量的可溶性蛋白。
有关通过蛋白复性获得可溶性蛋白请参见《包涵体蛋白复性的方法操作》，这里主要从条件优化的角度讨论第一种方法。
降低重组蛋白合成的速率可溶性蛋白的产率取决于蛋白的合成速率，蛋白的折叠速率，以及聚集的速率。
高水平表达时，肽链聚集的速率一旦超过折叠速率，就会形成包涵体。
因此，降低重组蛋白合成的速率有利于提高重组蛋白的可溶性表达。
常用的方法有培养温度的优化、挑选合适的启动子、诱导剂和诱导条件的优化等。
密码子优化密码子的使用对外源基因的表达水平有重要的影响。
密码子优化就是根据表达系统对密码子的偏好性进行优化筛选。
经过优化的基因序列往往能提高mRNA二级结构的稳定性，有利于新生肽段的正确折叠，提高外源活性蛋白的表达。
值得注意的是，稀有密码子存在通常会对蛋白表达产生负面影响，在转录过程中稀有密码子的位置以及转录的速率都会影响密码子的翻译，但在某些基因中使用稀有密码子则能显著降低肽链的延伸速率。
启动子的选择需要从启动子强度、漏表达程度、诱导性及经济因素等方面考虑。
在胞内表达中，常采用T7、PL等强启动子，表达水平可达菌体总蛋白的70%。
若重组蛋白多以包涵体形式存在，可采用强度较弱的lac等启动子以达到一个与表达能力相匹配的翻译速率。
原核蛋白可溶性表达策略及实验方案可溶性表达策略大肠杆菌根据表达部位的不同可将蛋白表达的形式分为3种：第1种为胞外分泌，即目的蛋白被分泌到培养基中。
这种方式表达的蛋白容易纯化，不易降解，但通常只有少量的蛋白质可以分泌到细胞外；第2种为周质空间表达，这种方式表达的蛋白存在于周质间隙中，外周质的氧化环境有利于蛋白质的正确折叠，在向外周质转移的过程中，信号肽在细胞内剪切，更有可能产生目的蛋白的天然N末端；第3种为胞内表达，这种表达易形成无活性的包涵体，需要经过繁琐的变性、复性过程才能得到有活性的蛋白。
因为多数蛋白不能够进行分泌表达，且表达量较少，所以分泌蛋白表达方法很少被使用；现阶段实验科研中常用的方法是融合型蛋白表达，包括蛋白上清表达和包涵体复性，以上俩种方法均可获得大量的可溶性蛋白。
有关通过蛋白复性获得可溶性蛋白请参见《包涵体蛋白复性的方法操作》，这里主要从条件优化的角度讨论第一种方法。
降低重组蛋白合成的速率可溶性蛋白的产率取决于蛋白的合成速率，蛋白的折叠速率，以及聚集的速率。
高水平表达时，肽链聚集的速率一旦超过折叠速率，就会形成包涵体。
因此，降低重组蛋白合成的速率有利于提高重组蛋白的可溶性表达。
常用的方法有培养温度的优化、挑选合适的启动子、诱导剂和诱导条件的优化等。
密码子优化密码子的使用对外源基因的表达水平有重要的影响。
密码子优化就是根据表达系统对密码子的偏好性进行优化筛选。
经过优化的基因序列往往能提高mRNA二级结构的稳定性，有利于新生肽段的正确折叠，提高外源活性蛋白的表达。
值得注意的是，稀有密码子存在通常会对蛋白表达产生负面影响，在转录过程中稀有密码子的位置以及转录的速率都会影响密码子的翻译，但在某些基因中使用稀有密码子则能显著降低肽链的延伸速率。
启动子的选择需要从启动子强度、漏表达程度、诱导性及经济因素等方面考虑。
在胞内表达中，常采用T7、PL等强启动子，表达水平可达菌体总蛋白的70%。
若重组蛋白多以包涵体形式存在，可采用强度较弱的lac等启动子以达到一个与表达能力相匹配的翻译速率。
如何提高目的蛋白的可溶性表达在大肠杆菌中，当外源蛋白高水平表达的时候，极易形成包涵体，为蛋白纯化等下游工作带来很大的麻烦。
下面是一些可以参考的有助于提高目的蛋白可溶性表达的实验方案：1.降低蛋白合成的速度。
可以通过以下方法实现：a.降低培养温度b.使用弱启动子c.使用低拷贝数的质粒表达载体d.降低诱导物的浓度2.改变培养基a.培养基中加入可以帮助蛋白折叠的因子b.加入缓冲液保持pH稳定c.加入1%的葡萄糖，抑制lac启动子d.加入山梨糖醇等可以稳定蛋白天然结构的因子e.加入乙醇，thiols and disulfides等？3.与分子伴侣或折叠酶共表达常用的分子伴侣有：GroES-GroEL，DnaK-DnaJ-GrpE，ClpB常用的折叠酶有：peptidyl prolyl cis/trans isomerases (PPI's)disulfide oxidoreductase (DsbA) and disulfide isomerase (DsbC)protein disulfide isomerase (PDI)4.分泌表达。
使目的蛋白分泌到周质空间周质空间的氧化性的环境有利于二硫键的形成，而胞内则是还原性的。
周质空间有折叠酶DsbA和DsbC的存在，帮助蛋白正确折叠。
周质空间很少有蛋白酶存在，不会被水解。
可以使对细胞有毒性的蛋白大量存在。
5.使用特定的菌株AD494, which has a mutation in thioredoxin reductase (trxB).Origami，a double mutant in thioredoxin reductase (trxB) and glutathione reductase (gor).6.与可溶性partner融合表达7.表达目的蛋白的一个片段> 70 kDa的蛋白在大肠杆菌中是很难表达的。
8.体外去折叠，重新折叠外源蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达策略摘要：长期以来，大肠杆菌一直是表达外源蛋白的首选表达系统．但由于外源蛋白在表达过程中容易被宿主细胞蛋白酶降解或者形成包涵体，其应用受到了限制．本文综述了在大肠杆菌中表达可溶外源蛋白的策略和进展，以期提高具有生物活性的外源基因的表达水平．1 前言：大肠杆菌具有遗传性状了解透彻、生长快、培养经济、表达水平高、待选质粒和宿主多等特点，在基因工程技术领域成为首选的表达系统．但是外源蛋白往往在获得高水平表达的同时，容易被宿主蛋白酶降解或者形成包涵体．目前国内外对蛋白质体外复性研究较多，但其过程往往费时、费力，且不经济，因此，探索外源蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达具有较高的学术价值和广泛的应用前景．2 宿主与载体的选择2．1宿主的选择2．1．1选择有利于外源蛋白可溶性表达的宿主外源蛋白在大肠杆菌细胞质或细胞周质中表达时，容易被宿主本身表达的蛋白酶降解．因此，选择蛋白酶缺失的宿主非常有利于外源蛋白的表达，尤其是外源可溶蛋白和分泌表达的蛋白．Ignatova等采用不同的大肠杆菌宿主表达青霉素酰化酶，优化培养基后，发现蛋白酶缺失的宿主BL21(DE3)表达该活性可溶蛋白优势明显．Schein等发现缺失Ion蛋白酶的大肠杆菌宿主能显著地提高RNases的可溶分泌表达水平．除此之外，由于大肠杆菌细胞质环境是还原性的，不利于形成二硫键，因此，如果能构建促进二硫键形成的宿主，也将有可能极大地提高可溶蛋白的表达水平2．1．2外源蛋白与其他辅助蛋白共表达在强启动子调控下，外源蛋白在大肠杆菌中的表达水平往往比较高，而宿主自身的折叠辅助蛋白(分子伴侣与折叠酶)显然无法满足新生肽段正确折叠的要求．因此，共表达分子伴侣和折叠酶就有可能为外源新生肽段提供充分的辅助折叠支持，进而增加可溶活性蛋白的表达量．目前用于共表达以增加外源蛋白可溶性的辅助蛋白有GroEL／ES 和Dn水一DnaJ-GrpE、引发因子(Trigger factor)、硫氧还蛋白(Thioredoxin)和折叠酶fFoldase)等．需要注意的是，应根据外源蛋白的特点有选择性地共表达分子伴侣和折叠酶．例如在大肠杆菌中共表达热激蛋白GroEL／ES能增加某些蛋白(0c 一1，6一岩藻糖基转移酶、浸麻芽孢杆菌环式糊精葡聚糖转移酶、谷氨酸消旋酶剐、过氧化物歧化酶、酪氨酸激酶、人胶原酶原)的可溶性，却对其他一些蛋白(人型干扰素受体2c亚基的胞外段、噬菌体P22结构蛋白、人酸性富含胱氨酸分泌型蛋白无增溶效果．又如GroEL／ES与人酪氨酸激酶Lck共表达并不能增加后者的可溶性，而硫氧还蛋白却能显著地促进该外源蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达．除此之外，温度也可能会对共表达折叠辅助蛋白的效果产生重要的影响．例如preS2一S，_B一半乳糖苷酶与DnaK和DnaJ分子伴侣共表达，能在30～42℃范围内提高可溶蛋白的表达水平，而共表达GroEL和GroES 分子伴侣却只能在30℃条件下取得比较好的效果．值得一提的是，如果将几种折叠辅助蛋白分子同时共表达，有可能获得比单独表达某种折叠辅助蛋白更好的效果．Jiro等5J将GroEI／ES，Trx或DsbBD与谷氨酸消旋酶同时共表达，活性谷氨酸消旋酶的产量上升了2．2～2．3倍．在某些情况下，共表达那些能增加蛋白可溶性和促进大肠杆菌生长的蛋白也能起到良好的效果．例如Kallio等在大肠杆菌中共表达透明颤菌血红蛋白，发现该蛋白对活性蛋白的表达有明显促进作用．2．2载体的选择2．2．1启动子的选择目前有许多启动子应用于外源蛋白的表达．选择启动子可溶性表达外源蛋白，需要从启动子强度、漏表达程度、诱导性以及经济因素等各方面加以考虑．如果外源蛋白分泌表达，蛋白表达速率必须加以优化，以防止大肠杆菌的转运系统达到饱和状态．因此，需要选择的启动子的强度应尽量与宿主细胞的转运能力保持一致．如果所表达的外源蛋白对细胞的生长有毒害作用，应尽量选择高度可抑制性和诱导性启动子，以减少对宿主细胞的不利影响．另外，还需要从经济和启动子诱导的操作性角度选择合适的启动子．目前应用相当广泛的PET系统，调控紧密，能使克隆到T7启动子下游的外源目的基因在IPTG(或乳糖)诱导下大量表达．但外源蛋白的过量表达往往形成包涵体，高水平的mRNA 也容易导致核糖体的破坏和细胞死亡，而且T7RNA聚合酶可能导致质粒和外源基因表达的不稳定．专门用于外源蛋白低温诱导的温度敏感型启动子冷激蛋白CspA 能在适当低温条件下达到较高的可溶蛋白表达水平．Csp启动子比较适用于那些易形成包涵体或不稳定基因产物的外源蛋白的表达．除此之外，阿拉伯糖启动子、pH 启动子、渗透压启动子、溶氧启动子等也日益为人们所重视，并且有的已经成功应用于大规模生产过程．2．2．2构建融合蛋白通过增加连接体(Linker)而改变蛋白序列有可能改善蛋白折叠、提高蛋白的溶解性、增强抗蛋白酶降解性、增加蛋白产量以及在培养基中分泌表达．而对于那些外源小分子量蛋白或某些分子量较大蛋白的片段，只能考虑构建融合蛋白才能顺利表达．大肠杆菌麦芽糖结合蛋白(MBP)与目的蛋白融合表达，除了易于分离和提高目的蛋白稳定性外，还常具有在细胞周质分泌表达的优点．Clement等将重组单链抗体(scFvs)~ C末端与MBP融合后在细胞质内表达，发现融合蛋白的可溶性和稳定性均比未融合蛋白有了显著的提高．Spangfort等将HIV人T淋巴细胞受体CD4与麦芽糖结合蛋白融合表达(LB培养基，30℃)，发现融合表达产物可溶，并被转运到细胞周质．多聚组氨酸(Polyhistidine)与外源蛋白融合后能通过固定离子亲合层析给外源蛋白的分离纯化带来极大便利，但组氨酸的数目与融合部位对融合蛋白的表达水平及其溶解性有显著影响．硫氧还蛋白(Thioredoxin)与许多外源蛋白融合后能促进外源蛋白的可溶性表达，这种效应在较低温度下尤为显著[2引．其他可供选择的融合蛋白还有钙调蛋白结合蛋白(Calmodulin—binding peptide)、DsbA和谷胱甘肽一S一转移酶(GST)及天然大肠杆菌蛋白NusA，GrpE，BFR等．需要注意的是，温度可能对融合蛋白可溶性表达的效果有重大影响．另外，以融合蛋白方式表达外源蛋白有三点需要慎重考虑：首先，融合表达会增加一个切除融合片断的程序，该程序往往需要昂贵的高特异性的因子，相应地增加了成本；其次，即使是较高特异性的因子也往往会对目的蛋白发生作用，造成目的蛋白损失和杂蛋白增多；最后，即使融合蛋白表达的水平较高，经过各种分离程序之后，目的蛋白的量可能非常有限．2．2. 3分泌表达由于大肠杆菌的细胞质是一个还原性环境，外源蛋白在细胞质内往往难以正确折叠．分泌表达外源蛋白能简化蛋白纯化工艺，除此之外，由于分泌表达后信号序列的切除，外源蛋白前端的甲硫氨酸残基不复存在，保证了外源蛋白N一端的纯正性．然而外源蛋白分泌表达是一个非常复杂的过程，常常会遇到诸如不完全的跨内膜转运、转运装置的容量不足以及蛋白降解等问题．许多因素，包括外源蛋白的大小、氨基酸组成及导肽的类型都会对蛋白的转运造成影响．为获得外源蛋白的高效分泌表达，应尽量优化翻译水平，使其与大肠杆菌的转运装置的容量保持一致．共分泌表达分子伴侣或向培养基中加入低分子量的添加剂，往往会提高外源蛋白在细胞周质内分泌表达的水平.2．2．4密码子的使用密码子的使用对外源基因的表达水平有重要的影响．研究人员已经对蛋白表达过程中稀有密码子替换的效应进行了深入的研究，但并没有获得一致性的结论．稀有密码子存在对某些蛋白质的表达具有负面影响，这种负面效应可能缘于某些tRNA相对不足，或者是密码子一反密码子配对的能量差异．在转录过程中稀有密码子的位置以及转录的速率都会影响密码子的翻译．虽然在某些情况下，密码子的优化可以获得更高水平的蛋白表达，但研究人员发现，基因的表达水平并非总是受稀有密码子的限制，而且rRNA的丰度也未必与密码子的使用相关联．值得注意的是，在某些基因中使用稀有密码子能显著降低肽链的延伸速率，从而有利于新生肽段的正确折叠，提高外源活性蛋白的表达口．然而，对于特定外源蛋白的表达，一个密码子优化的程序可能是有益的，因为经过优化的基因序列往往能提高mRNA二级结构的稳定性．3 培养条件与诱导方法的选择3．1降低培养温度最适合大肠杆菌生长的温度在37～39℃之间，在此温度下表达外源蛋白极易生成包涵体．低温培养条件下表达外源蛋白能有效地增加可溶蛋白的比例．但培养温度也有一个下限，一般为8～10℃，因为在此温度以下，大肠杆菌将停止生长，蛋白也基本上停止表达．定点突变可能会对表达可溶蛋白的温度选择有重要影响．Mainfroid等发现人丙糖磷酸异构酶37℃下能在大肠杆菌中可溶表达，而丙糖磷酸异构酶的两个突变体Metl4Gln和Arg98Gln 却在37℃下形成没有活性的包涵体，在28℃下才获得可溶表达．在某些情况下，不同的培养温度都能表达可溶性蛋白，但是降低培养温度具有3个优势：首先，低温下培养基中的氧气溶解性更高，高密度培养时，能有效防止菌体厌氧生长，防止对菌体生长和外源蛋白表达有抑制作用的乙酸的生成；其次，低温培养时，抗生素的半衰期更长，质粒稳定性也可能会相应增加；最后，降低培养温度能降低可溶蛋白降解速率，提高可溶蛋白的稳定性．降低培养温度能提高外源蛋白可溶性的原因目前还没有满意的解释．不少研究人员认为，低温能降低蛋白质合成的速率，改变多肽折叠的动力学，从而导致正确折叠的蛋白增加．但是，蛋白表达速率与蛋白可溶性之间并不存在必然的联系．Schein等通过改变SD 序列与起始密码子ATG之间的距离来改变Mx蛋白合成的速率，发现该蛋白在37℃都会形成包涵体，而底物不足导致蛋白合成速率下降时，并不能获得外源蛋白可溶性表达量的增加．低温培养更有利于可溶性蛋白表达的另一个原因可能是外源蛋白在低温下表达时，蛋白区室化效率更，也可能在较低温度下，与蛋白折叠和蛋白聚合相关的蛋白的表达更有利于菌体形成稳定的可溶性蛋白．3．2培养基的组成培养基的组成对可溶外源蛋白的表达有显著影响．由于复合培养基成分复杂，在发酵过程中很难准确分析哪些成分对菌体细胞生长和蛋白表达有重要影响，所以一般推荐使用合成培养基．但合成培养基往往又存在菌体生长较慢和菌体浓度较低的问题，因此研究人员为此做了许多卓有成效的工作．一般来讲，在表达外源蛋白时，要尽量避免由于营养物质缺乏导致的菌体生长抑制的情况发生．外源蛋白的表达显著地受葡萄糖浓度的影响，虽然葡萄糖比较适合作为菌体生长的碳源，但在诱导表达时期，需尽量保持低水平的葡萄糖．以甘油代替葡萄糖作为表达外源蛋白的碳源是解除葡萄糖效应的有效途径之一．在诱导时期，流加营养物质也有可能显著提高可溶蛋白的表达量．在某些情况下，向培养基中添加蛋白抑制剂也能提高可溶蛋白量．Palva等在培养基中添加蛋白酶抑制剂，对生产来自枯草杆菌的干扰素非常有效．Slabaugh将核苷酸还原酶抑制剂羟基脲添加到培养基中，发现核苷酸还原酶亚基vvR1量明显上升．如果外源蛋白在细胞周质表达，向培养基中添加适当浓度的某些非代谢性糖类(比如蔗糖也可能有利于可溶蛋白的表达．当外源蛋白在细胞质表达时，非代谢性糖类由于细胞膜的阻碍不能扩散到细胞质中，但这些糖类的存在会增加培养基的渗透压，进而导致细胞质内渗透压防护剂(比如甘氨酰一三甲铵乙内酯)的积累，这种渗透压保护剂与周质中的非代谢性糖类一样，能抑制细胞质中外源蛋白的聚合，从而提高可溶蛋白的表达水平．外源蛋白二硫键的形成是一个酶依赖性反应过程，向培养基中添加适量的金属离子，可能提高这些酶类的活性，因此也有可能增加可溶蛋白的表达量．某些外源蛋白的活性和稳定性与某些金属离子密切相关，因此向培养基中添加外源蛋白所需金属离子也可能提高蛋白的可溶性和稳定性．另外，良好的通气能有效降低培养基中对菌体表达蛋白有重要影响的CO2和乙酸的浓度，也有可能获得高产量的活性蛋白．在蛋白表达过程中，培养基的pH 值也会对可溶蛋白的表达产生重要影响，需要根据菌体和目的蛋白的特点选择合适的pH值．3．3诱导条件在大肠杆菌中表达可溶性外源蛋白时，诱导时机和诱导剂的用量必须严格控制．在摇瓶培养时，普遍认为在低菌体浓度下诱导比较合适，因为在低菌浓度下菌体处于对数生长期，生长活跃，有利于表达可溶性蛋白．然而，如果能保证合理的补料与充分的通气，在较高菌浓度下诱导也同样可能获得可溶蛋白的高效表达．工业上往往采用高菌浓度补料诱导制备大量可溶蛋白，比如纤维原细胞生长因子一皂角苷融合蛋白的生产就是采用补料方法达到A600=85的高菌浓度后，在30℃下用IPTG诱导表达，分离纯化后1 鲫单位可溶性丝毒素达到了2．2 mg／L．也可考虑在高菌浓度下低温诱导采用冷激启动子高效表达可溶性蛋白．诱导剂种类及其浓度都会对外源蛋白表达产生重要影响，应根据所采用的表达系统(比如启动子的强弱)和外源蛋白的特点优化选择在某些情况下，诱导剂的流加能显著提高可溶蛋白的表达水平．Saraswat等以乳糖流加诱导的方式表达重组人白细胞介素一，发现乳糖流加诱导的可溶重组人白细胞介素一2的表达水平(9．3 g／L)显著高于一次性乳糖流加诱导的表达水平(5．4 g／L)．4 通过改变蛋白结构增加可溶性自从包涵体被发现以来，其形成原因一直是研究人员探讨的焦点，实现外源蛋白的可溶性表达也依赖于对该问题的解答．降低培养温度并不能促进所有外源蛋白的可溶性表达，人们也无法解释42℃时某些外源蛋白完全可溶的情况，而对这些蛋白进行定点突变却能在所有温度下获得可溶性表达．值得注意的是，虽然定点突变可能增加外源蛋白的可溶性，但不能简单地将这种效应归因于蛋白疏水性和某些特定氨基酸含量的改变．这种可溶蛋白的增加也可能是突变后外源蛋白对蛋白降解的稳定性的增加或者与分子伴侣相互作用增强的次级效应所致．Murby等在大肠杆菌中表达人呼吸道合胞病毒主要糖蛋白的101个氨基酸片段时，将该片断的若干个苯丙氨酸残基进行了突变，发现病毒糖蛋白片段的溶解性和对蛋白酶的稳定性有了显著的提高，而且突变后的蛋白片段与原蛋白片段具有相同的抗原性和二级结构．定点突变还可能改变温度对蛋白可溶性的效应．需要引起注意的是，虽然可以通过突变导致蛋白降解的位点来提高外源蛋白对蛋白酶的稳定性，但是这种突变可能会对蛋白活性造成极大影响．目前，研究人员已经开始根据己知蛋白的结构和活性特征，利用计算机有针对性地对蛋白突变进行设计，大大地提高了获得具有高活性和高稳定性蛋白的效率和可能．5 结论与展望外源蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达是一个系统工程，其中包含许多环节，环环相扣，任何一个环节的瓶颈都会对可溶蛋白的表达效率产生不良影响．因此，需要在研究过程中积累经验，并及时汲取相关领域研究的最新进展，找出制约可溶蛋白表达的关键因素，以期做到“对症下药”和“有的放矢”．在过去的几十年里，人们对蛋白质体内折叠过程、包涵体形成机理的研究日益深入，基因工程手段也日臻成熟，使大量表达外源活性蛋白成为可能，各种生物活性蛋白需求的迅猛增长也促进了研究方法和技术手段的进步．毫无疑问，随着蛋白质折叠调节机制、蛋白质体内复性机理等方面的探索和经验积累，在大肠杆菌中可溶性表达外源蛋白的技术将会越来越成熟，成本也将逐渐降低，并最终造福整个人类社会。
![一种提高大肠杆菌中可溶性重组蛋白质表达水平的方法[发明专利]](https://uimg.taocdn.com/150f053b84254b35eefd34ee.webp)
专利名称：一种提高大肠杆菌中可溶性重组蛋白质表达水平的方法
专利类型：发明专利
发明人：闻崇炜,赵烨清,周慧莲,欧阳臻,王晓燕
申请号：CN201510516845.0
申请日：20150821
公开号：CN105087725A
公开日：
20151125
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种有效提高大肠杆菌中可溶性重组蛋白质表达水平的工艺方法，其步骤如下：将表达重组蛋白质的工程菌冻存液按0.1%比例接种到表达用新鲜LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜获得种子液，随后将种子液按照1%比例接种到表达用新鲜LB液体培养基中，37℃继续振荡培养至培养液OD达到预设诱导起点的75%～90%，然后将培养温度升高至40℃继续培养0.5～1.5hr，待培养液OD达预设诱导起点后，向培养液中添加诱导物，继续以37℃或者40℃振荡培养6hr，菌体内可以产生显著的可溶性重组蛋白质。
本发明简便有效，成本低廉，易于放大，适用于生物工程及基因工程中用大肠杆菌表达各种可溶性异源重组蛋白质。
申请人：江苏大学
地址：212013 江苏省镇江市京口区学府路301号
国籍：CN
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⼤肠杆菌表达系统与蛋⽩表达纯化8.⼤肠杆菌表达系统与蛋⽩表达纯化⼤肠杆菌表达系统遗传背景清楚，⽬的基因表达⽔平⾼，培养周期短，抗污染能⼒强等特点, 是分⼦⽣物学研究和⽣物技术产业化发展进程中的重要⼯具。
因此熟练掌握并运⽤⼤肠杆菌表达系统的基本原理和常规操作是对每⼀个研究⽣来说是⾮常必要的。
本章节介绍了实验室常⽤的⼤肠杆菌表达系统的构成特点，归纳了利⽤⼤肠杆菌表达系统纯化重组蛋⽩的基本流程和详细操作步骤，并且结合笔者的操作经验，总结了初学者在操作过程中可能遇到的问题和解决策略。
8.1⼤肠杆菌表达系统的选择与构建8.1.1表达载体的选择根据启动⼦的不同这些载体⼤致可以分为热诱导启动⼦，如λPL，cspA 等和另外⼀类就是⼴泛使⽤的IPTG诱导的启动⼦，如lac，trc，tac，T5/lac operator，T5/lac operator等。
根据表达蛋⽩质的类型可分为单纯表达载体和融合表达载体。
融合表达是在⽬标蛋⽩的N端或C端添加特殊的序列，以提⾼蛋⽩的可溶性，促进蛋⽩的正确折叠，实现⽬的蛋⽩的快速亲和纯化，或者实现⽬标蛋⽩的表达定位。
常⽤的⽤于亲和纯化融合标签包括 Poly-Arg，Poly-His, Strep-Tag Ⅱ，S-tag，MBP等。
其中His-Tag 和GST-Tag 是⽬前使⽤最多的。
His Tag ⼤多数是连续的六个His 融合于⽬标蛋⽩的N端或C端，通过His 与⾦属离⼦：Cu2+>Fe2+>Zn2+>Ni2+ 的螯合作⽤⽽实现亲和纯化，其中Ni2+是⽬前使⽤最⼴泛的。
His 标签具有较⼩的分⼦量，融合于⽬标蛋⽩的N端和C端不影响⽬标蛋⽩的活性，因此纯化过程多不需要去除。
⽬前常使⽤的表达载体主要是由Novagen 提供的pET 系列和Qiagen 公司提供的pQE 系列。
除了His 标签外，还原性⾕胱⽢肽S-转移酶是另⼀种实验室常⽤的融合标签。
它可以通过还原性⾕胱⽢肽琼脂糖亲和层析⽽快速纯化。
蛋白可溶表达与纯化的详细实验过程2010年02月27日星期六09:02丁香园chrispp作品。
一、证明目的蛋白有表达1、挑取一单菌落接种于含氨苄(Amp，终浓度为100g/mL)的3mL液体LB培养基中37℃，250rpm培养过夜。
2、将过夜培养菌液以1:100转接于含上述抗生素的100mL液体LB中，37℃，250rpm，3.5h （大量培养至OD600＝0.6左右）。
3、取出1mL菌液为未诱导的电泳对照，剩余培养液加入诱导物IPTG至终浓度为1mmol/L，继续振荡培养4h。
4、以未诱导菌液与IPTG诱导后菌液作对比，SDS-PAGE检测。
结果如下：图11:pET-32aA3未诱导，2:pET-32aA3未诱导，3:pET-32aA3诱导后，4:pET-32aA3诱导后二、表达的情况，是可溶还是沉淀1、将上述的37℃诱导菌液离心（4℃，12000g，5min），弃上清（LB培养液），沉淀重悬于0.9%NaCl溶液洗菌。
2、将重悬于0.9%NaCl的菌体溶液离心（4℃，12000g，5min），弃上清（0.9%NaCl洗菌液），得菌体，称菌体重量，重悬于8mL PBS（pH7.0）缓冲液，缓冲液用量根据50~100mg/mL的菌液终浓度。
3、超声破菌：冰浴条件下，超声波破碎大肠杆菌，超声设置如下功率：400W，工作：15s，间隔：45s，全程时间：30min（30次左右）以菌液由白变透明，且不粘稠为依据（少量菌液用液氮反复冻融7次以上效果也不错，而且简单，但是DNA 出来后会粘稠，可能加dna酶后会好些，那样好离心，我是用接近最高转速离心的（没加dan酶），不然分不开）4、将超声波破碎的菌液离心（4℃，12000g，15min），分别收集上清和沉淀，各取1mL，加入1mL2×上样缓冲液，沸水浴10min，SDS-PAGE检测。
结果如下：图21:pET-32aA3诱导上清，2:pET-32aA3诱导沉淀三、探索可溶表达条件有上述实验结果可知，目标蛋白在上清也有表达，即存在可溶性的表达，但是量很少，大部分也包涵体的形式存在（沉淀中），而包涵体的存在也证明了蛋白表达量很高，上清可溶蛋白的可操作性等因素都优于对包涵体蛋白的分离纯化，所以可通过探索可溶表达条件，最终来加大上清蛋白的含量，以利于下一步实验的进行。
蛋白可溶表达与纯化的详细实验过程丁香园chrispp作品。
一、证明目的蛋白有表达1、挑取一单菌落接种于含氨苄(Amp，终浓度为100g/mL)的3mL液体LB培养基中37℃，250rpm培养过夜。
2、将过夜培养菌液以1:100转接于含上述抗生素的100mL液体LB 中，37℃，250rpm，3.5h（大量培养至OD600＝0.6左右）。
3、取出1 mL菌液为未诱导的电泳对照，剩余培养液加入诱导物IPTG至终浓度为1 mmol/L，继续振荡培养4h。
4、以未诱导菌液与IPTG诱导后菌液作对比，SDS-PAGE检测。
结果如下：图11: pET-32aA3未诱导，2: pET-32aA3未诱导，3: pET-32aA3诱导后，4: pET-32aA3诱导后二、表达的情况，是可溶还是沉淀1、将上述的37℃诱导菌液离心（4℃，12000g，5min），弃上清（LB培养液），沉淀重悬于0.9% NaCl 溶液洗菌。
2、将重悬于0.9% NaCl的菌体溶液离心（4℃，12000g，5min），弃上清（0.9% NaCl洗菌液），得菌体，称菌体重量，重悬于8mL PBS（pH 7.0）缓冲液，缓冲液用量根据50~100mg/mL的菌液终浓度。
3、超声破菌：冰浴条件下，超声波破碎大肠杆菌，超声设置如下功率：400W，工作：15s，间隔：45s，全程时间：30min（30次左右）以菌液由白变透明，且不粘稠为依据（少量菌液用液氮反复冻融7次以上效果也不错，而且简单，但是DNA出来后会粘稠，可能加dna 酶后会好些，那样好离心，我是用接近最高转速离心的（没加dan酶），不然分不开）4、将超声波破碎的菌液离心（4℃，12000g，15min），分别收集上清和沉淀，各取1mL，加入1mL 2×上样缓冲液，沸水浴10min，SDS-PAGE检测。
结果如下：图21: pET-32aA3诱导上清，2: pET-32aA3诱导沉淀三、探索可溶表达条件有上述实验结果可知，目标蛋白在上清也有表达，即存在可溶性的表达，但是量很少，大部分也包涵体的形式存在（沉淀中），而包涵体的存在也证明了蛋白表达量很高，上清可溶蛋白的可操作性等因素都优于对包涵体蛋白的分离纯化，所以可通过探索可溶表达条件，最终来加大上清蛋白的含量，以利于下一步实验的进行。
1.表达工程菌蛋白可溶性表达很大原因取决于二硫键和正确折叠的问题，所以选用利于二硫键形成的宿主菌，如Origami(DE3), Origami B(DE3),Rosetta Origami(DE3) 等更利于蛋白表达。
2.促溶标签前文的列表中已经详细列出，并简要介绍功能特点，值得注意的是选用促溶标签时，一定要考虑载体情况和表达工程菌的配合，如Trx标签主要是促进二硫键的配对，必须配合Origami(DE3)之类的工程菌使用，如果使用BL21(DE3)通常不会使目标蛋白的可溶性得到改善。
3.分子伴侣表达在表达工程菌内同时装入一个表达伴侣蛋白的表达质粒，表达伴侣蛋白的质粒必须与表达外源蛋白的质粒避免“质粒不相容性”。
目前，常用于大肠杆菌表达的分子伴侣主要是DNak(DnaJ,GrpE)和GroEL(GroES)等，科研人员可根据自己的实验需要构建合适的分子伴侣质粒，含分子伴侣质粒的感受态细胞已经有商业化的产品BL21(pG-KJE8、pGro7、pKJE7、pG-Tf2、pTf16)系列,实验人员可以根据具体情况选购。
4.启动子选择载体的启动子对于可溶性表达影响至关重要，pET系列的 T7/T7 lac为强启动子，强启动子在提高蛋白产量的同时也增强了包涵体的形成，如果遇到此种情况可以考虑换用弱启动子的载体，如pGEX系列，还可选择含cspA启动子的pCold系列载体。
5.分泌性表达将外源目标蛋白分泌表达到培养基中，实现这个功能需要将原核蛋白信号肽序列加到外源蛋白的上游即可；目前，福因德生物已经开发出pFRD-pelB系列载体，可以帮助实现在大肠杆菌中分泌表达。
6.培养条件的优化最常用的优化条件为：诱导温度、诱导剂浓度和诱导时间；还可以优化培养基的营养成分和离子物质，比如，我们使用营养成分稍低的LB培养基，可同时向培养基中添加葡萄糖，镁离子、氯化钠、硫酸铵等盐离子。
1）低温诱导:比如20℃,低温情况下,转录和翻译变慢,蛋白质浓度低,有更多的时间正确折叠；2）向培养基中加入0.4M蔗糖，高渗引起了渗透性休克反应，该反应增加了细胞内谷氨酸、脯氨酸和海藻糖的水平，为蛋白的正确折叠提供了环境；3）42℃短暂热休克，然后降温到20℃：热休克增加了DnaK/J和GroEL/ES的水平，通常的程序是37℃培养到A600nm=0.5,然后快速升温到42℃维持15min左右，然后降到20℃并诱导蛋白的表达。
1 表达系统的选择对于一个表达实验，选择何种表达系统应根据实际需要来决定，如表达蛋白的需求量、用途、实验所需时间及对细胞的毒性。
选定表达系统之后，还需考虑表达载体与宿主细胞的合理搭配问题：比如若以BHl/VP16为宿主细胞，则表达载体最好选用HSV早期启动子驱动目的基因的表达，因为该启动子受VP16的转录激活；LCR元件只有在红系细胞中才有消除整合位点的位置效应的功能，因此如果要发挥载体中LCR的功能，则可考虑选择IVlEL-E9细胞；在肝细胞中CMV启动子活性低，此时可考虑选用其它的启动子；使用附加体型表达载体时，应选择其对应的复制允许细胞，等等。
哺乳动物细胞表达系统中，重组蛋白的表达水平与许多因素相关，如转录和翻译调控元件、RNA剪接过程、mRNA稳定性、基因在染色体上的整合位点、重组蛋白对细胞的毒性作用以及宿主细胞的遗传特性等；而且某些理论上可信的设计在实验中不一定可行，比如含LCr{的载体在MEI，．E9细胞中有时并不能消除整合位点的位置效应嗍，外源基因在染色体高活性位点的定点整合也不一定能获得高表达御，等等。
因此如果需获得一个基因的高表达。
最好多试用几种不同的载体及宿主细胞。
2 提高蛋白表达产量的措施哺乳动物细胞对培养环境十分敏感，营养和生长因子缺乏、缺氧、病毒感染、毒性代谢物的积累、机械搅动以及培养压力的增加等很多固素都可诱导细胞凋亡。
大量细胞的死亡严重影响蛋白的表达产量。
现已证实，有些基因能抑制细胞凋亡，如Bcl-12和BcI-x能抑制许多因素诱发的细胞凋亡，以及某肿瘤细胞从贴壁培养转入悬浮培养而诱发的细胆凋亡。
A1ison等报道，感染dSsV CAT病毒载体的BHK Bcl-12和CHO BcI-x细胞生存期均延长数倍。
BHK Bel 2、HHK BcI-x均使感染SFV II l!的细胞恢复生长到对数生长期的细胞感染后可存活达9 d，LL12的产量提高一倍。
有些化学制剂也能抑制不同阶段的细胞凋亡，如乙酰半胱氨酸tNAC、吡咯烷二硫氨基甲酸酯（PDTC)等以及caspase抑制剂Z-VAD fmk、YVAD，cmk等，从而大大增加表达蛋白的产量。
